Summary
Her præsenterer vi en protokol til at vurdere dynamikken i spindel dannelse og mitotisk progression. Vores anvendelse af time-lapse Imaging gør det muligt for brugeren at identificere celler på forskellige stadier af mitose, spore og identificere mitotiske defekter, og analysere spindel dynamik og mitotiske celle skæbne ved udsættelse for anti-mitotiske lægemidler.
Abstract
Live Cell time-lapse Imaging er et vigtigt værktøj i cellebiologi, der giver indsigt i cellulære processer, der ellers kunne blive overset, misforstået, eller misfortolket af den faste celle analyse. Mens den faste celle afbildning og-analyse er robust og tilstrækkelig til at observere cellulær Steady-State, kan den begrænses ved at definere en tidsmæssig rækkefølge af hændelser på cellulært niveau og er dårligt rustet til at vurdere de dynamiske processers forbigående karakter, herunder mitotisk progression. I modsætning hertil er live Cell Imaging et veltalende værktøj, der kan bruges til at observere cellulære processer på enkelt celleniveau over tid og har kapacitet til at fange dynamikken i processer, der ellers ville være dårligt repræsenteret i faste celle billeder. Her beskriver vi en tilgang til at generere celler transporterer fluorescently mærkede markører af kromatin og microtubuler og deres anvendelse i levende celle Imaging tilgange til at overvåge Metaponto kromosom justering og mitotisk udgang. Vi beskriver Imaging-baserede teknikker til at vurdere dynamikken i spindel dannelse og mitotisk progression, herunder identifikation af celler på forskellige stadier i mitose, identifikation og sporing af mitotiske defekter, og analyse af spindel dynamik og mitotiske celle skæbne efter behandling med mitotiske hæmmere.
Introduction
Billedbaseret analyse af faste celler bruges almindeligvis til at vurdere celle populationsniveau ændringer som reaktion på forskellige perturbationer. Når det kombineres med celle synkronisering, efterfulgt af indsamling og billeddannelse af serielle tidspunkter, kan sådanne tilgange bruges til at foreslå en cellulær sekvens af begivenheder. Ikke desto mindre er faste celle billeder begrænset i, at tidsmæssige forhold er underforstået for en population og ikke påvist på niveauet af individuelle celler. På denne måde, mens fast celle billeddannelse og analyse er tilstrækkelig til at observere robuste fænotyper og Steady-State ændringer, evnen til at detektere forbigående ændringer over tid og ændringer, der påvirker kun en delpopulation af cellerne er ufuldkomment. I modsætning hertil er live Cell Imaging et veltalende værktøj, der kan bruges til at observere cellulære og subcellulære processer i en enkelt celle, eller cellulære befolkning, over tid og uden hjælp af synkronisering tilgange, der kan selv påvirke cellulære adfærd 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
Dannelsen af en bipolær mitotisk spindel er afgørende for den korrekte kromosom adskillelse under celledelingen, hvilket resulterer i to genetisk identiske datter celler. Defekter i mitotisk spindel struktur, der korrupte mitotiske progression og kompromittere trofasthed af kromosom segregation kan resultere i katastrofale celle divisioner og reduceret cellelevedygtighed. Af denne grund, mitotiske giftstoffer, der ændrer spindel dannelse er lovende Therapeutics at begrænse den hurtige spredning af kræftceller7,8,9. Ikke desto mindre er en fast celle analyse af spindel strukturen efter tilsætning af mitotiske gifte begrænset i dens evne til at vurdere den dynamiske proces med spindel dannelse og kan ikke indikere, om observerede ændringer i spindel strukturen er permanente eller i stedet forbigående og kan overvindes for at tillade succesfuld celledeling.
I denne protokol beskriver vi en tilgang til at vurdere dynamikken i mitose efter spindel forstyrrelser ved Live Cell Imaging. Ved hjælp af hTERT udødeliggjort rpe-1 cellelinje konstrueret til at udtrykke en RFP-Tagged histone 2b at visualisere kromatin, sammen med en egfp-Tagged α-Tubulin at visualisere microtubuler, timingen af Metaponto kromosom justering, anafylanindebut, og i sidste ende mitotiske celle skæbne vurderes ved hjælp af visuelle signaler af kromosom bevægelse, komprimering og nuklear morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generering af hTERT-rpe-1-celler, som stabilt udtrykker RFP-Histon 2b (RFP-H2B) og α-Tubulin-egfp (tub-egfp)
Bemærk: alle trin følger aseptiske teknikker og finder sted i et sikkerhedskabinet til biosikkerhedsniveau II + (BSL2 +).
