Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Dynamik der Spindelbildung und der mitotischen Progression vor. Unsere Anwendung der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es dem Anwender, Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose zu identifizieren, mitotische Defekte zu verfolgen und zu identifizieren und die Spindeldynamik und das mitotische Zellschicksal bei Exposition gegenüber Anti-Mitotik-Medikamenten zu analysieren.
Abstract
Live-Zell-Zeitraffer-Bildgebung ist ein wichtiges Werkzeug in der Zellbiologie, das Einblicke in zelluläre Prozesse bietet, die andernfalls von der Fixed-Cell-Analyse übersehen, missverstanden oder falsch interpretiert werden könnten. Während die fixe Zellbildgebung und -analyse robust und ausreichend ist, um den zellulären Stationären Zustand zu beobachten, kann sie bei der Definition einer zeitlichen Reihenfolge der Ereignisse auf zellulärer Ebene eingeschränkt sein und ist schlecht gerüstet, um die transiente Natur dynamischer Prozesse einschließlich mitotische Progression. Im Gegensatz dazu ist die Live-Zell-Bildgebung ein eloquentes Werkzeug, das verwendet werden kann, um zelluläre Prozesse auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit zu beobachten, und hat die Fähigkeit, die Dynamik von Prozessen zu erfassen, die sonst in der Bildgebung fester Zellen schlecht dargestellt wären. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Erzeugung von Zellen, die fluoreszierend markierte Marker von Chromatin und Mikrotubuli tragen, und deren Verwendung in Live-Zell-Bildgebungsansätzen zur Überwachung der Metaphasenchromosomausrichtung und des mitotischen Austritts. Wir beschreiben bildgebende Techniken zur Beurteilung der Dynamik der Spindelbildung und der mitotischen Progression, einschließlich der Identifizierung von Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose, der Identifizierung und Verfolgung von mitotischen Defekten und der Analyse der Spindeldynamik und mitotischezellliche semittizische Zellschicksale nach der Behandlung mit mitotischen Inhibitoren.
Introduction
Die bildbasierte Analyse fester Zellen wird häufig verwendet, um die Veränderungen der Zellpopulationsebene als Reaktion auf verschiedene Störungen zu bewerten. In Kombination mit der Zellsynchronisierung, gefolgt von der Erfassung und Abbildung von seriellen Zeitpunkten, können solche Ansätze verwendet werden, um eine zelluläre Abfolge von Ereignissen vorzuschlagen. Dennoch ist die Bildgebung fester Zellen insofern begrenzt, als zeitliche Beziehungen für eine Population impliziert und nicht auf der Ebene einzelner Zellen nachgewiesen werden. Auf diese Weise reicht die Bildgebung und Analyse fester Zellen zwar aus, um robuste Phänotypen und stationäre Veränderungen zu beobachten, aber die Fähigkeit, vorübergehende Veränderungen im Laufe der Zeit zu erkennen und Veränderungen, die sich nur auf eine Teilpopulation der Zellen auswirken, ist unvollkommen. Im Gegensatz dazu ist die Live-Zell-Bildgebung ein eloquentes Werkzeug, das verwendet werden kann, um zelluläre und subzelluläre Prozesse innerhalb einer einzelnen Zelle oder Zellpopulation im Laufe der Zeit und ohne die Hilfe von Synchronisationsansätzen zu beobachten, die sich selbst auf das zelluläre Verhalten auswirken können. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
Die Bildung einer bipolaren mitotischen Spindel ist für die richtige Chromosomensegregation während der Zellteilung unerlässlich, was zu zwei genetisch identischen Tochterzellen führt. Defekte in der mitotischen Spindelstruktur, die die mitotische Progression korrumpieren und die Genauigkeit der Chromosomensegregation beeinträchtigen, können zu katastrophalen Zellteilungen und einer verminderten Zelllebensfähigkeit führen. Aus diesem Grund sind mitotische Gifte, die die Spindelbildung verändern, vielversprechende Therapeutika, um die schnelle Proliferation von Krebszellen7,8,9zu begrenzen. Dennoch ist die feste Zellanalyse der Spindelstruktur nach Zugabe von mitotischen Giften in ihrer Fähigkeit, den dynamischen Prozess der Spindelbildung zu beurteilen, begrenzt und kann nicht darauf hinweisen, ob beobachtete Veränderungen der Spindelstruktur dauerhaft sind oder stattdessen vorübergehend und kann überwunden werden, um eine erfolgreiche Zellteilung zu ermöglichen.
In diesem Protokoll beschreiben wir einen Ansatz zur Bewertung der Dynamik der Mitose nach Spindelstörungen durch Live-Zell-Bildgebung. Mit der hTERT verewigten RPE-1-Zelllinie, die entwickelt wurde, um ein Mit dem RFP-markiertes Histone 2B auszudrücken, um Chromatin zusammen mit einem EGFP-getaggten -Tubulin zu visualisieren, um Mikrotubuli, das Timing der Metaphasenchromosomausrichtung, den Anaphasenbeginn und letztlich Das mitotische Zellschicksal wird anhand visueller Hinweise auf Chromosomenbewegung, Verdichtung und kerntechnische Morphologie beurteilt.
