Summary
هنا نقدم بروتوكول لتقييم ديناميات تشكيل المغزل والتقدم الميتومي. لدينا تطبيق التصوير الفاصل الزمني تمكن المستخدم من تحديد الخلايا في مراحل مختلفة من المنوّد، وتتبع وتحديد العيوب الميتوتيكية، وتحليل ديناميات المغزل ومصير الخلية الميتومية عند التعرض للأدوية المضادة للميثوتيك.
Abstract
التصوير الحي بالفاصل الزمني للخلايا هو أداة هامة في بيولوجيا الخلايا التي توفر نظرة ثاقبة في العمليات الخلوية التي قد يتم تجاهلها أو إساءة فهمها أو إساءة تفسيرها من خلال تحليل الخلايا الثابتة. في حين أن التصوير والتحليل في الخلايا الثابتة قويويكفي لمراقبة الحالة الخلوية الثابتة، إلا أنه يمكن أن يكون محدوداً في تحديد ترتيب زمني للأحداث على المستوى الخلوي وغير مجهز لتقييم الطبيعة العابرة للعمليات الديناميكية بما في ذلك التقدم الميتومي. وعلى النقيض من ذلك، فإن التصوير بالخلايا الحية هو أداة بليغة يمكن استخدامها لمراقبة العمليات الخلوية على مستوى الخلية الواحدة مع مرور الوقت، ولديه القدرة على التقاط ديناميات العمليات التي لولا ذلك لكانت ممثلة تمثيلاً ضعيفاً في تصوير الخلايا الثابتة. هنا نقوم بوصف نهج لتوليد الخلايا التي تحمل علامات الفلورسنت المسمى من الكروماتين والأنابيب الدقيقة واستخدامها في نهج التصوير بالخلايا الحية لرصد محاذاة الكروموسوم المرحلة الفوقية والخروج الميتوتيك. نحن نصف التقنيات القائمة على التصوير لتقييم ديناميات تشكيل المغزل والتقدم الميتومي، بما في ذلك تحديد الخلايا في مراحل مختلفة في المنوّج، وتحديد وتتبع العيوب الليتوتيكية، وتحليل ديناميات المغزل و مصير الخلية المصوّلة بعد العلاج مع مثبطات ميتوتيك.
Introduction
ويشيع استخدام التحليل القائم على الصورة للخلايا الثابتة لتقييم التغيرات في مستوى سكان الخلايا استجابة لمختلف الاضطرابات. عند دمجها مع مزامنة الخلايا، متبوعة بجمع وتصوير نقاط الوقت التسلسلية، يمكن استخدام هذه الأساليب لاقتراح تسلسل خلوي للأحداث. ومع ذلك، فإن التصوير بالخلايا الثابتة محدود من حيث أن العلاقات الزمنية ضمنية للسكان ولا تظهر على مستوى الخلايا الفردية. وبهذه الطريقة، في حين أن تصوير الخلايا الثابتة وتحليلها يكفيان لمراقبة الأنماط الظاهرية القوية والتغيرات في الحالة الثابتة، فإن القدرة على الكشف عن التغيرات العابرة مع مرور الوقت والتغيرات التي تؤثر فقط على مجموعة فرعية من الخلايا غير كاملة. وعلى النقيض من ذلك، فإن التصوير بالخلايا الحية هو أداة بليغة يمكن استخدامها لمراقبة العمليات الخلوية ودون الخلوية داخل خلية واحدة، أو السكان الخلويين، مع مرور الوقت ودون مساعدة من نهج التزامن التي قد تؤثر في حد ذاتها على السلوك الخلوي 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
تشكيل المغزل الميتومي ثنائي القطب ضروري للفصل الكروموسومي السليم أثناء انقسام الخلايا، مما أدى إلى خليتين ابنة متطابقة وراثيا. العيوب في بنية المغزل الميتومية التي تؤدي إلى تلف التقدم الميتومي واختراق دقة فصل الكروموسوم يمكن أن تؤدي إلى انقسامات الخلايا الكارثية وانخفاض قدرة الخلايا على البقاء. لهذا السبب، السموم الميتوتيكية التي تغير تشكيل المغزل هي العلاجات الواعدة للحد من الانتشار السريع للخلايا السرطانية7،8،9. ومع ذلك، فإن تحليل الخلايا الثابتة لهيكل المغزل بعد إضافة السموم الميتوتيكية محدود في قدرته على تقييم العملية الديناميكية لتكوين المغزل وقد لا يشير إلى ما إذا كانت التغيرات الملاحظة في بنية المغزل دائمة أو هي بدلا من ذلك عابرة ويمكن التغلب عليها للسماح تقسيم الخلايا الناجحة.