- Generere retrovirus transporterer gener af interesse (α-Tubulin-egfp og RFP-H2B) ved transfektering af 293t celler med de relevante lentiviral plasmider i henhold til producentens anvisninger af lipid-baserede transfektering delivery system.
- Dag 1: Brug et engangs glas Pasteur-pipette til at aspirere cellekultur mediet fra en plade af sub-confluent 293T-celler, og skyl rest mediet med fosfat bufferet saltvand (PBS) ved at tilsætte 5 mL PBS. Drej for at fordele PBS over pladens bund, og Aspirér PBS med et sterilt engangs glas Pasteur-pipette.
- Der tilsættes 2 mL 0,05% trypsin, som er blevet forvarmet til 37 °C, og pladen returneres til en befuret inkubator ved 37 °C med 5% CO2 i 2 til 5 minutter for at tillade, at vedede celler frigives fra celle kulturens overflade.
- Der tilsættes 8 mL frisk Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin til pladen med trypsin.
- Resuspender cellerne ved forsigtigt at pipettere og overføre suspensionen til et sterilt 15 mL konisk rør. Placer det koniske rør i en balanceret centrifuge og spin ved 161 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for forsigtigt at pille cellerne.
- Mediet/trypsin-opløsningen aspireres fra pelleterede celler, og cellerne resuspenderes i 10 mL DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin. Brug en hemocytometer til at tælle 293T cellesuspension og plade 2 x 106 293t celler pr brønd af en 6 brønd plade.
- Kultur celler i et samlet volumen på 2 mL Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin og opretholdes i en befuret inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
- Dag 2: afpipettere 7 μl lipid-baseret transfektering-leverings reagens og 100 μl reduceret serum medium i et 1,5 ml mikrocentrifuge glas, og lad det inkubere ved stuetemperatur i 5 min (rør#1).
- I et separat 1,5 ml mikrocentrifuge glas afpipetteres 1 μg RFP-H2B-ekspressions vektor (eller 1 μg α-Tubulin-egfp-ekspressions vektor) sammen med 5 μl forstærker-reagens (efter fabrikantens anvisninger), 0,5 μg pMD2. G og 1 μg psPAX2 og 100 μl reduceret serum medium (tube #2).
- Kombiner indholdet af trin 1.1.7 og trin 1.1.8 ved omhyggeligt at pipettere rør#2 i rør#1 og inkubere i 20 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: reaktionen kan skaleres efter behov for transfektering af celler i yderligere brønde. - Afpipettere transftionsreaktionen dråbevis til den ønskede brønd indeholdende 293t celler i 2 ml medium og returnere skålen til den befugdede inkubator ved 37 °c med 5% Co2.
Bemærk: Hvis du vil generere celler, som udtrykker både RFP-H2B og α-Tubulin-EGFP, skal du generere separat virus for hvert udtryks konstruktion (trin 1.1.7-1.1.9). - Dag 3: Aspirer og Udskift mediet med 2 mL frisk DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin. Ret til den befugdede inkubator returneres ved 37 °C med 5% CO2.
- Dag 4: Saml mediet indeholdende udtrykte viruspartikler, er forsigtige med ikke at afbryde eller fjerne 293T celler. Filtrer mediet indeholdende viruspartikler ved at passere det gennem et 0,45 μM filter, der er fastgjort til en 5 mL sprøjte. Aliquot virus til kort tids opbevaring ved 4 °C eller langtidsopbevaring ved-80 °C.
