Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic. Nossa aplicação da imagem latente do lapso de tempo permite que o usuário identifique pilhas em vários estágios do mitosis, controle e identifique defeitos mitotic, e analise a dinâmica do eixo e o Fate mitotic da pilha em cima da exposição às drogas antimitotic.
Abstract
A imagem latente do tempo-lapso da pilha viva é uma ferramenta importante na biologia da pilha que fornece a introspecção em processos celulares que poderiam de outra maneira ser negligenciados, incompreendido, ou interpretado mal pela análise da fixo-pilha. Embora a imagem e a análise de células fixas sejam robustas e suficientes para observar o estado estacionário celular, ela pode ser limitada na definição de uma ordem temporal de eventos no nível celular e está mal equipada para avaliar a natureza transitória dos processos dinâmicos, incluindo progressão mitótica. Ao contrário, a imagem latente viva da pilha é uma ferramenta eloqüente que possa ser usada para observar processos celulares a nível da único-pilha sobre o tempo e tem a capacidade capturar a dinâmica dos processos que seriam representados de outra maneira mal na imagem latente fixa da pilha. Aqui nós descrevemos uma aproximação para gerar as pilhas que carregam marcadores cDNAs etiquetados da cromatina e dos microtúbulos e seu uso em aproximações da imagem latente da pilha viva para monitorar o alinhamento do cromossoma da metafase e a saída mitotic. Nós descrevemos técnicas Imaging-Based para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic, incluindo a identificação das pilhas em vários estágios no mitosis, na identificação e no seguimento de defeitos mitotic, e na análise da dinâmica do eixo e destino de células mitóticas após o tratamento com inibidores mitóticos.
Introduction
A análise baseada em imagem de células fixas é comumente usada para avaliar as alterações de nível populacional de células em resposta a várias perturbações. Quando combinado com a sincronização de células, seguido pela coleta e imagem de pontos de tempo serial, essas abordagens podem ser usadas para sugerir uma seqüência de eventos celular. Não obstante, a imagem latente fixa da pilha é limitada que as relações temporais estão implícitas para uma população e não demonstrada a nível de pilhas individuais. Desta maneira, quando a imagem latente e a análise fixas da pilha forem suficientes observar fenótipos robustos e mudanças do estado estacionário, a habilidade de detectar mudanças transientes sobre o tempo e as mudanças que impactam somente um subpopulação das pilhas são imperfeitas. Ao contrário, a imagem latente viva da pilha é uma ferramenta eloqüente que possa ser usada para observar processos celulares e subcellular dentro de uma única pilha, ou população celular, sobre o tempo e sem a ajuda de aproximações da sincronização que podem eles mesmos impactar o comportamento celular 1. º , 2. º , 3. º , 4. º , 5. º , a 6.
A formação de um eixo mitotic bipolar é essencial para a segregação apropriada do cromossoma durante a divisão da pilha, tendo por resultado duas pilhas genetically idênticas da filha. Os defeitos na estrutura mitotic do eixo que corromper a progressão mitotic e comprometer a fidelidade da segregação do cromossoma podem conduzir às divisões de pilha catastróficas e à viabilidade reduzida da pilha. Por esta razão, os venenos mitóticos que alteram a formação do fuso são terapêuticas promissoras para limitar a rápida proliferação das células cancerosas7,8,9. Não obstante, a análise fixa da pilha da estrutura do eixo que segue a adição de venenos mitotic é limitada em sua habilidade de avaliar o processo dinâmico da formação do eixo e não pode indicar se as mudanças observadas na estrutura do eixo são permanentes ou são em vez transiente e pode ser superado para permitir a divisão celular bem-sucedida.
Neste protocolo, nós descrevemos uma aproximação para avaliar a dinâmica do mitose que segue perturbações do eixo pela imagem latente viva da pilha. Usando o hTERT imortalized RPE-1 linha celular projetada para expressar um RFP-Tagged histona 2B para visualizar a cromatina, juntamente com um EGFP-Tagged α-tubulin para visualizar microtúbulos, o sincronismo do alinhamento do cromossomo metafase, início da anaphase, e, finalmente, o Fate da pilha mitotic é avaliado usando indicações visuais do movimento do cromossoma, da compactação, e da morfologia nuclear.