في هذا البروتوكول، نقوم بوصف نهج لتقييم ديناميات الميثوس بعد اضطرابات المغزل عن طريق التصوير بالخلايا الحية. باستخدام خط الخلية RPE-1 الخالدة hTERT هندستها للتعبير عن الهستون 2B ذات العلامات RFP لتصور الكروماتين، جنبا إلى جنب مع EGFP الموسومة α-tubulin لتصور microtubules، وتوقيت محاذاة الكروموسوم metaphase، بداية الطور، وفي نهاية المطاف يتم تقييم مصير الخلية المصوّلة باستخدام الإشارات البصرية لحركة الكروموسوم، والضغط، والمورفولوجيا النووية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليد خلايا hTERT-RPE-1 تعبر بشكل ملحوظ RFP-Histone 2B (RFP-H2B) وα-tubulin-EGFP (الحوض-EGFP)
ملاحظة: تتبع جميع الخطوات تقنيات العقيم وتجري في خزانة أمان من المستوى الثاني+ (BSL2+).
- توليد الفيروسات الرجعية تحمل الجينات ذات الأهمية (α-tubulin-EGFP و RFP-H2B) عن طريق التغوط من الخلايا 293T مع بلازميدات اللينفيروسي مناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لنظام تسليم التغوط القائم على الدهون.
- اليوم 1: استخدام ماصة باستور الزجاج المتاح لاستنشاق السائل ثقافة الخلية من لوحة من الخلايا تحت اللتحقيق ة 293T وغسل قبالة المتوسطة المتبقية مع الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) عن طريق إضافة 5 مل من PBS. دوامة لتوزيع PBS على أسفل لوحة، ثم يستنشق PBS مع ماصة باستور الزجاج المعقمة القابل للتصرف.
- إضافة 2 مل من 0.05٪ تريبسين التي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية وإعادة لوحة إلى حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 2 إلى 5 دقائق للسماح للخلايا الملتصقة ليتم تحريرها من سطح طبق ثقافة الخلية.
- إضافة 8 مل من دولبكو الطازجة تعديل النسر المتوسط (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / العقديات إلى لوحة تحتوي على التربسين.
- إعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف ونقل التعليق إلى أنبوب مخروطي معقمة 15 مل. ضع الأنبوب المخروطي في جهاز طرد مركزي متوازن والدوران في 161 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه بلطف الخلايا.
- يستنشق الحل المتوسط / التربسين من الخلايا الكريات وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل من DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / العقديات. استخدام مقياس الهيموجيتومتر لحساب تعليق الخلية 293T ولوحة 2 × 106 293T الخلايا لكل بئر من لوحة بئر 6.
- خلايا الثقافة في حجم إجمالي 2 مل من دولبكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / العقديات والحفاظ عليها في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- اليوم 2: ماصة 7 ميكرولتر من كاشف تسليم التغوط القائم على الدهون و 100 ميكرولتر من المصل المنخفض المتوسط في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل والسماح لها باحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (أنبوب #1).
- في أنبوب منفصل للطرد المركزي الصغير بقدرة 1.5 مل، ماصة 1 ميكروغرام من ناقلات التعبير RFP-H2B (أو 1 ميكروغرام من متجه التعبير α-tubulin-EGFP)، جنبا إلى جنب مع 5 ميكرولتر محسن كاشف (كما هو مطلوب وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة)، 0.5 ميكروغرام pMD2.G، و 1 ميكروغرام psPAX2 و 100 ميكرولتر من خفض المصل المتوسطة (أنبوب #2).
- الجمع بين محتويات الخطوة 1.1.7 والخطوة 1.1.8 عن طريق أنبوب الأنابيب بعناية #2 في أنبوب #1 وحضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن تحجيم رد الفعل حسب الحاجة لتبديل الخلايا في آبار إضافية. - ماصة رد فعل الانفص يُسقط إلى البئر المطلوب الذي يحتوي على خلايا 293T في 2 مل من المتوسط وإرجاع الطبق إلى الحاضنة المرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
ملاحظة: لإنشاء خلايا تعبر عن كل من RFP-H2B و α-tubulin-EGFP إنشاء فيروس منفصل لكل إنشاء تعبير (الخطوات 1.1.7-1.1.9). - اليوم 3: يستنشق واستبدال المتوسط مع 2 مل من DMEM الطازجة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / العقديات. إعادة الطبق إلى حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- اليوم 4: جمع المتوسطة التي تحتوي على جزيئات الفيروس أعرب، مع توخي الحذر عدم تعطيل أو إزالة الخلايا 293T. تصفية المتوسطة التي تحتوي على جزيئات الفيروس عن طريق تمريرها من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر تعلق على حقنة 5 مل. فيروس Aliquot للتخزين على المدى القصير في 4 درجة مئوية، أو تخزين على المدى الطويل في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: الجسيمات الفيروسية التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة ستكون موجودة في مجموعة من ~ 1 × 107 إلى 1 × 108 وحدات Transducing / مل. وبما أن الخلايا والخلايا المنتجة للفيروسات التي ستصاب بالعدوى تُستثَل َّ في نفس الوسط، فإن التركيز الفيروسي لاستبدال المتوسّطة غير مطلوب، ويمكن استخدام الجسيمات الفيروسية المصفاة مباشرة لإصابة الخلايا. - البذور 2 × 105 خلايا hTERT-RPE-1 في بئر من طبق 6 جيدا استعدادا للعدوى الفيروسية. خلايا الثقافة في 2 مل من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / العقديات والحفاظ عليها في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- اليوم 5: إضافة بروميد سداسي الديمثيرين (على سبيل المثال، البولي بيرين) إلى خلايا hTERT-RPE-1 إلى تركيز نهائي قدره 8 ميكروغرام/مل. تصيب الخلايا بخليط من 500 درجة مئوية من الفيروس المخفف في 500 ميكرولتر من متوسط ثقافة الخلية.