Bemærk: virale partikler opnået på denne måde vil være til stede i en række ~ 1 x 107 til 1 x 108 transducere enheder/ml. Da de virus producerende celler og celler, der skal være inficeret, begge dyrkes i samme medium, er viral koncentration til udskiftning af mediet ikke påkrævet, og filtrerede virale partikler kan anvendes direkte til at inficere celler. - Frø 2 x 105 hTERT-rpe-1 celler per brønd af en 6-brønd skål som forberedelse til den virale infektion. Kultur celler i 2 mL DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin og vedligeholde i en befuret inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
- Dag 5: Tilsæt hexadimethrinbromid (f. eks. polybrene) til hTERT-RPE-1-cellerne til en endelig koncentration på 8 μg/mL. Inficere celler med en blanding af 500 μL virus fortyndet i 500 μL cellekulturmedium.
Bemærk: Hexadimethrinbromid stamopløsning tilberedes i sterilt destilleret vand og filtreres derefter gennem et 0,45 μm filter. - Dag 6: Brug et engangs glas Pasteur-pipette, Aspirér mediet fra brønde, der indeholder virusinficerede celler. Udskift cellekultur mediet med 2 mL DMEM indeholdende 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin og passende koncentrationer af antibiotika for at udvælge plasmid-integration og-ekspression.
Bemærk: α-Tubulin-EGFP-ekspressions plasmid, der anvendes i de beskrevne eksperimenter, bærer et puromycin-resistens-gen, og RFP-H2B Expression plasmid bærer et blasticidin-resistens-gen. Derfor anvendes 10 μg/mL puromycin og 2 μg/mL blasticidin til udvælgelse af α-Tubulin-EGFP, RFP-H2B, der udtrykker hTERT RPE-1-celler. Koncentrationer af antibiotika, der anvendes til udvælgelsen, kan afvige fra de forskellige anvendte cellelinjer. - Vedligehold celler under valg af antibiotika i 5-7 dage, udskiftning af mediet hver 3 dage med frisk medium indeholdende passende selektions reagenser.
Bemærk: cellerne skal vedligeholdes ved under løbet under udvælgelsen og bør udvides efter behov, som beskrevet i trin 1.1.1 til 1.1.4. - Brug immunofluorescens Imaging til at bekræfte ekspression af mærkede konstruktioner.
Bemærk: Hvis det ønskes, kan enkelt celle kloner udledes for at opnå ensartede udtryks niveauer i celle populationen. Når stabile kloner er bekræftet, kan cellerne vedligeholdes under de normale dyrkningsbetingelser i fravær af antibiotika udvælgelse.
2. klargøring af celler til levende celle billeder efter mitotiske spindel forstyrrelser
Bemærk: Brug aseptisk teknik og Udfør trinene i et BSL2 sikkerhedskabinet.
- Ved hjælp af en steril engangs glas Pasteur-pipette aspirerer mediet fra kultur pladen, der indeholder den cellelinje, som bærer udtryks konstruktionen (s) (fra trin 1,7). Vask kortvarigt cellerne med 10 mL steril PBS. Drej for at fordele PBS over pladens bund, og Aspirér PBS med et sterilt engangs glas Pasteur-pipette.
- Tilsæt 2 mL 0,05% trypsin til 10 cm pladen. Pladen inkubates ved 37 °C i 2-5 min, eller indtil cellerne er løsrevet fra pladens overflade.
- Der tilsættes 8 mL frisk medium til pladen med trypsin. Resuspender cellerne ved forsigtigt at pipettere og overføre suspensionen til et sterilt 15 mL konisk rør. Placer det koniske rør i en balanceret centrifuge og spin ved 161 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for forsigtigt at pille cellerne.
- Supernatanten Aspirér forsigtigt og resuspension i 10 mL PBS ved pipettering forsigtigt med en 10 mL serologisk pipette. Placer det koniske rør i en balanceret centrifuge og spin ved 161 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for forsigtigt at pille cellerne.
- Forsigtigt Aspirér supernatanten og resuspension i 10 mL af det friske medium ved pipettering forsigtigt med en 10 mL serologisk pipette.
- Tæl celler, og Beregn derefter celle nummeret ved hjælp af et hemacytometer og fortyndes til en koncentration på 1-2 x 105 celler/ml i cellekultur mediet. Frø 500 μL af cellesuspensionen til hver brønd af en steril 12-brønd Imaging bundplade. Placer pladen i cellen kultur inkubator og lad cellerne holde sig til pladens overflade.