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Protocol
1. Erzeugung von hTERT-RPE-1-Zellen, die rFP-Histone 2B (RFP-H2B) und s-tubulin-EGFP (tub-EGFP) stabil exemiten
HINWEIS: Alle Schritte folgen aseptischen Techniken und finden in einem Sicherheitsschrank der Biosicherheitsstufe II+ (BSL2+) statt.
- Generieren Sie Retrovirus, das die Gene von Interesse (-Tubulin-EGFP und RFP-H2B) durch die Transfektion von 293T-Zellen mit den entsprechenden lentiviralen Plasmiden gemäß den Anweisungen des Herstellers des lipidbasierten Transfektionsabgabesystems trägt.
- Tag 1: Verwenden Sie eine Einwegglas Pasteur Pipette, um das Zellkulturmedium von einer Platte von sub-konfluenten 293T-Zellen zu aspirieren und das Restmedium mit Phosphat gepufferter Kochsaline (PBS) abzuwaschen, indem Sie 5 ml PBS hinzufügen. Wirbeln, um PBS über den Plattenboden zu verteilen, dann aspirieren Sie die PBS mit einer sterilen Einweg-Glas Pasteur Pipette.
- Fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin, das auf 37 °C vorgewärmt wurde, und geben Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 für 2 bis 5 min zurück, damit anhantibe Zellen von der Zellkulturschale freigesetzt werden können.
- Fügen Sie 8 ml frisches Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin auf die Platte, die Trypsin enthält.
- Setzen Sie die Zellen durch sanftes Pipetieren wieder auf und übertragen Sie die Suspension in ein steriles 15 ml konisches Rohr. Das konische Rohr in eine ausgewogene Zentrifuge geben und bei 161 x g 5 min bei Raumtemperatur drehen, um die Zellen sanft zu pelleten.
- Aspirieren Sie die Mittlere/Trypsin-Lösung aus Pelletzellen und suspendieren Sie Zellen in 10 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die 293T Zellaufhängung und Platte 2 x 106 293T Zellen pro Brunnen einer 6-Well-Platte zu zählen.
- Kulturzellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml von Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin und halten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2.
- Tag 2: Pipette 7 l lipidbasiertes Transfektions-Abgabe-Reagenz und 100 l reduziertes Serummedium in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und lassen es bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren (Rohr #1).
- In einem separaten 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr wird die Pipette 1 g RFP-H2B-Expressionsvektor (oder 1 g Tubulin-EGFP-Expressionsvektor) zusammen mit 5 l Enhancer-Reagenz (wie nach Herstellerrichtlinien erforderlich), 0,5 g pMD2.G und 1 Serummedium (Rohr #2).
- Kombinieren Sie den Inhalt von Schritt 1.1.7 und Schritt 1.1.8, indem Sie das Rohr sorgfältig #2 in die #1 in die Röhre leiten und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
HINWEIS: Die Reaktion kann bei Bedarf für die Transfektion von Zellen in zusätzlichen Brunnen skaliert werden. - Pipette die Transfektionsreaktion tropfenweise auf den gewünschten Brunnen mit 293T Zellen in 2 ml Medium und geben Sie die Schale bei 37 °C mit 5%CO2an den befeuchteten Inkubator zurück.
ANMERKUNG: Um Zellen zu erzeugen, die sowohl RFP-H2B als auch S-Tubulin-EGFP exezieren, generieren Sie für jedes Expressionskonstrukt separate Viren (Schritte 1.1.7- 1.1.9). - Tag 3: Aspirieren und ersetzen Sie das Medium durch 2 ml frisches DMEM, ergänzt durch 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin. Bringen Sie die Schale bei 37 °C mit 5%CO2in den befeuchteten Inkubator zurück.
- Tag 4: Sammeln Sie das Medium, das exprimierte Viruspartikel enthält, und sind Sie vorsichtig, 293T-Zellen nicht zu stören oder zu entfernen. Filtern Sie das Medium, das Viruspartikel enthält, indem Sie es durch einen 0,45 -M-Filter durcheine 5 ml Spritze durchqueren. Aliquot-Virus zur kurzfristigen Lagerung bei 4 °C oder Langzeitlagerung bei -80 °C.
HINWEIS: Virale Partikel, die auf diese Weise gewonnen werden, werden in einem Bereich von 1 x 107 bis 1 x 108 Transducing Units/ml vorhanden sein. Da die viral produzierenden Zellen und Zellen, die infiziert werden sollen, beide im selben Medium kultiviert werden, ist eine Viruskonzentration, um das Medium zu ersetzen, nicht erforderlich und gefilterte Viruspartikel können direkt zur Infektion von Zellen verwendet werden. - Samen 2 x 105 hTERT-RPE-1 Zellen pro Brunnen einer 6-Well-Schale zur Vorbereitung auf die Virusinfektion. Kulturzellen in 2 ml DMEM ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin und halten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2.
- Tag 5: Hexadimethrinbromid (z.B. Polybren) zu den hTERT-RPE-1-Zellen zu einer Endkonzentration von 8 g/ml hinzufügen. Infizieren Sie Zellen mit einer Mischung von 500 l Virus verdünnt in 500 l Zellkulturmedium.