ملاحظة: يتم إعداد محلول مخزون بروميد سداسي الديمثيرين في الماء المقطر المعقمة، ثم تصفيته من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. - اليوم 6: باستخدام ماصة باستور الزجاج المتاح، يستنشق المتوسطة من الآبار التي تحتوي على الخلايا المصابة بالفيروس. استبدال وسط ثقافة الخلية مع 2 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / العقديات، وتركيزات مناسبة من المضادات الحيوية لاختيار لدمج بلازميد والتعبير.
ملاحظة: يحمل تعبير α-tubulin-EGFP plasmid المستخدم في التجارب الموصوفة جين مقاومة البوروميسيسين ويحمل بلازميد التعبير RFP-H2B جين مقاومة بوبيتشيدين. ولذلك، يتم استخدام 10 ميكروغرام / مل من البوروميسين و 2 ميكروغرام / مل من blasticidin لاختيار α-tubulin-EGFP، RFP-H2B التعبير عن خلايا hTERT RPE-1. قد تختلف تركيزات المضادات الحيوية المستخدمة في الاختيار لخطوط الخلايا المختلفة المستخدمة. - الحفاظ على الخلايا تحت اختيار المضادات الحيوية لمدة 5-7 أيام، واستبدال المتوسطة كل 3 أيام مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على الكواشف الاختيار المناسبة.
ملاحظة: ينبغي الاحتفاظ بالخلايا عند الالتقاء الفرعي أثناء الاختيار وينبغي توسيعها حسب الحاجة، على النحو المبين في الخطوات 1-1-1 إلى 1-1-4. - استخدام التصوير المناعي لتأكيد التعبير عن المنشآت الموسومة.
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن اشتقاق نسخ خلية واحدة للحصول على مستويات تعبير موحدة داخل مجموعة الخلايا. بمجرد تأكيد الحيوانات المستنسخة المستقرة، يمكن الحفاظ على الخلايا في ظل ظروف الثقافة القياسية في غياب اختيار المضادات الحيوية.
2. إعداد الخلايا لتصوير الخلايا الحية بعد اضطرابات المغزل الميتومي
ملاحظة: استخدام تقنيات العقيم وتنفيذ الخطوات في خزانة أمان BSL2.
- باستخدام ماصة باستور الزجاجية المعقمة التي يمكن التخلص منها، يستنشق الوسيلة من لوحة الثقافة التي تحتوي على خط الخلية الذي يحمل بنية (ق) التعبير (من الخطوة 1.7). غسل الخلايا لفترة وجيزة مع 10 مل من PBS معقمة. دوامة لتوزيع PBS على أسفل لوحة، ثم يستنشق PBS مع ماصة باستور الزجاج المعقمة القابل للتصرف.
- أضف 2 مل من 0.05% تريبسين إلى لوحة 10 سم. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة أو حتى الخلايا قد انفصلت عن سطح اللوحة.
- إضافة 8 مل من المتوسطة الطازجة إلى لوحة تحتوي على التربسين. إعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف ونقل التعليق إلى أنبوب مخروطي معقمة 15 مل. ضع الأنبوب المخروطي في جهاز طرد مركزي متوازن والدوران في 161 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه بلطف الخلايا.
- يستنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق في 10 مل من PBS عن طريق الأنابيب بلطف مع ماصة المصلية 10 مل. ضع الأنبوب المخروطي في جهاز طرد مركزي متوازن والدوران في 161 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه بلطف الخلايا.
- يستنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق في 10 مل من المتوسطة الطازجة عن طريق الأنابيب بلطف مع ماصة المصلية 10 مل.
- عد الخلايا، ثم حساب رقم الخلية باستخدام مقياس الهسة وتخفيف إلى تركيز 1-2 × 105 خلايا / مل في وسط ثقافة الخلية. البذور 500 درجة مئوية من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة قاع التصوير المعقمة 12 جيدا. وضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية والسماح للخلايا التمسك سطح اللوحة.
ملاحظة: يتطلب التصوير بالخلايا الحية أن تكون الخلايا ملتزمة بشكل جيد بحيث تظل مرتبطة بمستوى التصوير أثناء الحصول على الصور. يمكن أن تختلف مدة الوقت اللازم للخلايا للتمسك بالطلاء التالي من خط خلية إلى آخر، وينبغي تحسينها لخط الخلية قيد الدراسة. - ما يصل إلى 30 دقيقة قبل بدء التصوير بالفاصل الزمني، إضافة تركيز ذات الصلة من دواء ميتوتيك إلى واحد أو أكثر من الآبار المصنفة مع الخلايا. لحساب التأثير المحتمل للالمذيب العضوي على السلوك الخلوي، إضافة حجم متساو من مادة مخففة المانع إلى الخلايا كضوابط. على سبيل المثال، تأكد من أن إضافة 100 nM من مثبط معين من الكيناز الشفق A (على سبيل المثال، alisertib) موازية لحجم متساو من DMSO، ومخفف لهذا الدواء، في بئر التحكم في الخلايا.