Bemærk: Live Cell Imaging kræver celler til at være godt overholdt, så de forbliver forbundet med Imaging flyet under billed erhvervelse. Varigheden af den tid, der kræves for celler til at overholde efter plating kan afvige fra en cellelinje til den næste og bør optimeres til celle linjen under undersøgelse. - Op til 30 min før påbegyndelse af tidsforskudt billeddannelse, tilsættes en relevant koncentration af et mitotisk lægemiddel til en eller flere af brøndene, der er seedet med celler. For at højde for den potentielle virkning af det organiske opløsningsmiddel på cellulær opførsel, tilsættes en tilsvarende mængde af inhibitorer fortynden til celler som kontrol. For eksempel, sikre, at tilsætning af 100 nM af den specifikke inhibitor af mitotisk kinase Aurora A (f. eks alisertib) er parallelt med en tilsvarende volumen af DMSO, fortyndingsmiddel for dette stof, i en kontrol brønd af celler.
Bemærk: komparativ analyse af dynamiske ændringer i mitotiske progression kræver brønde af celler, der skal forberedes i fravær af forstyrrelser for at muliggøre billeddannelse af normale mitoser parallelt med eksperimentelle betingelser.
3. mikroskop, der er nedsat til tidsforskudt billeddannelse af RFP-H2B, α-Tubulin-GFP-ekspor-celler (figur 1, figur 2)
- Placer cellekultur pladen, der indeholder RFP-H2B, α-Tubulin-GFP, der udtrykker hTERT RPE-1-celler, som skal indlægges i et passende fase skær på et inverteret epifluorescens mikroskop, som er udstyret med et kamera med høj opløsning (pixelstørrelse på 0,67 μm ved 20x), en miljøkammer forvarmet til 37 °C, og et leveringssystem for befuret 5% CO2.
Bemærk: enten lukkede miljøkamre eller temperaturstyrede trin skær kan være passende forudsat befuret 5% CO2 kan leveres og stabil temperaturkontrol opnået. - Brug en 20x luft målsætning med en numerisk blænde på 0,5 og udstyret til den høje kontrast fluorescens og fasekontrast eller lysfelt Imaging. Se celler med fasekontrast eller lysfelt og justere kurset og fine fokus på mikroskopet for at bringe cellerne i fokus.
- Identificer og Indstil de optimale eksponeringstider for brightfield-, GFP-og RFP-billed anskaffelse ved at vælge den respektive filter kube med passende excitation og emission for de fluorophorer, der skal afbildes. Alternativt kan du klikke på knappen Auto Exposure for at indtaste en forudbestemt eksponeringstid. Hvis signalet ikke er tilstrækkeligt intenst, skal du vælge pixel Binning for at aktivere kortere eksponeringstider ved at klikke på fanen Binning og vælge 2 x 2 pixel Binning fra rullemenuen.
Bemærk: fototoksicitet kan forringe mitotisk progression og cellernes levedygtighed. Svigt af mitotiske celler i kontrolpopulationer for at fuldføre normale mitoser kan være en indikation af, at eksponeringstider og/eller billedbehandlings varigheden skal optimeres yderligere. - Brug en anskaffelse og analyse software, der gør det muligt at erhverve multi-koordinere, multi-Well Imaging samtidig og definere parametrene for billed erhvervelse.
- Vælg og Kalibrer mikroskopet til multi-brønd skålen i henhold til producentens anvisninger. Brug billedet erhvervelse software til at fremhæve eller på anden måde vælge de brønde, der vil blive afbildet ved at klikke på de relevante brønde i diagrammet af pladen format, der anvendes.
- Under kontrolpanelet Generatedpoints (figur 2) skal du definere koordinaterne inden for hver brønd, der vil blive inddelt, ved at klikke på fanen punkt placering og vælge foruddefineret eller tilfældig koordinat placering fra rullemenuen. Vælg fanen arbejdsområde , og vælg begrænset fra rullemenuen for at begrænse koordinat markeringsområdet for at udelukke grænserne for brønden. Klik på fanerne optælling og fordeling for at vælge antallet og fordelingen af de punkter, der skal registreres pr. brønd.