HINWEIS: Die Hexadimethrinbromid-Stammlösung wird in sterilem destilliertem Wasser hergestellt und dann durch einen 0,45 m-Filter gefiltert. - Tag 6: Mit einer Einwegglas Pasteur Pipette, aspirieren Sie das Medium aus Brunnen, die die Virus infizierten Zellen. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch 2 ml DMEM mit 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin und entsprechenden Konzentrationen von Antibiotika, die für die Plasmidintegration und -expression ausgewählt werden müssen.
ANMERKUNG: Das in den beschriebenen Experimenten verwendete Expressionsplasmid von A-Tubulin-EGFP trägt ein Puromycin-Resistenz-Gen und das RFP-H2B-Expressionsplasmid ein Blasticidin-Resistenzgen. Daher werden 10 g/ml Puromycin und 2 g/ml Blasticidin für die Auswahl von B-Tubulin-EGFP- , RFP-H2B-Exzessiv hTERT RPE-1-Zellen verwendet. Die Konzentrationen von Antibiotika, die für die Auswahl verwendet werden, können für verschiedene Zelllinien unterschiedlich sein. - Halten Sie Zellen unter Antibiotika-Auswahl für 5-7 Tage, ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage mit frischem Medium mit geeigneten Selektionreagenzien.
HINWEIS: Zellen sollten während der Auswahl bei der Subkonfluzon erhalten und bei Bedarf erweitert werden, wie in den Schritten 1.1.1 bis 1.1.4 beschrieben. - Verwenden Sie Immunfluoreszenz-Bildgebung, um die Expression von markierten Konstrukten zu bestätigen.
HINWEIS: Wenn gewünscht, können Einzelzellklone abgeleitet werden, um gleichmäßige Expressionsebenen innerhalb der Zellpopulation zu erhalten. Sobald stabile Klone bestätigt sind, können Zellen ohne Antibiotikaauswahl unter den Standardkulturbedingungen gehalten werden.
2. Vorbereitung von Zellen für die Live-Zell-Bildgebung nach mitotischen Spindelstörungen
HINWEIS: Verwenden Sie aseptische Techniken und führen Sie die Schritte in einem BSL2-Sicherheitsschrank aus.
- Mit einer sterilen Einwegglas Pasteur Pipette, aspirieren Sie das Medium aus der Kulturplatte, die die Zelllinie enthält, die den Ausdruck Konstrukt(e) trägt (ab Schritt 1.7). Waschen Sie die Zellen kurz mit 10 ml sterilem PBS. Wirbeln, um PBS über den Plattenboden zu verteilen, dann aspirieren PBS mit einem sterilen Einweg-Glas Pasteur Pipette.
- 2 ml 0,05% Trypsin auf die 10 cm Platte geben. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2-5 min oder bis sich die Zellen von der Plattenoberfläche gelöst haben.
- Fügen Sie 8 ml frisches Medium auf die Platte mit Trypsin. Setzen Sie die Zellen durch sanftes Pipetieren wieder auf und übertragen Sie die Suspension in ein steriles 15 ml konisches Rohr. Das konische Rohr in eine ausgewogene Zentrifuge geben und bei 161 x g 5 min bei Raumtemperatur drehen, um die Zellen sanft zu pelleten.
- Den Überstand vorsichtig ansaugen und in 10 ml PBS wieder aufhängen, indem man sanft mit einer 10 ml serologischen Pipette pipetiert. Das konische Rohr in eine ausgewogene Zentrifuge geben und bei 161 x g 5 min bei Raumtemperatur drehen, um die Zellen sanft zu pelleten.
- Den Überstand vorsichtig ansaugen und in 10 ml des frischen Mediums wieder auftragen, indem man sanft mit einer 10 ml serologischen Pipette pipetiert.
- Zählen Sie Zellen, berechnen Sie dann die Zellzahl mit einem Hemacytometer und verdünnen Sie auf eine Konzentration von 1-2 x 105 Zellen/ml im Zellkulturmedium. Samen 500 l der Zellsuspension zu jedem Brunnen einer sterilen 12-Well-Bild-Bodenplatte. Legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator und lassen Sie die Zellen an der Plattenoberfläche haften.
HINWEIS: Für die Live-Zell-Bildgebung müssen Zellen gut haften, damit sie während der Bildaufnahme mit der Bildebene verknüpft bleiben. Die Dauer der Zeit, die Zellen benötigen, um nach der Beschichtung zu haften, kann von einer Zelllinie zur nächsten variieren und sollte für die zu untersuchende Zelllinie optimiert werden. - Bis zu 30 min vor Beginn der Zeitraffer-Bildgebung, fügen Sie eine relevante Konzentration eines mitotischen Medikaments zu einem oder mehreren der Mittätsbrunnen mit Zellen. Um die möglichen Auswirkungen des organischen Lösungsmittels auf das zelluläre Verhalten zu berücksichtigen, fügen Sie den Zellen als Kontrollen ein gleiches Volumen des Verdünnungsmittels des Inhibitors hinzu. Stellen Sie beispielsweise sicher, dass die Zugabe von 100 nM des spezifischen Inhibitors der mitotischen Kinase Aurora A (z. B. Alisertib) mit einem gleichen Volumen von DMSO, dem Verdünnungsmittel für dieses Medikament, in einem Kontrollbrunnen von Zellen einhergeht.