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Protocol
1. geração de células hTERT-RPE-1 que expressam estavelmente RFP-histona 2B (RFP-H2B) e α-tubulina-EGFP (Tub-EGFP)
Nota: todas as etapas seguem técnicas assépticas e acontecem em um gabinete de segurança de nível II + (BSL2 +) de biosseguridade.
- Gerar retrovírus carregando os genes do interesse (α-tubulin-EGFP e RFP-H2B) pelo transfection de 293T pilhas com os plasmídeos lentivirais apropriados de acordo com as instruções do fabricante do sistema lipídico-baseado da entrega do transfection.
- Dia 1: utilize uma pipeta Pasteur de vidro descartável para aspirar o meio de cultura celular a partir de uma placa de células de 293T subconfluentes e lave o meio residual com solução salina tamponada com fosfato (PBS) adicionando 5 mL de PBS. Redemoinho para distribuir PBS sobre o fundo da placa, em seguida, aspirar o PBS com uma pipeta de vidro estéril descartável Pasteur.
- Adicionar 2 mL de 0, 5% de tripsina que foi pré-aquecido a 37 ° c e devolver a placa a uma incubadora humidificada a 37 ° c com 5% de CO2 para 2 a 5 min para permitir que as células aderentes sejam libertadas da superfície do prato de cultura celular.
- Adicione 8 mL de meio de águia modificada de Dulbecco fresco (DMEM) suplementado com o soro bovino fetal de 10% (FBS) e a penicilina/estreptomicina de 1% à placa que contem o Trypsin.
- Ressuscitar as células introduzindo suavemente a pipetagem e transfira a suspensão para um tubo cônico estéril de 15 mL. Coloque o tubo cônico em uma centrífuga equilibrada e gire em 161 x g por 5 min à temperatura ambiente para gentilmente pellet as células.
- Aspirar a solução de médio/tripsina a partir de células peletizadas e células de ressuscição em 10 mL de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. Use um hemocitômetro para contar a suspensão da pilha 293T e a placa 2 x 106 293T pilhas por o poço de uma placa de 6 poços.
- Células de cultura em um volume total de 2 mL do meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina e manter em uma incubadora humidificada a 37 ° c com 5% CO2.
- Dia 2: Pipetam 7 μL de reagente de parto com base em lipídios e 100 μL de meio sérico reduzido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e permitem incubar à temperatura ambiente durante 5 min (tubo #1).
- Num tubo de microcentrifugação separado de 1,5 mL, pipetam 1 μg de vetor de expressão RFP-H2B (ou 1 μg de vetor de expressão α-tubulina-EGFP), juntamente com 5 μL de reagente potenciador (conforme exigido por directrizes do fabricante), 0,5 μg pMD2. G e 1 μg psPAX2 e 100 μL de redução médio sérico (tubo #2).
- Combine o conteúdo da etapa 1.1.7 e etapa 1.1.8 por pipetagem cuidadosamente #2 tubo em #1 de tubo e incubar por 20 min à temperatura ambiente.
Nota: a reacção pode ser dimensionada conforme necessário para a transfecção de células em poços adicionais. - Pipeta a reação do transfection gota gota ao poço desejado que contem as pilhas 293T em 2 ml do meio e retornam o prato à incubadora humidificada no ° c 37 com 5% co2.
Nota: para gerar células expressando RFP-H2B e α-tubulin-EGFP, gere vírus separados para cada construção de expressão (etapas 1.1.7-1.1.9). - Dia 3: aspirar e substituir o meio com 2 mL de DMEM fresco suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. Devolva o prato à incubadora humidificada a 37 ° c com 5% de CO2.
- Dia 4: colete o meio contendo partículas de vírus expressas, sendo cauteloso para não interromper ou remover células de 293T. Filtre o meio contendo partículas de vírus passando-o através de um filtro de 0,45 μM anexado a uma seringa de 5 mL. Vírus alíquota para armazenamento a curto prazo a 4 ° c, ou armazenamento de longo prazo a-80 ° c.