Bemærk: antallet af koordinater, der kan afbildet per brønd inden for 5 min tidspunkt tilvækst vil være begrænset af antallet af brønde, som skal afbildet, samt eksponeringstid for hver kanal. Typisk, 5-8 koordinater per brønd er tilstrækkelige til at observere mindst 50 celler i hver tilstand fremskridt gennem mitose inden 4 h. - Vælg og Indtast tidsintervallet og varighed for at indsamle billeder ved at klikke på og indtaste værdierne i Timesequence Control Panel.
Bemærk: erhvervelse af billeder hver 1 til 5 minutter er hensigtsmæssigt at overvåge dynamikken i mitotisk progression. Den samlede varighed af billeddannelse bør afspejle det ønskede endepunkt og sprednings hastigheden for celle linjen. For eksempel, 4 timer er tilstrækkelig til at se mange celler fremskridt gennem mitose, 16 timer er tilstrækkelig til at se de fleste RPE-1 celler i en asynkron population fremskridt gennem mitose.
4. tidsforskudt billedanalyse til bestemmelse af metafase timing og mitotisk celle skæbne efter mitotiske spindel forstyrrelser
Bemærk: Udfør billedanalysen ved hjælp af en billed anskaffelsesoftware (tabel over materialer), ImageJ eller sammenlignelig billedanalyse software.
- Visualiser RFP-H2B mærket kromatin ved at vælge de billeder, som er taget med RFP-filter kuben på plads. Identificer en celle ind i mitose som indikeret ved indledende kromatin komprimering (figur 2C, blå pilespids) og nuklear konvolut opdeling (når α-Tubulin-egfp ikke længere udelukkes ved den nukleare grænse).
- Bestem mitotisk timing af metafase justering og kaldelse debut i individuelle celler: spor cellen gennem fortløbende tidspunkter i den erhvervede film for at bestemme antallet af tidspunkter/minutter fra mitotisk indgang indtil RFP-H2B-mærket kromatin afslutter justeringen ved celle ækvator under Metaponto (figur 2C, gul pilespids).
- For at overvåge mitotisk timing, mitotisk nøjagtighed, og celle skæbne, fortsætte med at spore cellen gennem fortløbende tidspunkter for at identificere den tid koordinat, hvor kaldelse kromosom adskillelse er tydelig (figur 2C, hvid pilespids) og/eller hvor kromatin-deformations-og nuklear kuvert reformationen (som indikeret af tubulinudelukkelse fra kernen) har fundet sted.
Bemærk: perturbationer i spindel montage eller mitotisk progression kan vurderes som en funktion af den tid, der kræves for at opnå en bipolær mitotisk spindel og opnå komplet kromosom justering eller for at fuldføre kaldelse kromosom adskillelse. - Visualiser RFP-H2B for at identificere celler i hver population, der udviser mitotiske defekter, herunder tilbagestående kromosomer og kromatin broer under kaldelse kromosom adskillelse.
Bemærk: kompromitteret mitotisk troskab kan også resultere i flerkernede eller mikronucleerede datter celler og kan visualiseres i celler post mitotisk udgang, som i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering af mitotisk progression ved tilstedeværelse af spindel forstyrrelser
Reguleringen af spindel pole fokusering er et vigtigt skridt i korrekt bipolar spindel dannelse. Afbrydelse i denne proces gennem protein depletions, Drug hæmning, eller ændringer i centrosome nummer korrupte spindel struktur og forsinke eller standse mitotiske progression10,11,12,13. Ikke desto mindre, nogle perturbationer kun forbigående forsinke spindel dannelse med celler i sidste instans gennem mitose at fuldføre kaldelse kromosom adskillelse14. I mangel af celle synkronisering tilgange, som selv kan indirekte påvirke mitotiske processer1,2, cellerfremskridt gennem mitose asynkront (figur 2C). Brug RFP-H2B til at identificere kromatin, mitotiske celler med kompakt kromatin kan iscenesat være i prometaphase (dem forud for fuldstændig metafase justering: figur 2C, blå pilespidser), Metaponto (komplet kromosom justering: Figur 2 C, gule pilespidser) og kaldelse (kromosomer, der holdes adskilt mod spindel stænger: figur 2C, hvide pilespidser). Erobringen af 5-8 koordinater over 4 h er tilstrækkelig til at følge progression af mindst 50 celler gennem mitose i en given tilstand. For at undersøge dynamikken i spindel samlingen efter ændringer i centrosome antal og/eller hæmning af Aurora en kinase, en vigtig regulator af spindel stang fokusering14,15,16, 17, vi brugte Live Cell time-lapse billeddannelse af humane celler med 2 centrosomes, eller dem, der indeholder overtallige centrosomes. Celler blev dyrket i nærværelse af eller fravær af Aurora en kinasehæmmer før påbegyndelsen af billeddannelse. Celler med 2 centrosomer oplever forstyrrelse i mitotisk progression, når de behandles med Aurora en kinasehæmmer, men er i sidste ende i stand til at opnå metafase kromosom justering (figur 2C, gul pilespids). I modsætning hertil er celler med > 2 centrosomer udsøgt følsomme over for Aurora en hæmning og udviser en stigning i prometaphase celler og fravær af Metaponto celler, hvilket indikerer en forsinkelse i spindel montage og mitotisk progression.