ANMERKUNG: Die vergleichende Analyse dynamischer Veränderungen der mitotischen Progression erfordert, dass Inlagen von Zellen ohne Störungen vorbereitet werden, um die Bildgebung normaler Milben gleichzeitig mit experimentellen Bedingungen zu ermöglichen.
3. Mikroskop für die Zeitraffer-Bildgebung von RFP-H2B, b-Tubulin-GFP-exemitten Zellen eingerichtet (Abbildung 1, Abbildung 2)
- Platzieren Sie die Zellkulturplatte, die RFP-H2B, a-tubulin-GFP-exzessizierende hTERT-RPE-1-Zellen enthält, die in einem geeigneten Bühneneinsatz auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop abgebildet werden sollen, das mit einer hochauflösenden Kamera (Pixelgröße 0,67 x 20x) Umweltkammer auf 37 °C vorgewärmt, und ein Abgabesystem für befeuchtete 5%CO2.
HINWEIS: Entweder geschlossene Umweltkammern oder temperaturgeregelte Stufeneinsätze können geeignet sein, sofern befeuchtete 5%CO2 geliefert und eine stabile Temperaturregelung erreicht werden kann. - Verwenden Sie ein 20-faches Luftobjektiv mit einer numerischen Blende von 0,5 und sind für die kontrastreiche Fluoreszenz und Phasenkontraste oder Hellfeld-Bildgebung ausgerüstet. Sehen Sie sich Zellen mit dem Phasenkontrast oder Hellfeld an und passen Sie den Verlauf an und fokussieren Sie sich auf das Mikroskop, um Zellen in den Fokus zu rücken.
- Identifizieren und legen Sie die optimalen Belichtungszeiten für die Bildaufnahme von Hellfeld, GFP und RFP fest, indem Sie den jeweiligen Filterwürfel mit entsprechender Anregung und Emission für die abgebildeten Fluorophore auswählen. Alternativ können Sie auf die Schaltfläche "Automatische Belichtung" klicken, um eine vorgegebene Belichtungszeit einzugeben. Wenn das Signal nicht intensiv genug ist, wählen Sie Pixel-Binning aus, um kürzere Belichtungszeiten zu ermöglichen, indem Sie auf die Registerkarte Binning klicken und 2 x 2 Pixel binning aus dem Dropdown-Menü auswählen.
HINWEIS: Phototoxizität kann die mitotische Progression und zellelige Lebensfähigkeit beeinträchtigen. Das Versagen von mitotischen Zellen in Kontrollpopulationen, normale Mitosen zu vervollständigen, kann ein Hinweis darauf sein, dass Die Expositionszeiten und/oder die Bildgebungsdauer weiter optimiert werden muss. - Verwenden Sie eine Erfassungs- und Analysesoftware, mit der gleichzeitig Multi-Koordinaten- und Multi-Well-Bildgebung erfasst und die Parameter für die Bildaufnahme definiert werden können.
- Wählen und kalibrieren Sie die Mikroskopstufe gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Multi-Well-Schale. Verwenden Sie die Bildaufnahme-Software, um die Brunnen hervorzuheben oder anderweitig auszuwählen, die abgebildet werden, indem Sie auf die entsprechenden Brunnen im Diagramm des verwendeten Plattenformats klicken.
- Definieren Sie im Bedienfeld "GeneratedPoints" (Abbildung 2) die Koordinaten innerhalb jeder Bohrung, die abgebildet werden soll, indem Sie auf die Registerkarte Punktplatzierung klicken und eine vordefinierte oder zufällige Koordinatenplatzierung aus das Dropdown-Menü. Wählen Sie die Registerkarte Arbeitsbereich aus, und wählen Sie im Dropdown-Menü eingeschränkt aus, um den Koordinatenauswahlbereich einzuschränken, um die Grenzen des Brunnens auszuschließen. Klicken Sie auf die Registerkarten Anzahl und Verteilung, um die Anzahl und Verteilung der Punkte auszuwählen, die pro Brunnen erfasst werden sollen.
HINWEIS: Die Anzahl der Koordinaten, die pro Bohrwert innerhalb des Zeitpunktinschritts von 5 minuten abgebildet werden können, wird durch die Anzahl der zu bebildernden Bohrungen sowie die Belichtungszeit für jeden Kanal begrenzt. In der Regel sind 5-8 Koordinaten pro Brunnen ausreichend, um mindestens 50 Zellen in jedem Zustandsfortschritt durch Mitose innerhalb von 4 h zu beobachten. - Wählen Sie das Zeitintervall und die Dauer aus, um Bilder zu sammeln, indem Sie auf die Werte im TimeSequence-Bedienfeld klicken und diese eingeben.