ملاحظة: يتطلب التحليل المقارن للتغيرات الدينامية في التطور الميتوتيك إعداد آبار الخلايا في غياب الاضطرابات لتمكين تصوير الميتوس العادي بالتوازي مع الظروف التجريبية.
3. المجهر إعداد لتصوير الفاصل الزمني من RFP-H2B، α-tubulin-GFP التعبير عن الخلايا(الشكل 1، الشكل 2)
- ضع لوحة ثقافة الخلية التي تحتوي على RFP-H2B، α-tubulin-GFP تعبر عن خلايا hTERT RPE-1 ليتم تصويرها في إدراج مرحلة مناسبة على مجهر إبيفلوورسينم المقلوب الذي تم تجهيزه بكاميرا عالية الدقة (حجم بكسل من 0.67 ميكرومتر في 20x)، وهو عبارة عن غرفة البيئية تسخينها إلى 37 درجة مئوية، ونظام التسليم لترطيب 5٪ CO2.
ملاحظة: إما أن تكون الغرف البيئية المغلقة أو إدراج اتّصال يُالتحكم في درجة الحرارة مناسباً شريطةأن يتم تسليم درجة حرارة 2 رطبة بنسبة 5% والحصول على درجة حرارة مستقرة. - استخدم هدف هواء 20 x مع فتحة عددية تبلغ 0.5 ومجهزة للتباين العالي التباين وتباين المرحلة أو التصوير بالحقول الساطعة. عرض الخلايا مع تباين المرحلة أو brightfield وضبط المسار والتركيز الدقيق على المجهر لجعل الخلايا في التركيز.
- تحديد وتحديد أوقات التعرض المثلى لاقتناء صورة brightfield وGFP وRFP عن طريق اختيار مكعب الفلتر المعني مع الإثارة والانبعاثات المناسبة للفلوروفور التي سيتم تصويرها. بدلاً من ذلك، انقر فوق زر التعرض التلقائي لإدخال وقت تعرض محدد مسبقًا. إذا لم تكن الإشارة مكثفة بما فيه الكفاية، حدد التوفير بكسل لتمكين أوقات التعرض أقصر عن طريق النقر على علامة التبويب binning واختيار 2 × 2 بكسل من القائمة المنسدلة.
ملاحظة: السمية الضوئية يمكن أن تعوق تطور الميثوتيك وجدوى الخلية. قد يكون فشل الخلايا المصوّلة في مجموعات التحكم في إكمال الميتوس العادي مؤشراً على أن أوقات التعرض و/أو مدة التصوير تحتاج إلى مزيد من التحسين. - استخدم برنامج الاكتساب والتحليل الذي يمكّن من الحصول على التصوير متعدد الإحداثيات والآبار في وقت واحد وتحديد المعلمات الخاصة بالحصول على الصورة.
- حدد ومعايرة مرحلة المجهر إلى طبق متعدد الآبار، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم برنامج الحصول على الصور لتمييز الآبار التي سيتم تصويرها أو تحديدها بالنقر على الآبار ذات الصلة في الرسم التخطيطي لتنسيق اللوحة المستخدمة.
- ضمن لوحة التحكم GeneratedPoints (الشكل 2)،حدد الإحداثيات داخل كل بئر سيتم تصويرها بالنقر فوق علامة التبويب موضع النقطة وتحديد موضع إحداثيات محدد مسبقًا أو عشوائي من القائمة المنسدلة. حدد علامة التبويب منطقة العمل وحدد مقيد من القائمة المنسدلة لتقييد منطقة تحديد الإحداثيات لاستبعاد حدود البئر. انقر فوق علامتي التبويب Count والتوزيع لتحديد عدد النقاط وتوزيعها ليتم التقاطها لكل بئر على التوالي.
ملاحظة: سيتم تحديد عدد الإحداثيات التي يمكن تصويرها لكل بئر ضمن زيادة النقطة الزمنية 5 دقيقة بعدد الآبار التي سيتم تصويرها، بالإضافة إلى وقت التعرض لكل قناة. عادة، إحداثيات 5-8 لكل بئر كافية لمراقبة ما لا يقل عن 50 خلية في كل حالة تقدم من خلال mitosis في غضون 4 ح. - حدد إدخال الفاصل الزمني والمدة لجمع الصور عن طريق النقر على القيم وإدخالها في لوحة تحكم TimeSequence.
ملاحظة: الحصول على الصور كل 1 إلى 5 دقائق هو مناسب لرصد ديناميات التقدم الميتومي. يجب أن تعكس المدة الإجمالية للتصوير نقطة النهاية المطلوبة ومعدل انتشار خط الخلية. على سبيل المثال، 4 ساعات كافية لرؤية العديد من الخلايا التقدم من خلال mitosis، 16 ساعة كافية لرؤية معظم الخلايا RPE-1 في تقدم السكان غير متزامن من خلال ميتوسي.