Figur 3 viser, at sådanne tidsforskudt billedbehandlings metoder er tilstrækkelige til at overvåge både spindel montering og mitotisk nøjagtighed. Ved at visualisere α-Tubulin-EGFP, blev det observeret, at celler, der oplever spindel forstyrrelse (vist her på grund af centrosome overlapning) undergår dynamiske ændringer, da spindel stang fokusering er opnået, og en bipolær mitotisk spindel dannes som forberedelse til Celledeling. Samtidig med spindel montage kan kromosom bevægelse visualiseres med RFP-H2B for at vurdere kromosom justering og adskillelses nøjagtighed. Mitotiske celler, der oplever forbigående spindel multipolaritet, er modtagelige for fastgørelses fejl, der resulterer i tilbagestående kromosomer under kaldelse og danner mikronuclei i den efterfølgende G1-fase af cellecyklussen. Sådanne defekter er synlige med disse Live Cell Imaging tilgange.
Ændringer i den dynamiske progression af mitose ændre mitotisk timing og indvirkning mitotiske celle skæbne
Efter den nukleare kuvert opdeling, spindel dannelse og kromosom bevægelse kan spores gennem stadier af mitose at vurdere mitotiske progression, varighed, og den skæbne af celler, der fremskridt i anaphase. Centrosome forstærkning, en funktion, der er almindelig i mange typer af kræft, er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ekstra centrosomes og multipolar spindel dannelse18,19,20. Da multipolære divisioner resulterer i meget aneuploide og sandsynlige urentable datter celler, klynger kræftcellerne sig aktivt til ekstra centrosomer for at danne en bipolær spindel og gennemgå en bipolar division5,20,21, 22,23,24. Ved hjælp af Live Cell Imaging tilgange, vores repræsentative resultater viser, at celler med et normalt centrosome indhold er i stand til at gå fra nuklear konvolut opdeling gennem Metaponto justering og kaldelse debut for at opnå en bipolar division på under 30 minutter ( Figur 4 A, D, E). I nærværelse af ekstra centrosomer, næsten 50% af cellerne er i stand til at overvinde en forbigående multipolær mitotisk spindel og til dannelse af en bipolar spindel og komplet celle division (figur 4C, D). De resterende celler er ude af stand til at opnå en bipolar spindel og som resultat exit mitose gennem en multipolar division (figur 4B, D). Uanset om spindel Bipolaritet opnås, udviser celler med ekstra centrosomer en signifikant øget varighed af mitose sammenlignet med celler med 2 centrosomer, hvilket indikerer, at dynamikken i mitotisk progression kan ændres, selv når ændringer i mitotiske udfald er ikke tydeligt (figur 4E).