HINWEIS: Die Erfassung von Bildern alle 1 bis 5 Minuten ist geeignet, um die Dynamik des mitotischen Fortschreitens zu überwachen. Die Gesamtdauer der Bildgebung sollte den gewünschten Endpunkt und die Proliferationsrate der Zelllinie widerspiegeln. Zum Beispiel, 4 Stunden ist ausreichend, um zu sehen, viele Zellen Fortschritt durch Mitose, 16 Stunden ist ausreichend, um die meisten RPE-1-Zellen in einer asynchronen Population Fortschritt durch Mitose zu sehen.
4. Zeitraffer-Bildanalyse zur Bestimmung des Metaphasen-Timings und des mitotischen Zellschicksals nach mitotischen Spindelstörungen
HINWEIS: Führen Sie die Bildanalyse mit einer Bildaufnahmesoftware (Tabelle der Materialien), ImageJ oder einer vergleichbaren Bildanalysesoftware durch.
- Visualisieren Sie RFP-H2B mit Chromatin, indem Sie die Bilder auswählen, die mit dem RFP-Filterwürfel aufgenommen wurden. Identifizieren Sie eine Zelle, die mitosis eintritt, wie durch die anfängliche Chromatinverdichtung(Abbildung 2C, blaue Pfeilspitze) und die Kernhülle unterbrochen (wenn die Kerngrenze nicht mehr ausgeschlossen ist).
- Bestimmen des mitotischen Timings der Metaphasenausrichtung und des Anaphasenbeginns in einzelnen Zellen: Verfolgen Sie die Zelle durch aufeinander folgende Zeitpunkte im erworbenen Film, um die Anzahl der Zeitpunkte/Minuten vom mitotischen Eintrag bis zum RFP-H2B-markierten Chromatin zu bestimmen. vervollständigt die Ausrichtung am Zelläquator während der Metaphase(Abbildung 2C, gelbe Pfeilspitze).
- Um das mitotische Timing, die mitotische Treue und das Zellschicksal zu überwachen, verfolgen Sie die Zelle weiterhin durch aufeinander folgende Zeitpunkte, um die Zeitkoordinate zu identifizieren, bei der die Anaphasen-Chromosomensegregation sichtbar ist(Abbildung 2C, weiße Pfeilspitze) und/oder wo Chromatin-Dekomprimierung und Kernhüllen-Reformation (wie durch Tubulin-Ausschluss aus dem Kern angegeben) eingetreten ist.
HINWEIS: Störungen in der Spindelbaugruppe oder mitotischen Progression können als Funktion der Zeit beurteilt werden, die erforderlich ist, um eine bipolare mitotische Spindel zu erhalten und eine vollständige Chromosomenausrichtung zu erreichen oder die Anaphasen-Chromosomentrennung zu vollenden. - Visualisieren Sie RFP-H2B, um Zellen in jeder Population zu identifizieren, die mitotische Defekte aufweisen, einschließlich verzögerter Chromosomen und Chromatinbrücken während der Anaphasen-Chromosomensegregation.
HINWEIS: Kompromittierte mitotische Treue kann auch zu mehrninierten oder mikronukleierten Tochterzellen führen und kann in Zellen postmitotischen Austritt visualisiert werden, wie in Abbildung 3.
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Representative Results
Bewertung der mitotischen Progression in Gegenwart von Spindelstörungen
Die Regelung der Spindelpolfokussierung ist ein wesentlicher Schritt in der richtigen bipolaren Spindelbildung. Störung in diesem Prozess durch Proteinabbau, Medikamentenhemmung oder Veränderungen in der Zentromitenzahl korrupte Spindelstruktur und Verzögerung oder Stopp der mitotischen Progression10,11,12,13. Dennoch verzögern einige Störungen nur vorübergehend die Spindelbildung, wobei Zellen letztlich durch Mitose zur Vervollständigung der Anaphasen-Chromosomensegregation14führen. In Ermangelung von Zellsynchronisationsansätzen, die sich selbst indirekt auf die mitotischen Prozesse1,2auswirken können, fortschreiten die Zellen durch Mitose asynchron (Abbildung 2C). Mit RFP-H2B zur Identifizierung von Chromatin können mitotische Zellen mit kompaktem Chromatin als prometaphase (die vor der vollständigen Metaphasenausrichtung: Abbildung 2C, blaue Pfeilspitzen), Metaphase (vollständige Chromosomenausrichtung: Abbildung 2 C, gelbe Pfeilspitzen) und Anaphase (Chromosomen werden zu Spindelstangen getrennt: Abbildung 2C, weiße Pfeilspitzen). Die Erfassung von 5-8 Koordinaten über 4 h reicht aus, um das Fortschreiten von mindestens 50 Zellen durch Mitose in einem bestimmten Zustand zu verfolgen. Zur Untersuchung der Dynamik der Spindelbaugruppe nach Veränderungen der Zentromomzahl und/oder Hemmung der Aurora-A-Kinase, einem wichtigen Regler für Spindelpolfokussierung14,15,16, 17, wir verwendeten die Live-Zell-Zeitraffer-Bildgebung von menschlichen Zellen mit 2 Zentrosomen, oder solche, die überzählige Zentrosomen enthalten. Die Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit des Aurora-A-Kinase-Inhibitors vor Beginn der Bildgebung kultiviert. Zellen mit 2 Zentrosomen erleben die Störung der mitotischen Progression, wenn sie mit aurora A Kinase-Inhibitor behandelt werden, sind aber letztlich in der Lage, eine Metaphasen-Chromosomausrichtung zu erreichen(Abbildung 2C, gelbe Pfeilspitze). Im Gegensatz dazu sind Zellen mit >2 Zentrosomen exquisit empfindlich gegenüber Aurora A Hemmung und weisen eine Zunahme der Prometaphasenzellen und das Fehlen von Metaphasenzellen auf, was auf eine Verzögerung der Spindelmontage und mitotischen Progression hindeutet.