4. تحليل صورة الفاصل الزمني لتحديد توقيت المرحلة الفوقية ومصير الخلية الميتوتيكية بعد اضطرابات المغزل الميتوتيك
ملاحظة: إجراء تحليل الصورة باستخدام برنامج الحصول على صورة(جدول المواد)أو ImageJ أو برنامج تحليل الصور القابلة للمقارنة.
- تصور RFP-H2B المسمى كروماتين عن طريق تحديد الصور التي تم التقاطها مع مكعب فلتر RFP في مكانها. تحديد خلية تدخل الميطوس كما هو مبين في ضغط الكروماتين الأولي(الشكل 2C،رأس السهم الأزرق) والمغلف النووي تنهار (عندما α-tubulin-EGFP لم يعد مستبعدا من قبل الحدود النووية).
- تحديد التوقيت الميتوتيك لمحاذاة المرحلة الفوقية وبداية الطور في الخلايا الفردية: تعقب الخلية من خلال نقاط زمنية متتالية في الفيلم المكتسب لتحديد عدد النقاط الزمنية/الدقائق من الإدخال الميتوتيك حتى الكروماتين الذي يحمل علامة RFP-H2B يكمل محاذاة في خط الاستواء الخلية أثناء المرحلة الفوقية(الشكل 2C،رأس السهم الأصفر).
- لمراقبة التوقيت المصوّر، والإخلاص المصوّر، ومصير الخلية، استمرّ في تعقب الخلية من خلال نقاط زمنية متتالية لتحديد إحداثيات الوقت التي يكون فيها فصل كروموسوم الطور الظاهر(الشكل 2C،رأس السهم الأبيض) و/أو حيث تم إزالة ضغط الكروماتين وإصلاح المغلف النووي (كما هو مبين من قبل استبعاد توبولين من النواة) قد حدث.
ملاحظة: يمكن تقييم الاضطرابات في تجميع المغزل أو التقدم الميتومي كدالة للوقت اللازم للحصول على المغزل الميتومي ثنائي القطب وتحقيق محاذاة كروموسوم كاملة، أو لإكمال فصل كروموسوم الطور. - تصور RFP-H2B لتحديد الخلايا في كل السكان التي تظهر عيوب ميتوتيك بما في ذلك الكروموسومات المتخلفة والجسور الكروماتين أثناء فصل كروموسوم الطور.
ملاحظة: قد يؤدي الإخلاص المصوّر إلى خلايا ابنة متعددة النوى أو micronucleated ويمكن تصورها في الخلايا بعد الخروج المنطي، كما هو الحال في الشكل 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقييم التقدم الميتومي في وجود اضطرابات المغزل
تنظيم تركيز القطب المغزل هو خطوة أساسية في تشكيل المغزل ثنائي القطب السليم. تعطيل في هذه العملية من خلال استنفاد البروتين، وتثبيط المخدرات، أو التعديلات في عدد سنتروسوم تلف هيكل المغزل وتأخير أو وقف التقدم الميتومي10،11،12،13. ومع ذلك، فإن بعض الاضطرابات فقط تأخير عابر تشكيل المغزل مع الخلايا في نهاية المطاف المضي قدما من خلال ميتوسي لاستكمال فصل كروموسوم الطور14. في غياب نهج مزامنة الخلايا، والتي قد تؤثر في حد ذاتها بشكل غير مباشر على العمليات المصوية1،2، تقدم الخلايا من خلال mitosis بشكل غير متزامن (الشكل 2C). باستخدام RFP-H2B لتحديد الكروماتين، يمكن تنظيم الخلايا الميتوتيكية مع الكروماتين المضغوط على أنها في المرحلة الفوقية (تلك التي سبقت محاذاة المرحلة الفوقية الكاملة: الشكل 2C، رؤوس الأسهم الزرقاء)، المرحلة الفوقية (محاذاة كروموسوم كاملة: الشكل 2 C، رؤوس الأسهم الصفراء) وanaphase (الكروموسومات يجري فصلها نحو أعمدة المغزل: الشكل 2C، رؤوس الأسهم البيضاء). التقاط إحداثيات 5-8 أكثر من 4 ح يكفي لمتابعة تطور ما لا يقل عن 50 خلية من خلال ميتوسي في حالة معينة. للتحقيق في ديناميات الجمعية المغزل بعد التعديلات في عدد سنتروسوم و / أو تثبيط أورورا A كيناز، منظم مهم من القطب المغزل التركيز14،15،16، 17،استخدمنا التصوير الحي للخلايا الفاصلالزمني للخلايا البشرية مع 2 سنتروسوميس، أو تلك التي تحتوي على centrosomes فائقة. تم زراعة الخلايا في وجود أو عدم وجود مثبطات أورورا A كيناز قبل بدء التصوير. الخلايا مع 2 centrosomes تجربة اضطراب في التقدم الميتوتيك عند علاجها مع أورورا A كيناز المانع، ولكن في نهاية المطاف قادرة على تحقيق محاذاة الكروموسوم المرحلة الفوقية(الشكل 2C،رأس السهم الأصفر). وعلى النقيض من ذلك، فإن الخلايا ذات السنتروسوسوم اتّبع بشكل رائع تثبيط أورورا A وتظهر زيادة في خلايا المرحلة الفوقية وعدم وجود خلايا المرحلة الفوقية، مما يشير إلى حدوث تأخير في تجميع المغزل والتقدم الميتوتيك.