Figur 1: valg af mikroskop og kameraparametre. (A) repræsentation af vinduet for at vælge den ønskede objektiv og passende filter kube ved hjælp af et billede erhvervelse software. Vist er valget af 20x forstørrelses målet og lysfelt filter Cube. (B) celler i prøvepladen findes og bringes i fokus ved hjælp af lysfelt eller fasekontrast mikroskopi. (C) repræsentation af vinduet for at indstille eksponerings parametrene for hver billedoptagelse. Pixel-Binning kan bruges, hvis det er nødvendigt, for at opnå reduceret eksponeringstid pr. optagelse og minimere foto beskadigelse af celler. Scale bar er 10 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: billedoptagelse og analyse af tidsforskudt mikroskopi. (A og B) repræsentation af vinduet angiver, hvordan billedet erhvervelse parametre er sat ved hjælp NIS Elements HCA job image erhvervelse software. Denne software giver multi-koordinere, multi-Well Imaging over tid. Hvert job kan ændres for at angive brønde og koordinater, der skal fanges. C) enkelt tidsrammer fra fire betingelser for ét eksperiment. RFP-H2B bruges til at spore kromatin. Kromatin komprimering og positionering bruges til at identificere forskellige stadier af mitose: Prometaphase (komprimering i fravær af kromosom justering, blå pilespids), Metaponto (komplet kromosom justering ved celle ækvator, gul pilespids), og Anafylanose (efter initiering af synkrone kromosom adskillelse, hvidt pilespids). Scale bar er 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: tidsforskudt billeddannelse visualiserer defekter i mitotisk troskab. Celler, der indeholder ekstra centrosomer, danner multipolære spindler og grupperer dem ofte i en bipolær spindel, inden celledelingen fuldføres. Her kommer en celle ind i mitose med syv forskellige spindel stænger (hvide asterisker), som over tid er grupperet i to hoved spindel poler. På dette tidspunkt, kromosomer er i stand til at justere langs spindel ækvator, og cellen fortsætter til anaphase. Den forbigående multipolaritet har tilladt en Mal fastgørelse af et enkelt kromosom. Denne uløste fejl resulterer i et tilbagestående kromosom under kaldelse, som bliver indarbejdet i en mikronucleus i en datter celle (mærket med en pil). Kromatin visualiseres med RFP-Histon 2B og microtubuler visualiseres med α-Tubulin-EGFP. Tidsstempler i hvert panel angiver minutter med hensyn til den tilsyneladende opdeling af nukleare konvolutter som bedømt ved påvisning af Tubulin inden for den nukleare grænse. Scale bar er 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ændringer i den dynamiske progression af mitose ændre mitotisk timing og indvirkning mitotiske celle skæbne. RFP-H2B, vist med rødt, bruges til at spore kromatin bevægelse og α-Tubulin-GFP, vist med grønt, bruges til at overvåge centrosome/spindel pole nummer og organisation. Tab af GFP-Tubulin udelukkelse fra kernen, samtidig med tidlig kromatin komprimering er en indikation af, at den nukleare konvolut er brudt (NEB) som forberedelse til mitotiske celle division. Nuklear udelukkelse af GFP-Tubulin er tydelig ved mitotisk udgang og reformationen af den nukleare kuvert. (A) en celle med to centrosomer danner en bipolær spindel og skrider gennem kaldelse at danne to datter celler. (B og C) Celler med ekstra centrosomer indtaster mitose for at danne en multipolær spindel. (B) nogle af disse celler med ekstra centrosomes forsinkelse i mitose uden at opnå en bipolar spindel og fremskridt til at fuldføre multipolære anaphase. (C) andre celler med ekstra centrosomer udviser en forbigående forsinkelse i mitotisk progression, mens de klynge ekstra centrosomer for at muliggøre bipolar anaphase. (D) celler med ekstra centrosomer er i stand til at gennemgå en bipolar division ca. 50% af tiden, mens de resterende celler med ekstra centrosomer gennemgår en multipolær division. (E) celler med ekstra centrosomer har øget mitotisk timing uanset den endelige mitotiske skæbne (bipolar eller multipolær anaphase). Scale bar er 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tidsmæssige opløsning, der leveres af time-lapse Imaging giver mulighed for visualisering og vurdering af sekventielle cellulære begivenheder inden for enkeltceller. Tilgange, der gør brug af cellulære synkronisering efterfulgt af indsamling og fiksering af celler i sekventielle tidspunkter er begrænset i, at sammenligninger er i sidste ende foretaget mellem populationer af celler. I sammenhænge, hvor cellulær respons på forstyrrelser kan være ikke-ensartet, eller hvor den proces, der visualiseres, er dynamisk, er live Cell time-lapse Imaging bedre rustet til at følge og analysere både dynamikken i enkeltceller, samt den heterogenitet inden for en cellulær population. På denne måde, time-lapse billeddannelse er især nyttigt i overvågningen af celle progression gennem de dynamiske stadier af mitose og vurdere, hvordan perturbationer til denne progression i sidste ende påvirker trotalitet af mitotiske celle division og efterfølgende celle skæbne.