Abbildung 3 zeigt, dass solche Zeitraffer-Bildgebungsansätze ausreichen, um sowohl die Spindelbaugruppe als auch die mitotische Genauigkeit zu überwachen. Durch die Visualisierung von '-tubulin-EGFP wurde beobachtet, dass Zellen, die spindellösen (hier aufgrund der zentromsomen Überduplikation dargestellt) eine dynamische Veränderung erfahren, wenn die Spindelpolfokussierung erreicht wird und eine bipolare mitotische Spindel zur Vorbereitung auf Zellteilung. Gleichzeitig mit der Spindelbaugruppe kann die Chromosomenbewegung mit RFP-H2B visualisiert werden, um die Chromosomenausrichtung und Seigerungstreue zu bewerten. Mitotische Zellen, die eine transiente Spindelmultipolarität erleben, sind anfällig für Befestigungsfehler, die zu verzögerten Chromosomen während der Anaphase führen und in der nachfolgenden G1-Phase des Zellzyklus Mikrokerne bilden. Solche Defekte sind bei diesen Live-Zell-Bildgebungsansätzen offensichtlich.
Veränderungen im dynamischen Fortschreiten der Mitose verändern das mitotische Timing und wirken sich auf das schicksalnde mitotische Zell aus
Nach dem Kernschlagabbau können Spindelbildung und Chromosomenbewegung durch die Phasen der Mitose verfolgt werden, um die mitotische Progression, die Dauer und das Schicksal von Zellen zu beurteilen, die in eine Anaphase vorankommen. Centrosome Amplifikation, ein Merkmal, das bei vielen Krebsarten häufig ist, zeichnet sich durch das Vorhandensein von zusätzlichen Zentrosomen und multipolarer Spindelbildung18,19,20aus. Da multipolare Teilungen zu hoch aneuploiden und wahrscheinlich nicht lebensfähigen Tochterzellen führen, clustern Krebszellen aktiv zusätzliche Zentroide zu einer bipolaren Spindel und durchlaufen eine bipolare Division5,20,21, 22,23,24. Mit Hilfe von Live-Zell-Bildgebungsansätzen zeigen unsere repräsentativen Ergebnisse, dass Zellen mit einem normalen Zentromomgehalt in der Lage sind, vom Kernhüllenabbau durch Metaphasenausrichtung und Anaphasenbeginn zu einer bipolaren Teilung in weniger als 30 Minuten zu gelangen ( Abbildung 4 A,D,E). In Gegenwart von zusätzlichen Zentrosomen sind fast 50% der Zellen in der Lage, eine transiente multipolare mitotische Spindel zu überwinden und eine bipolare Spindel und eine vollständige Zellteilung zu bilden (Abbildung 4C,D). Die übrigen Zellen sind nicht in der Lage, eine bipolare Spindel zu erreichen und als Ergebnis mitose durch eine multipolare Teilung zu beenden (Abbildung 4B,D). Unabhängig davon, ob die Spindelbipolarität erreicht wird, weisen Zellen mit zusätzlichen Zentrosomen eine signifikant erhöhte Mitosedauer im Vergleich zu Zellen mit 2 Zentromiten auf, was darauf hindeutet, dass die Dynamik der mitotischen Progression auch dann verändert werden kann, wenn mitotische Ergebnisse sind nicht ersichtlich (Abbildung 4E).