Nota: as partículas virais obtidas desta forma estarão presentes em uma faixa de ~ 1 x 107 a 1 x 108 unidades de Transviação/ml. Como as células e células produtoras de virais a serem infectadas são cultivadas no mesmo meio, a concentração viral para substituir o meio não é necessária e as partículas virais filtradas podem ser usadas diretamente para infectar as células. - Sementes 2 x 105 htert-RPE-1 células por poço de um prato de 6 poços em preparação para a infecção viral. Células de cultura em 2 mL de DMEM suplementados com 10% FBS e 1% de penicilina/estreptomicina e manter em uma incubadora humidificada a 37 ° c com 5% CO2.
- Dia 5: Adicione o brometo de hexadimethrine (por exemplo, Polybrene) às pilhas de hTERT-RPE-1 a uma concentração final de 8 μg/mL. Infectar células com uma mistura de 500 μL de vírus diluído em 500 μL de meio de cultura celular.
Nota: a solução de brometo de Hexadimethrine é preparada em água destilada estéril, depois filtrada através de um filtro de 0,45 μm. - Dia 6: usando uma pipeta de vidro descartável de Pasteur, aspirar o meio dos poços que contêm as pilhas contaminadas vírus. Substitua o meio de cultura celular por 2 mL de DMEM contendo 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina e concentrações apropriadas de antibiótico para selecionar para a integração e expressão do plasmídeo.
Nota: o plasmídeo de expressão α-tubulina-EGFP utilizado nos experimentos descritos traz um gene de resistência à puromicina e o plasmídeo da expressão RFP-H2B carrega um gene de resistência à blasticidina. Portanto, 10 μg/mL de puromicina e 2 μg/mL de blasticidina são usados para a seleção de α-tubulina-EGFP, RFP-H2B expressando células hTERT RPE-1. As concentrações de antibióticos utilizadas para a seleção podem diferir para várias linhas celulares utilizadas. - Manter as células seleção antibiótica por 5-7 dias, substituindo o meio a cada 3 dias com meio fresco contendo reagentes de seleção apropriados.
Nota: as células devem ser mantidas na subconfluência durante a seleção e devem ser expandidas conforme necessário, conforme descrito nas etapas 1.1.1 a 1.1.4. - Use a imagem latente da imunofluorescência para confirmar a expressão de construções etiquetadas.
Observação: se desejado, os clones de célula única podem ser derivados para obter níveis de expressão uniforme dentro da população de células. Uma vez que os clones estáveis são confirmados, as pilhas podem ser mantidas as condições padrão da cultura na ausência de seleção antibiótica.
2. preparação de células para imagens de células ao vivo após perturbações do fuso mitótico
Nota: Use técnicas assépticas e execute as etapas em um armário de segurança BSL2.
- Usando uma pipeta de vidro estéril descartável de Pasteur, aspirar o meio da placa da cultura que contem a linha de pilha que carreg a construção da expressão (s) (da etapa 1,7). Lave brevemente as células com 10 mL de PBS estéril. Redemoinho para distribuir PBS sobre o fundo da placa, em seguida, aspirar PBS com uma pipeta Pasteur estéril de vidro descartável.
- Adicione 2 mL de 0, 5% de tripsina à placa de 10 cm. Incubar a placa a 37 ° c por 2-5 min ou até que as células se separem da superfície da chapa.
- Adicionar 8 mL de meio fresco à placa contendo tripsina. Ressuscitar as células introduzindo suavemente a pipetagem e transfira a suspensão para um tubo cônico estéril de 15 mL. Coloque o tubo cônico em uma centrífuga equilibrada e gire em 161 x g por 5 min à temperatura ambiente para gentilmente pellet as células.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuscitar em 10 mL de PBS pipetando suavemente com uma pipeta serológica de 10 mL. Coloque o tubo cônico em uma centrífuga equilibrada e gire em 161 x g por 5 min à temperatura ambiente para gentilmente pellet as células.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuscitar em 10 mL do meio fresco pipetando suavemente com uma pipeta serológica de 10 mL.