Mens der er en række fordele ved levende celle billeddannelse, væsentlige udfordringer er forbundet, der skal overvejes og afbødet, når det er muligt. En af udfordringerne er at opretholde passende miljøforhold for at sikre cellernes levedygtighed og spredning under billeddannelse. For at opnå dette skal billedbehandlings sættet omfatte et miljøkammer, der regulerer både temperatur og CO2. Alternativt kan celler være afbildet for en kortsigtet med kun temperaturregulering, hvis det gøres i et lukket kammer. I begge tilfælde bør brugen af et Vibrationsdæmpende bord og/eller hardwarebaserede tilgange til at afbøde aksiale fokus udsving (f. eks. Nikons perfekte fokus) anvendes til at opretholde pladens fokus i hele eksperimentets varighed. En anden betydelig bekymring med levende celle billeddannelse er potentialet for foto skader og foto blegning. Foto blegning er en bekymring, hvor fluoroforet bliver afbildet gradvist aftager i fluorescens intensitet som Imaging skrider frem. Men eksponeringen for høj intensitet excitation lys, der resulterer i foto blegning er også giftigt for celler og pleje skal gøres for at minimere celle eksponering ved at reducere eksponeringstider, billede erhvervelse intervaller, og den samlede varighed af Imaging sekvens 25. konsekvenser af ikke at optimere billeddannelse betingelser for at minimere fototoksicitet kan omfatte generering af DNA-skader og andre cellulære ændringer, der kan til gengæld kompromittere fortolkning og forståelse af eksperimentet. Skulle cellelevedygtighed blive et problem med langsigtet billeddannelse, bør der gøres en indsats for at udnytte pixel Binning (for at muliggøre kortere eksponeringer) og øge varigheden mellem efterfølgende billedoptagelser. En yderligere bekymring er, at fluorescerende tag kan ændre opførsel af proteinet, som det er smeltet, eller at integrationen af det virale udtryk konstruere i genomet kan selv påvirke cellulære adfærd. For at højde for muligheden for, at tilføjelsen af et fluorescerende tag kan påvirke protein funktionen, er det nødvendigt at foretage en vurdering af protein funktionen efter tilsætning af et fluorescerende mærke af typen N eller C og sammenligning med ikke-mærket protein funktion. For at afgøre, om der opstår skadelige virkninger på cellernes adfærd på grund af forstyrrelser af genomet locus, hvor den virale konstruktion er blevet integreret, bør der udledes flere enkelt celle kloner sammenlignet med celler, der mangler det mærkede protein, og testet til at overvåge at cellulær fitness og mitotisk progression ikke er perturbed. Alternativt, off Target effekter af tilfældig integration af den virale ekspression konstruktion kan afbødet gennem målrettet integration af fusionsprotein i den endogene locus, eller andre kendte regioner af genomet, ved hjælp af CRISPR-baserede tilgange.
Tilgange til at identificere og karakterisere større regulatorer af mitotisk progression har påberåbt sig stærkt på faste celle billeder. Mitotiske regulatorer identificeret på denne måde er efterfølgende blevet udnyttet i terapeutisk målretning hurtigt prolifererende kræftceller7,8,9. Men, antimitotiske lægemidler udfører ikke altid ensartet i forskellige kræftformer og i mange tilfælde indsigt i de mitotiske fænotyper, der går forud for enten vellykkede eller mislykkede kemoterapeutiske tilgange forbliver uklare. Live Cell time-lapse Imaging til at spore mitotiske celler i tilstedeværelse og fravær af spindel-perturbing narkotika har potentiale til at give den indsigt, der er nødvendige for at identificere de modulatorer mest tilbøjelige til at resultere i katastrofale mitoser og kompromitteret levedygtighed af kræftceller med minimal indvirkning på normale celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
DLM understøttes af en NSF GRFP. ALM understøttes af finansiering fra Smith-familie prisen for topkvalitet inden for biomedicinsk forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