Abbildung 1: Auswahl der Mikroskop- und Kameraparameter. (A) Darstellung des Fensters zur Auswahl des gewünschten Objektivs und des entsprechenden Filterwürfels mithilfe einer Bildaufnahmesoftware. Gezeigt wird die Auswahl des 20-fachen Vergrößerungsobjektivs und des Hellfeldfilterwürfels. (B) Zellen in der Probenplatte werden gefunden und mittels Hellfeld- oder Phasenkontrastmikroskopie in den Fokus gerückt. (C) Darstellung des Fensters zum Festlegen von Belichtungsparametern für jede Bildaufnahme. Pixelbinning kann bei Bedarf verwendet werden, um die Belichtungszeit pro Aufnahme zu reduzieren und Fotoschäden an Zellen zu minimieren. Die Maßstabsleiste beträgt 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bildaufnahme und Analyse der Zeitraffermikroskopie. (A und B) Darstellung des Fensters, das angibt, wie Bildaufnahmeparameter mit NIS Elements HCA Jobs Bildaufnahmesoftware eingestellt werden. Diese Software ermöglicht Multi-Koordinaten, Multi-Well-Bildgebung im Laufe der Zeit. Jeder Auftrag kann geändert werden, um Bohrungen und Koordinaten anzugeben, die erfasst werden sollen. (C) Einzelzeitrahmen aus vier Bedingungen eines Experiments. RFP-H2B wird verwendet, um Chromatin zu verfolgen. Chromatinverdichtung und Positionierung werden verwendet, um verschiedene Stadien der Mitose zu identifizieren: Prometaphase (Verdichtung in Abwesenheit der Chromosomenausrichtung, blaue Pfeilspitze), Metaphase (vollständige Chromosomausrichtung am Zelläquator, gelbe Pfeilspitze) und Anaphase (nach Einleitung der synchronen Chromosomensegregation, weiße Pfeilspitze). Die Maßstabsleiste ist 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Zeitraffer-Bildgebung visualisiert Defekte in der mitotischen Genauigkeit. Zellen, die zusätzliche Zentrosomen enthalten, bilden multipolare Spindeln und gruppieren sie oft zu einer bipolaren Spindel, bevor sie die Zellteilung abschließen. Hier tritt eine Zelle mit sieben unterschiedlichen Spindelstangen (weiße Sternchen) ein, die im Laufe der Zeit in zwei Hauptspindelpole gruppiert sind. An diesem Punkt sind Chromosomen in der Lage, entlang des Spindeläquators auszurichten, und die Zelle geht zur Anaphase über. Die transiente Multipolarität hat eine mal anbringende eines einzelnen Chromosoms ermöglicht. Dieser ungelöste Fehler führt zu einem verzögerten Chromosom während der Anaphase, das in einem Mikrokern in einer Tochterzelle (mit einem Pfeil beschriftet) eingearbeitet wird. Chromatin wird mit RFP-Histone 2B visualisiert und Mikrotubuli werden mit dem '-Tubulin-EGFP visualisiert. Zeitstempel in jedem Panel geben Protokolle in Bezug auf den scheinbaren Kernhüllenzusammenbruch an, der durch den Nachweis von Tubulin innerhalb der nuklearen Grenze beurteilt wird. Die Maßstabsleiste ist 5 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Veränderungen im dynamischen Fortschreiten der Mitose verändern das mitotische Timing und wirken sich auf das schicksalt der mitotischen Zell aus. RFP-H2B, rot dargestellt, wird verwendet, um Chromatin-Bewegung zu verfolgen und ,Tubulin-GFP, in grün dargestellt, wird verwendet, um Zentroso/Spindel-Pol-Nummer und Organisation zu überwachen. Der Verlust des GFP-Tubulin-Ausschlusses aus dem Zellkern, gleichzeitig mit der frühen Chromatinverdichtung, ist ein Hinweis darauf, dass die Kernhülle (NEB) in Vorbereitung auf die mitotische Zellteilung abgebaut wurde. Der nukleare Ausschluss von GFP-Tubulin ist beim mitotischen Ausstieg und der Reformierung des nuklearen Umschlags offensichtlich. (A) Eine Zelle mit zwei Zentrosomen bildet eine bipolare Spindel und entwickelt sich durch anaphase zu zwei Tochterzellen. (B und C) Zellen mit zusätzlichen Zentrosomen geben Mitose ein, um eine multipolare Spindel zu bilden. (B) Einige dieser Zellen mit zusätzlichen Zentrosomen verzögern sich bei der Mitose, ohne eine bipolare Spindel zu erreichen und fortschritten, eine multipolare Anaphase zu vollenden. (C) Andere Zellen mit zusätzlichen Zentrosomen weisen eine vorübergehende Verzögerung der mitotischen Progression auf, während sie zusätzliche Zentrosomen bündeln, um eine bipolare Anaphase zu ermöglichen. (D) Zellen mit zusätzlichen Zentrosomen sind in der Lage, eine bipolare Teilung etwa 50% der Zeit zu durchlaufen, während die verbleibenden Zellen mit zusätzlichen Zentrosomen einer multipolaren Teilung unterzogen werden. (E) Zellen mit zusätzlichen Zentrosomen haben unabhängig vom eventuellen mitotischen Schicksal (bipolare oder multipolare Anaphase) ein erhöhtes mitotisches Timing. Die Maßstabsleiste ist 5 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die zeitliche Auflösung der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung und Bewertung sequenzieller zellulärer Ereignisse innerhalb einzelner Zellen. Ansätze, die die zelluläre Synchronisierung nutzen, gefolgt von der Erfassung und Fixierung von Zellen zu sequenziellen Zeitpunkten, sind insofern begrenzt, als Vergleiche zwischen Gruppen von Zellen durchgeführt werden. In Kontexten, in denen die zelluläre Reaktion auf Störungen ungleichmäßig sein kann oder in denen der zu visualisierte Prozess dynamisch ist, ist die Live-Zell-Zeitraffer-Bildgebung besser in der Lage, sowohl die Dynamik einzelner Zellen als auch die Heterogenität zu verfolgen und zu analysieren. innerhalb einer Zellpopulation. Auf diese Weise ist die Zeitraffer-Bildgebung besonders nützlich, um die Zellprogression durch die dynamischen Stadien der Mitose zu überwachen und zu beurteilen, wie Störungen dieser Progression letztlich die Genauigkeit der mitotischen Zellteilung und das anschließende Zellschicksal beeinflussen.