- Contagem de células, em seguida, calcular o número da célula usando um hemacitômetro e diluir para uma concentração de 1-2 x 105 células/ml no meio de cultura celular. Semente 500 μL da suspensão da pilha a cada poço de uma placa inferior estéril da imagem latente de 12 poços. Coloc a placa na incubadora da cultura da pilha e permita que as pilhas aderem à superfície da placa.
Nota: a imagem latente da pilha viva exige que as pilhas sejam well-adered de modo que permaneçam associadas com o plano da imagem latente durante a aquisição de imagens. A duração do tempo necessário para as células aderirem após o chapeamento pode diferir de uma linha de célula para a próxima e deve ser otimizada para a linha de célula em estudo. - Até 30 minutos antes de iniciar a imagem latente do lapso de tempo, adicione uma concentração relevante de uma droga mitotic a um ou mais dos poços semeados com pilhas. Para dar conta do potencial impacto do solvente orgânico no comportamento celular, adicione um volume igual do diluente do inibidor às células como controles. Por exemplo, assegure-se de que a adição de 100 nM do inibidor específico da quinase mitótica Aurora A (por exemplo, alisertib) seja paralelizadas com um volume igual de DMSO, o diluente para esta droga, em um poço de controle das células.
Nota: a análise comparativa das alterações dinâmicas na progressão mitótica requer que os poços de células sejam preparados na ausência de perturbações para possibilitar a imagem de mitoses normais em paralelo às condições experimentais.
3. microscópio ajustado para a imagem latente do tempo-lapso de RFP-H2B, α-tubulin-GFP que expressa pilhas (Figura 1, Figura 2)
- Coloque a placa de cultura celular contendo RFP-H2B, α-tubulin-GFP expressando células hTERT RPE-1 para serem fotografadas em uma pastilha de estágio apropriada em um microscópio de epifluorescência invertido que está equipado com uma câmera de alta resolução (tamanho de pixel de 0,67 μm a 20x), um câmara ambiental pré-aquecida a 37 ° c, e um sistema de entrega para umidificado 5% co2.
Nota: as câmaras ambientais incluidas ou as inserções controladas temperatura do estágio podem ser apropriadas fornecidas humidificada 5% CO2 pode ser entregado e o controle de temperatura estável obtido. - Use um objetivo do ar 20x com uma abertura numérica de 0,5 e equipado para a fluorescência do contraste elevado e a imagem latente do contraste ou do brightfield da fase. Ver células com o contraste de fase ou brightfield e ajustar o curso e o foco fino no microscópio para trazer as células em foco.
- Identifique e defina os tempos de exposição ideais para a aquisição de imagens brightfield, GFP e RFP selecionando o respectivo cubo de filtro com excitação e emissão apropriadas para os fluoróforos que serão fotografados. Alternativamente, clique no botão de exposição automática para introduzir um tempo de exposição predeterminado. Se o sinal não for suficientemente intenso, selecione binning de pixel para permitir tempos de exposição mais curtos, clicando na guia binning e selecionando 2 x 2 pixel binning no menu suspenso.
Nota: a fototoxicidade pode prejudicar a progressão mitótica e a viabilidade celular. A falha de pilhas mitotic em populações do controle para terminar mitoses normais pode ser uma indicação que os tempos da exposição e/ou a duração da imagem latente precisam de ser aperfeiçoados mais mais. - Use um software de aquisição e análise que permita a aquisição simultânea de imagens multicoordenadas e multipoços e defina os parâmetros para a obtenção da imagem.
- Selecione e calibre o estágio do microscópio ao prato do multi-poço, de acordo com as instruções do fabricante. Use o software de aquisição de imagem para destacar ou de outra forma selecionar os poços que serão fotografados clicando nos poços relevantes no diagrama do formato da placa que está sendo usado.
- o painel de controle de Generatedpoints (Figura 2), defina as coordenadas dentro de cada poço que será imaged estalando na aba da colocação do ponto e selecionando o posicionamento predefinido ou aleatório da coordenada de no menu suspenso. Selecione a guia área de trabalho e selecione restrito no menu suspenso para restringir a área de seleção de coordenadas para excluir os limites do poço. Clique nas guias contagem e distribuição para selecionar o número e a distribuição de pontos a serem capturados por poço, respectivamente.