ويبين الشكل 3 أن نُهُج التصوير بالفاصل الزمني هذه كافية لرصد كل من تجميع المغزل والإخلاص الميتومي. من خلال تصور α-tubulin-EGFP، لوحظ أن الخلايا التي تعاني من اضطراب المغزل (كما هو موضح هنا بسبب الإفراط في الازدواجية المركزية) تخضع لتغيرات ديناميكية مع تحقيق تركيز القطب المغزل ويتم تشكيل المغزل الميتوبي ثنائي القطب استعدادا ل انقسام الخلية. بالتزامن مع تجميع المغزل، يمكن تصور حركة الكروموسوم مع RFP-H2B لتقييم محاذاة الكروموسوم وإخلاص الفصل. الخلايا الميتوتيكية التي تعاني من تعدد الأقطاب المغزل عابرة عرضة لأخطاء المرفقات التي تؤدي إلى الكروموسومات المتخلفة أثناء الطور وتشكل micronuclei في المرحلة اللاحقة G1 من دورة الخلية. هذه العيوب واضحة مع هذه النهج التصوير بالخلايا الحية.
التغيرات في التطور الديناميكي للميثوسي تغير التوقيت المصوّر وتأثير مصير الخلية المصوّرة
بعد انهيار المغلف النووي، يمكن تتبع تكوين المغزل وحركة الكروموسوم من خلال مراحل المنوّس لتقييم التقدم الميتومي، والمدة، ومصير الخلايا التي تتقدم إلى مرحلة. التضخيم المركز، وهي سمة شائعة في العديد من أنواع السرطان، ويتميز بوجود سنتروسوميس إضافية وتشكيل المغزل متعددة الأقطاب18،19،20. كما الانقسامات متعددة الأقطاب يؤدي إلى خلايا ابنة aneuploid للغاية ويحتمل أن تكون غير قابلة للحياة، والخلايا السرطانية تجمع بنشاط centrosomes اضافية لتشكيل المغزل ثنائي القطب والخضوع لتقسيم ثنائي القطب5،20،21، 22،23،24. باستخدام نهج التصوير بالخلايا الحية، تظهر النتائج التمثيلية لدينا أن الخلايا ذات المحتوى المركزي العادي قادرة على الانتقال من انهيار المغلف النووي من خلال محاذاة المرحلة الفوقية وبداية الطور لتحقيق انقسام ثنائي القطب في أقل من 30 دقيقة ( الشكل 4 A، D، E). في وجود سنتروسوميس إضافية، ما يقرب من 50٪ من الخلايا قادرة على التغلب على المغزل الميتوتيك متعددة الأقطاب عابرة وتشكيل المغزل ثنائي القطب وتقسيم الخلايا كاملة(الشكل 4C، D). الخلايا المتبقية غير قادرة على تحقيق المغزل ثنائي القطب ونتيجة لذلك خروج الانقسام من خلال تقسيم متعدد الأقطاب(الشكل 4B, D). بغض النظر عما إذا كان يتم تحقيق ثنائية القطب المغزل، والخلايا مع centrosomes اضافية تظهر زيادة كبيرة في مدة المنية مقارنة مع الخلايا مع 2 centrosomes، مما يشير إلى أن ديناميات التقدم الميتومي قد تتغير حتى عندما التغييرات في النتيجة المصوّلة ليست واضحة(الشكل 4E).
الشكل 1: اختيار معلمات المجهر والكاميرا. (أ)تمثيل الإطار لتحديد الهدف المطلوب ومكعب التصفية المناسب باستخدام برنامج الحصول على صورة. يظهر هو اختيار هدف التكبير 20x ومكعب مرشح brightfield. (ب)يتم العثور على الخلايا في لوحة عينة وجلبت إلى التركيز باستخدام brightfield أو المرحلة المجهرية التباين. (C)تمثيل النافذة لتعيين معلمات التعرض لكل التقاط صورة. يمكن استخدام البكسل، إذا لزم الأمر، لتحقيق تقليل وقت التعرض لكل التقاط وتقليل تلف الصورة إلى الخلايا. شريط مقياس هو 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التقاط الصور وتحليل الفحص المجهري بفاصل زمني. (A و B)تمثيل الإطار الذي يشير إلى كيفية تعيين معلمات الحصول على الصور باستخدام برنامج اكتساب الصور لوظائف NIS Elements HCA. هذا البرنامج يسمح متعددة الإحداثيات، والتصوير متعددة الآبار مع مرور الوقت. يمكن تعديل كل مهمة لتحديد الآبار والإحداثيات التي سيتم التقاطها. (C)أطر زمنية واحدة من أربعة شروط لتجربة واحدة. يستخدم RFP-H2B لتتبع الكروماتين. يتم استخدام ضغط الكروماتين وتحديد المواقع لتحديد مراحل مختلفة من الميتوسيز: بروميتافيس (الضغط في غياب محاذاة الكروموسوم، رأس السهم الأزرق)، Metaphase (محاذاة كروموسوم كاملة في خط الاستواء الخلية، رأس السهم الأصفر)، و Anaphase (بعد بدء فصل الكروموسوم المتزامن، رأس السهم الأبيض). شريط مقياس هو 10 درجة.