Obwohl es eine Reihe von Vorteilen für die Bildgebung von Lebenden Zellen gibt, sind erhebliche Herausforderungen verbunden, die berücksichtigt und nach Möglichkeit gemildert werden müssen. Eine Herausforderung besteht darin, geeignete Umweltbedingungen aufrechtzuerhalten, um die Zelllebensfähigkeit und Proliferation während der Bildgebung zu gewährleisten. Um dies zu erreichen, muss die Bildgebung eine Umweltkammer enthalten, die sowohl Temperatur als auch CO2 reguliert. Alternativ können Zellen kurzfristig mit nur Temperaturregulierung abgebildet werden, wenn dies in einer geschlossenen Kammer geschieht. In beiden Fällen sollte die Verwendung einer Antivibrationstabelle und/oder hardwarebasierter Ansätze zur Abschwächung axialer Fokusschwankungen (z. B. Nikons Perfect Focus) verwendet werden, um den Plattenfokus während der gesamten Dauer des Experiments beizubehalten. Ein zweites wichtiges Problem bei der Live-Zell-Bildgebung ist das Potenzial für Photoschäden und Photobleichungen. Photobleaching ist ein Problem, bei dem das abgebildete Fluorophor mit fortschreitender Bildgebung allmählich an Fluoreszenzintensität abnimmt. Die Exposition gegenüber hochintensivem Anregungslicht, das zu Photobleichungen führt, ist jedoch auch für Zellen toxisch, und es muss darauf geachtet werden, die Zellexposition durch verringerte Belichtungszeiten, Bildaufnahmeintervalle und die Gesamtdauer der Bildsequenz zu minimieren. 25. Die Folgen der Nichtoptimierung der bildgebenden Bedingungen zur Minimierung der Phototoxizität können die Erzeugung von DNA-Schäden und andere zelluläre Veränderungen umfassen, die wiederum die Interpretation und das Verständnis des Experiments beeinträchtigen können. Sollte die Zelllebensfähigkeit zu einem Problem bei der Langzeitbildgebung werden, sollte anstrengungiert werden, um Pixel-Binning zu nutzen (um kürzere Belichtungen zu ermöglichen) und die Dauer zwischen nachfolgenden Bildaufnahmen zu erhöhen. Eine weitere Sorge ist, dass das fluoreszierende Tag das Verhalten des Proteins verändern kann, mit dem es verschmolzen wird, oder dass die Integration des viralen Expressionskonstrukts in das Genom selbst das zelluläre Verhalten beeinflussen kann. Um der Möglichkeit Rechnung zu tragen, dass die Hinzufügung eines fluoreszierenden Tags die Proteinfunktion beeinträchtigen kann, ist eine Bewertung der Proteinfunktion nach dem Hinzufügen eines N- oder C-Terminalfluoreszenz-Tags und ein Vergleich mit einer nicht markierten Proteinfunktion erforderlich. Um festzustellen, ob durch die Störung des genomischen Lokus, in den das virale Konstrukt integriert wurde, nachteilige Auswirkungen auf das Zellverhalten auftreten, sollten mehrere Einzelzellklone abgeleitet werden, verglichen mit Zellen, denen das markierte Protein fehlt, und getestet werden, um dass die zelluläre Fitness und die mitotische Progression nicht gestört sind. Alternativ können abgesetzte Effekte der zufälligen Integration des viralen Expressionskonstrukts durch gezielte Integration des Fusionsproteins in den endogenen Ort oder andere bekannte Regionen des Genoms mit CRISPR-basierten Ansätzen abgemildert werden.
Ansätze zur Identifizierung und Charakterisierung wichtiger Regulatoren der mitotischen Progression haben sich stark auf die Bildgebung fester Zellen verlassen. Mitotische Regulatoren, die auf diese Weise identifiziert wurden, wurden in der Folge in Therapeutika genutzt, die auf schnell sich ausbreitende Krebszellen7,8,9abzielen. Antimitotische Medikamente funktionieren jedoch nicht immer einheitlich bei verschiedenen Krebsarten, und in vielen Fällen bleiben die Einsichten in die mitotischen Phänotypen, die entweder erfolgreichen oder erfolglosen chemotherapeutischen Ansätzen vorausgehen, unklar. Live-Zell-Zeitraffer-Bildgebung zur Verfolgung von Mitotischen Zellen in Gegenwart und Abwesenheit von Spindel-störenden Medikamenten hat das Potenzial, die notwendige Einsicht zu liefern, um die Modulatoren zu identifizieren, die am ehesten zu katastrophalen Mitosen und einer beeinträchtigten Lebensfähigkeit von Krebszellen mit minimalen Auswirkungen auf normale Zellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
DLM wird von einem NSF-GRFP unterstützt. ALM wird durch fördermittelweise aus dem Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