Nota: o número de coordenadas que podem ser imaged por bem dentro do incremento de 5 minutos do ponto de tempo será limitado pelo número de poços a ser imaged, assim como o tempo de exposição para cada canaleta. Tipicamente, 5-8 coordenadas por poço são suficientes para observar pelo menos 50 células em cada condição progridem através de mitose dentro de 4 h. - Selecione e insira o intervalo de tempo e a duração para coletar imagens clicando em e inserindo os valores no painel de controle Timesequence .
Nota: a aquisição de imagens a cada 1 a 5 minutos é apropriada para monitorar a dinâmica da progressão mitótica. A duração geral da imagem deve refletir o ponto de extremidade desejado e a taxa de proliferação da linha celular. Por exemplo, 4 horas é suficiente para ver muitas células progridem através de mitose, 16 horas é suficiente para ver a maioria das células RPE-1 em um progresso de população assíncrona através de mitose.
4. análise da imagem do tempo-lapso para determinar o sincronismo da metafase e o Fate mitotic da pilha que segue perturbações mitotic do eixo
Nota: executar a análise de imagem usando um software de aquisição de imagem (tabela de materiais), ImageJ, ou software de análise de imagem comparável.
- Visualize a cromatina rotulada RFP-H2B selecionando as imagens capturadas com o cubo do filtro RFP no lugar. Identifique uma célula entrando em mitose, conforme indicado pela compactação inicial da cromatina (Figura 2C, seta azul) e quebra de envelope nuclear (quando α-tubulin-EGFP não é mais excluído pelo limite nuclear).
- Determine o sincronismo mitotic do alinhamento da metafase e do início do anaphase em pilhas individuais: acompanhe a célula através dos temporais consecutivos no filme adquirido para determinar o número de pontos temporais/minutos da entrada mitotic até a cromatina rotulada por RFP-H2B completa o alinhamento no Equador da célula durante a metafase (Figura 2C, Arrowhead amarelo).
- Para monitorar o sincronismo mitotic, a fidelidade mitotic, e o Fate da pilha, continue a seguir a pilha com os temporais consecutivos para identificar a coordenada do tempo em que a segregação do cromossoma do anaphase é aparente (Figura 2C, Arrowhead branco) e/ou onde ocorreu a descompactação da cromatina e a reformação de envelope nuclear (como indicado pela exclusão de tubulina do núcleo).
Nota: as perturbações no conjunto do eixo ou progressão mitótica podem ser avaliadas em função do tempo necessário para obter um fuso mitótico bipolar e alcançar o alinhamento total do cromossomo, ou para completar a segregação do cromossomo anaphase. - Visualize o RFP-H2B para identificar células em cada população que apresentem defeitos mitóticos, incluindo pontes de cromossomos e cromatina durante a segregação do cromossomo anaphase.
Nota: a fidelidade mitótica comprometida também pode resultar em células filhas multinucleadas ou micronucleadas e pode ser visualizada nas células após a saída mitótica, como na Figura 3.
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Representative Results
Avaliação da progressão mitótica na presença de perturbações do fuso
O Regulamento do pólo do eixo que focalizando é uma etapa essencial na formação bipolar apropriada do eixo. Rompimento nesse processo por meio de depleções de proteínas, inibição de fármacos ou alterações no número centrosome corromper a estrutura do fuso e atrasar ou interromper a progressão mitótica10,11,12,13. Não obstante, algumas perturbações somente transientemente atrasam a formação do eixo com as pilhas que seguem finalmente com o mitose para terminar a segregação14do cromossoma do anaphase. Na ausência de aproximações da sincronização dapilha, quepodem eles mesmos indiretamente impactar processos mitotic1,2, aspilhas progridem com o mitose assincronamente (Figura 2C). Usando RFP-H2B para identificar a cromatina, as células mitóticas com cromatina compacta podem ser encenadas como estando na prometafase (aquelas antes do alinhamento completo da metafase: Figura 2C, pontas de seta azuis), metafase (alinhamento completo do cromossoma: Figura 2 C, pontas de seta amarelas) e anaphase (cromossomas sendo segregados para pólos do eixo: Figura 2C, pontas de seta brancas). A captação de 5-8 coordenadas sobre 4 h é suficiente para seguir a progressão de pelo menos 50 células através da mitose em uma determinada condição. Para investigar a dinâmica da montagem do fuso após alterações no número centrosome e/ou inibição da Aurora A quinase, um importante regulador do pólo do eixo com foco14,15,16, 17, nós usamos a imagem latente viva do tempo-lapso da pilha de pilhas humanas com 2 centrosomes, ou aqueles que contêm centrosomes supernumerary. As células foram cultivadas na presença ou ausência do inibidor da quinase de Aurora a antes do início da imagem. As células com 2 centrossomos experimentam o rompimento na progressão mitótica quando tratadas com Aurora um inibidor da quinase, mas são finalmente capazes de alcançar o alinhamento do cromossoma da metafase (Figura 2C, Arrowhead amarelo). Em contraste, as células com > 2 centrossomos são primorosamente sensíveis à inibição de Aurora a e exibem um aumento nas células da prometafase e uma ausência de células da metafase, indicando um atraso no conjunto do eixo e progressão mitótica.