الشكل 3: يصور التصوير بالفاصل الزمني العيوب في الإخلاص المصهي. تشكل الخلايا التي تحتوي على نقاط مركزة إضافية مغزلًا متعدد الأقطاب، غالبًا ما تجمعها في مغزل ثنائي القطب قبل إكمال تقسيم الخلايا. هنا، تدخل الخلية الmitosis مع سبعة أعمدة مغزل متميزة (العلامات النجمية البيضاء) التي، مع مرور الوقت، يتم تجميعها في اثنين من أعمدة المغزل الرئيسية. عند هذه النقطة، الكروموسومات قادرة على محاذاة على طول خط الاستواء المغزل، والخلية تنتقل إلى anaphase. وقد سمحت التعددية القطبية العابرة بإلحاق مال لكروموسوم واحد. ينتج عن هذا الخطأ الذي لم يتم حله كروموسوم متخلف أثناء الأوج الذي يصبح مدمجًا في نواة دقيقة في خلية ابنة واحدة (تحمل اسم سهم). يتم تصور الكروماتين مع RFP-Histone 2B ويتم تصور microtubules مع α-tubulin-EGFP. وتشير الطوابع الزمنية في كل حلقة إلى دقائق تتعلق بانهيار الظرف النووي الظاهر كما يُحكم عليه بالكشف عن التوبولين داخل الحدود النووية. شريط مقياس هو 5 ميكرومتر.
الشكل 4: التغيرات في التطور الديناميكي للميثوسي تغير التوقيت المصوّر وتأثير مصير الخلية المصغّر. يستخدم RFP-H2B، كما هو موضح باللون الأحمر، لتتبع حركة الكروماتين، ويستخدم α-tubulin-GFP، كما هو موضح باللون الأخضر، لرصد عدد القطب المركزي/المغزل وتنظيمه. فقدان استبعاد GFP-tubulin من النواة، بالتزامن مع الضغط الكروماتين في وقت مبكر هو مؤشر على أن المغلف النووي قد انهارت (NEB) استعدادا لتقسيم الخلايا الميتومية. والاستثناء النووي للGFP-tubulin واضح عند الخروج من الظرف النووي وإصلاحه. (أ)خلية مع اثنين من centrosomes يشكل المغزل ثنائي القطب ويتقدم من خلال anaphase لتشكيل خليتين ابنة. (باء وجيم) الخلايا ذات السنتروسوسوم اتّحادية الدّانم لتشكل مغزل متعدد الأقطاب. (ب)بعض هذه الخلايا مع سنتروسومات إضافية تأخير في المغزل دون تحقيق المغزل ثنائي القطب والتقدم لإكمال الطور متعدد الأقطاب. (C)تظهر الخلايا الأخرى ذات السنتروسوسوم اتّبع تأخيراً عابراً في التقدم الميتومي في حين أنها تجمع سنتروسومات إضافية لتمكين الأوعية الثنائية القطب. (D)الخلايا ذات السنتروسات الإضافية قادرة على الخضوع لتقسيم ثنائي القطب حوالي 50٪ من الوقت، في حين أن الخلايا المتبقية مع سنتروسوميس إضافية تخضع لتقسيم متعدد الأقطاب. (E)الخلايا ذات السنتروسات الإضافية قد زادت من توقيت المصوّر بغض النظر عن المصير الميتومي في نهاية المطاف (ثنائي القطب أو متعدد الأقطاب). شريط مقياس هو 5 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح الدقة الزمنية التي يوفرها التصوير بالفاصل الزمني بتصور وتقييم الأحداث الخلوية المتسلسلة داخل الخلايا المفردة. والنهج التي تستخدم التزامن الخلوي متبوعاً بجمع الخلايا وتثبيتها في نقاط زمنية متسلسلة محدودة من حيث أن المقارنات تتم في نهاية المطاف بين مجموعات الخلايا. في السياقات التي قد تكون فيها الاستجابة الخلوية للاضطرابات غير موحدة، أو حيث تكون العملية التي يتم تصورها ديناميكية، يكون التصوير الحي بالفاصل الزمني للخلايا مجهزًا بشكل أفضل لمتابعة وتحليل كل من ديناميات الخلايا المفردة، فضلاً عن عدم التجانس ضمن السكان الخلوية. وبهذه الطريقة، التصوير بالفاصل الزمني مفيد بشكل خاص في رصد تقدم الخلايا من خلال المراحل الديناميكية للميثوس وتقييم كيفية تأثير الاضطرابات لهذا التقدم في نهاية المطاف على دقة انقسام الخلايا الميتوتيكية ومصير الخلية اللاحقة.