A Figura 3 demonstra que essas abordagens de imagem de lapso de tempo são suficientes para monitorar o conjunto do eixo e a fidelidade mitótica. Ao Visualizar α-tubulin-EGFP, observou-se que as células que experimentam o rompimento do fuso (mostrada aqui devido à sobreduplicação centrosome) passam por mudanças dinâmicas à medida que o foco do pólo do eixo é atingido e um eixo mitótico bipolar é formado em preparação para divisão celular. Simultâneo com o conjunto do eixo, o movimento do cromossoma pode ser visualizado com RFP-H2B para avaliar o alinhamento do cromossoma e a fidelidade da segregação. As células mitóticas que experimentam a multipolaridade transitória do eixo são suscetíveis a erros de fixação que resultam em cromossomas retardamento durante a anaphase e formam micronúcleos na fase G1 subseqüente do ciclo celular. Tais defeitos são aparentes com estas aproximações da imagem latente da pilha viva.
Alterações na progressão dinâmica da mitose alteram o tempo mitótico e afetam o destino da célula mitótica
Após a avaria do envelope nuclear, a formação do eixo e o movimento cromossômico podem ser rastreados através dos estágios de mitose para avaliar a progressão mitótica, duração e o destino das células que progridem para a anaphase. A amplificação centrosome, característica comum em muitos tipos de câncer, caracteriza-se pela presença de centrosomas extras e formação multipolar do fuso18,19,20. Como as divisões multipolares resultam em células filhas altamente aneuploides e provavelmente inviáveis, as células cancerosas ativamente aglomeram centrossomos extra para formar um eixo bipolar e passam por uma divisão bipolar5,20,21, 22,23,24. Usando abordagens de imagens de células ao vivo, nossos resultados representativos mostram que as células com um conteúdo centrosome normal são capazes de proceder de colapso do envelope nuclear através do alinhamento da metafase e início da anaphase para alcançar uma divisão bipolar em menos de 30 minutos ( Figura 4 A, D, E). Na presença de centrosomes extra, quase 50% das células conseguem superar um fuso mitótico multipolar transitório e formar um fuso bipolar e uma divisão celular completa (Figura 4C, D). As células restantes são incapazes de atingir um fuso bipolar e como resultado a mitose de saída através de uma divisão multipolar (Figura 4B, D). Não obstante se a bipolaridade do eixo é conseguida, as pilhas com centrossomos extra exibem uma duração significativamente aumentada da mitose comparada às pilhas com 2 centrossomos, indicando que a dinâmica da progressão mitotic pode ser alterada mesmo quando as mudanças no o desfecho mitótico não é aparente (Figura 4E).