في حين أن هناك عددا من المزايا لتصوير الخلايا الحية، ترتبط تحديات كبيرة التي يجب النظر فيها والتخفيف من حدتها عندما يكون ذلك ممكنا. ويتمثل أحد التحديات في الحفاظ على الظروف البيئية الملائمة لضمان بقاء الخلايا وانتشارها أثناء التصوير. ولتحقيق ذلك، يجب أن يتضمن إعداد التصوير غرفة بيئية تنظم كل من درجة الحرارة وثاني أكسيدالكربون. بدلا من ذلك، يمكن تصوير الخلايا على المدى القصير مع تنظيم درجة الحرارة فقط إذا فعلت ذلك في غرفة مغلقة. في كلتا الحالتين، ينبغي استخدام جدول مضاد الاهتزاز و/أو النهج المستندة إلى الأجهزة للتخفيف من تقلبات التركيز المحوري (على سبيل المثال، التركيز المثالي لنيكون) للحفاظ على تركيز اللوحة طوال مدة التجربة. والشاغل الرئيسي الثاني في التصوير بالخلايا الحية هو احتمال حدوث تلف في الصورة وابيضاض الصور. يُعد ابيضاض الصور مصدر قلق حيث ينخفض الفلوروفور الذي يتم تصويره تدريجيًا في شدة الفلورة مع تقدم التصوير. ومع ذلك، فإن التعرض لضوء الإثارة عالي الكثافة الذي ينتج عن ابيضاض الضوء هو أيضاً سام للخلايا ويجب توخي الحذر لتقليل تعرض الخلايا عن طريق تقليل أوقات التعرض، وفترات الحصول على الصور، والمدة الإجمالية لتسلسل التصوير 25-ويمكن أن تشمل عواقب عدم تحسين ظروف التصوير لتقليل السمية الضوئية إلى أدنى حد من السمية الضوئية توليد تلف الحمض النووي والتغيرات الخلوية الأخرى التي يمكن أن تضر بدورها بتفسير التجربة وفهمها. إذا أصبحت صلاحية الخلية مصدر قلق مع التصوير على المدى الطويل، ينبغي بذل الجهود لاستخدام الطعوم بكسل (لتمكين التعرض أقصر) وزيادة المدة بين التقاط الصور اللاحقة. وهناك قلق إضافي هو أن علامة الفلورسنت قد تغير سلوك البروتين الذي يتم تنصهر، أو أن دمج التعبير الفيروسي بناء في الجينوم قد تؤثر في حد ذاته السلوك الخلوي. لحساب إمكانية أن إضافة علامة الفلورسنت قد تؤثر على وظيفة البروتين، وتقييم وظيفة البروتين بعد إضافة علامة الفلورسنت محطة N أو C والمقارنة مع وظيفة البروتين غير الموسومة من الضروري. لتحديد ما إذا كانت الآثار السلبية على سلوك الخلية تنشأ بسبب اضطراب موضع الجينوم الذي تم دمج البنية الفيروسية، يجب اشتقاق العديد من استنساخ الخلايا الواحدة، مقارنة بالخلايا التي تفتقر إلى البروتين الموسوم، واختبارها لمراقبة أن اللياقة البدنية الخلوية والتقدم الميتومي لا تكون مضطربة. وبدلاً من ذلك، يمكن التخفيف من الآثار المستهدفة للتكامل العشوائي لبنية التعبير الفيروسي من خلال التكامل المستهدف للبروتين الانصهاري في المكان المحلي، أو المناطق المعروفة الأخرى من الجينوم، باستخدام نُهج تستند إلى كريسبر.
وقد اعتمدت نُهج تحديد وتوصيف المنظمين الرئيسيين للتقدم الميتوتيك اعتماداً كبيراً على تصوير الخلايا الثابتة. وقد تم استغلال المنظمين Mitotic المحددة بهذه الطريقة في وقت لاحق في العلاجات التي تستهدف الخلايا السرطانية الانتشار بسرعة7،8،9. ومع ذلك، الأدوية المضادة للميثوتيك لا تؤدي دائما بشكل موحد في أنواع السرطان المختلفة، وفي كثير من الحالات البصيرة في الأنماط الظاهرية الميتوتيكية التي تسبق النهج العلاجية الكيميائية الناجحة أو غير الناجحة لا تزال غير واضحة. التصوير الحي بفاصل زمني للخلايا لتتبع الخلايا الميتوتيكية في وجود وعدم وجود الأدوية التي تُعوّض المغزل لديه القدرة على توفير البصيرة اللازمة لتحديد تلك المغيرات التي من المرجح أن تؤدي إلى حالات كارثية من الميتوكوندريا وإلى قابلية البقاء للخطر. الخلايا السرطانية مع الحد الأدنى من التأثير على الخلايا الطبيعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويدعم DLM من قبل GRFP NSF. يتم دعم ALM بتمويل من جائزة عائلة سميث للتميز في البحوث الطبية الحيوية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