Figura 1: seleção dos parâmetros do microscópio e da câmera. (A) representação da janela para selecionar o objetivo desejado e o cubo de filtro apropriado usando um software de aquisição de imagem. Mostrado é a seleção do objetivo da ampliação 20x e do cubo do filtro do brightfield. (B) as células na placa de amostra são encontradas e trazidas em foco usando o brightfield ou a microscopia de contraste de fase. (C) representação da janela para definir os parâmetros de exposição para cada captura de imagem. A binning de pixel pode ser usada, se necessário, para conseguir reduzir o tempo de exposição por captura e minimizar a foto-dano às células. A barra de escala é 10 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: captação de imagem e análise de microscopia de lapso temporal. (A e B) representação da janela que indica como os parâmetros de aquisição de imagem são definidos usando NIS Elements HCA empregos imagem aquisição de software. Este software permite multi-coordenar, multi-bem imagem ao longo do tempo. Cada trabalho pode ser modificado para especificar poços e coordenadas a serem capturadas. (C) intervalos de tempo únicos de quatro condições de um experimento. RFP-H2B é usado para rastrear a cromatina. A compactação e o posicionamento da cromatina são usados para identificar diferentes estágios de mitose: Prometaphase (compactação na ausência de alinhamento cromossômico, seta azul), metafase (alinhamento total do cromossomo no Equador da célula, seta amarela) e Anaphase (após a iniciação da segregação synchronous do cromossoma, Arrowhead branco). A barra de escala é de 10 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: a imagem latente do lapso de tempo visualiza defeitos na fidelidade mitotic. As pilhas que contêm os eixos multipolar do formulário dos centrossomos extra e aglomeram-nas frequentemente em um eixo bipolar antes de terminar a divisão da pilha. Aqui, uma célula entra em mitose com sete pólos distintos do eixo (asteriscos brancos) que, ao longo do tempo, são agrupados em dois pólos principais do eixo. Neste ponto, os cromossomas são capazes de alinhar ao longo do Equador do eixo, e a célula prossegue para a anaphase. A multipolaridade transitória permitiu uma ligação mal de um único cromossoma. Este erro não resolvido resulta em um cromossomo retardamento durante a anaphase que se torna incorporado em um micronúcleo em uma célula filha (rotulada com uma seta). A cromatina é visualizada com RFP-histona 2B e os microtúbulos são visualizados com α-tubulina-EGFP. Os selos de tempo em cada painel indicam minutos com relação à avaria aparente do envelope nuclear como julgado pela deteção do tubulina dentro do limite nuclear. A barra da escala é 5 μm. please estale aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: alterações na progressão dinâmica da mitose alteram o tempo mitótico e afetam o destino da célula mitótica. O RFP-H2B, mostrado em vermelho, é usado para rastrear o movimento da cromatina e a α-tubulina-GFP, mostrada em verde, é usada para monitorar o número e a organização do pólo centrosome/Spindle. A perda da exclusão do GFP-tubulin do núcleo, concomitante com a compactação adiantada da cromatina é uma indicação que o envelope nuclear quebrou para baixo (NEB) na preparação para a divisão da pilha mitotic. A exclusão nuclear de GFP-tubulin é aparente em cima da saída mitotic e do reforma do envelope nuclear. (A) uma célula com dois centrossomos forma um eixo bipolar e progride através da anaphase para formar duas células filhas. (B e C) Células com centrosomas extra entram em mitose para formar um eixo multipolar. (B) algumas destas pilhas com o atraso extra dos centrossomos na mitose sem conseguir um eixo bipolar e o progresso para terminar a anaphase multipolar. (C) outras pilhas com os centrossomos extra exibem um atraso transiente na progressão mitotic quando aglomerarem centrossomos extra para permitir o anaphase bipolar. (D) células com centrosomas extra são capazes de sofrer uma divisão bipolar aproximadamente 50% do tempo, enquanto as células restantes com centrossomos extra passam por uma divisão multipolar. (E) as células com centrossomos extra aumentaram o sincronismo mitotic não obstante o destino mitotic eventual (anaphase bipolar ou multipolar). A barra da escala é 5 μm. please estale aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A resolução temporal fornecida pela imagem de lapso de tempo permite a visualização e avaliação de eventos celulares seqüenciais dentro de células individuais. Abordagens que fazem uso de sincronização celular seguido pela coleta e fixação de células em pontos de tempo seqüencial são limitadas em que as comparações são feitas em última análise entre as populações de células. Em contextos onde a resposta celular às perturbações pode ser não uniforme, ou onde o processo que está sendo visualizado é dinâmico, a imagem latente do tempo-lapso da pilha viva é melhor equipada para seguir e analisar a dinâmica de únicas pilhas, assim como a heterogeneidade dentro de uma população celular. Desta maneira, a imagem latente do tempo-lapso é particular útil em monitorar a progressão da pilha com os estágios dinâmicos do mitose e em avaliar como as perturbações a esta progressão impactam finalmente a fidelidade da divisão da pilha mitotic e do Fate subseqüente da pilha.
Embora haja uma série de vantagens para imagens de células ao vivo, são associados desafios significativos que devem ser considerados e atenuados quando possível. Um desafio é manter as condições ambientais apropriadas para garantir a viabilidade e proliferação celular durante a imagem. Para fazer isso, a criação de imagens deve incluir uma câmara ambiental que regula a temperatura e o CO2. Alternativamente, as células podem ser imaged para um curto prazo, com apenas regulação da temperatura, se feito isso em uma câmara fechada. Em ambos os casos, o uso de uma tabela antivibração e/ou abordagens baseadas em hardware para mitigar as flutuações de foco axial (por exemplo, o foco perfeito da Nikon) devem ser empregadas para manter o foco da placa durante toda a duração do experimento. Uma segunda preocupação significativa com imagens de células ao vivo é o potencial para fotodanos e fotobranqueamento. O fotobranqueamento é uma preocupação onde o fluoróforo que está sendo imaged diminui gradualmente na intensidade da fluorescência enquanto a imagem latente progride. No entanto, a exposição à luz de excitação de alta intensidade que resulta em fotobranqueamento também é tóxica para as células e o cuidado deve ser feito para minimizar a exposição celular, diminuindo os tempos de exposição, os intervalos de aquisição de imagem e a duração total da sequência de imagens 25. conseqüências de não otimizar as condições de imagem para minimizar a fototoxicidade podem incluir a geração de danos no DNA e outras alterações celulares que podem, por sua vez, comprometer a interpretação e a compreensão do experimento. Se a viabilidade celular se tornar uma preocupação com imagens a longo prazo, o esforço deve ser feito para utilizar binning pixel (para permitir exposições mais curtas) e aumentar a duração entre capturas de imagem subsequentes. Uma preocupação adicional é que a etiqueta fluorescente pode alterar o comportamento da proteína a que é fundido, ou que a integração da construção da expressão viral no genoma pode próprio impactar o comportamento celular. Para dar conta da possibilidade que a adição de uma etiqueta fluorescente pode impactar a função da proteína, uma avaliação da função da proteína que segue a adição de um tag fluorescente terminal de N ou de C e a comparação com a função não-etiquetada da proteína é necessária. Para determinar se os efeitos adversos sobre o comportamento celular surgem devido à perturbação do locus genómico em que a construção viral foi integrada, vários clones de células únicas devem ser derivados, em comparação com as células que não possuem a proteína marcada, e testadas para monitorar que a aptidão celular e a progressão mitotic não são perturbbed. Alternativamente, os efeitos fora do alvo da integração aleatória da construção da expressão viral podem ser atenuados através da integração direcionada da proteína de fusão no locus endógeno, ou outras regiões conhecidas do genoma, usando abordagens baseadas em CRISPR.
As aproximações para identificar e caracterizar reguladores principais da progressão mitotic confiaram pesadamente na imagem latente fixa da pilha. Os reguladores mitóticos identificados desta maneira foram explorados subseqüentemente na terapêutica que focam ràpida proliferating pilhas de cancro7,8,9. Entretanto, as drogas antimitótica não executam sempre uniformemente em cancros diferentes e em muitos casos a introspecção nos fenótipos mitotic que precedem as aproximações quimioterapêuticas bem sucedidas ou mal sucedidas permanece obscura. A imagem latente do tempo-lapso da pilha viva para controlar pilhas mitotic na presença e na ausência de drogas Spindle-perturbing tem o potencial fornecer a introspecção necessária para identificar aqueles moduladores mais prováveis conduzir às mitoses catastróficas e à viabilidade comprometida de células cancerosas com um impacto mínimo nas células normais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
DLM é apoiado por um NSF GRFP. O ALM é apoiado pelo financiamento do prêmio Smith Family de excelência em pesquisa biomédica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
