Summary
初期マウス胚におけるマイクロRNAのプロファイリング手法について述べます。このプロトコルは、低細胞入力と小さなRNA濃縮の課題を克服します。このアッセイは、初期マウス胚の異なる細胞系統におけるmiRNA発現の経時変化を分析するために使用することができる。
Abstract
マイクロRNA(miRNA)は、細胞運命決定と発達タイミングの複雑な調節にとって重要である。初期の開発におけるmiRNAの寄与に関するインビボ研究は、細胞数の制限により技術的に困難である。さらに、多くのアプローチでは、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、qPCRなどのアッセイで、関心のあるmiRNAを定義する必要があります。したがって、多くのmiRNAの発現とそのアイソフォームは、初期の開発の間に研究されていません。ここでは、初期のマウス胚から選別された細胞の小RNAシーケンシングのプロトコルを示し、神経堤細胞の初期集団におけるmiRNAの比較的公平なプロファイリングを可能にする。増幅とゲルベースの精製を用いたライブラリー調製時の低細胞入力とサイズ選択の課題を克服します。我々は、反復とステージ一致マウス胚の間の変動を考慮した可変的な年齢として胚年齢を同定し、生物学的複製におけるmiRNAを正確にプロファイルするために使用されなければならない。我々の結果は、この方法が細胞の他の系統からのmiRNAの発現をプロファイルするために広く適用できることを示唆している。要約すると、このプロトコルは、miRNAが初期マウス胚の異なる細胞系統における発達プログラムをどのように調節するかを研究するために使用することができる。
Introduction
発生生物学の中心的な問題は、単一の未分化細胞が多数の複雑な細胞型を持つ生物全体を生み出す方法です。胚発生の間、細胞の発達の可能性は、生物が発達するにつれて次第に制限される。その一例が、多能性細胞集団から末梢神経、グリア、頭蓋骨、軟骨などの様々な末端誘導体に徐々に分化する神経堤系である。神経堤細胞は、胃の中に外胚葉から指定され、次いで上皮間葉転移を受け、胚を通して体全体に移動し、そこで末期に分化する1。何十年もの研究は、転写遺伝子調節ネットワークを発見したが、神経堤の発達のタイミングを制御する転写後調節のメカニズムについてはるかに少ない知られている。
これまでの研究では、マイクロRNA(miRNA)が適切な発達タイミングおよび細胞運命決定のために遺伝子発現を抑制することを示唆している2,2、3、4、5、6。3,4,5,6神経堤発生におけるmiRNAの研究は、主に頭蓋顔面発達の後期段階に焦点を当てている。例えば、miR-17〜92およびmiR-140は、マウスおよびゼブラフィッシュにおける頭蓋顔面発達中の口蓋形成に対して、それぞれ77,88に対して重要である。胚の最も初期の神経堤運命決定に対するmiRNAの寄与は十分に調査されていない。初期の運命決定におけるmiRNAの研究は、初期胚に存在する低細胞数などの技術的課題によって制限されている。
MiRNAは、分化の異なる段階で胚体を使用して初期マウスの発達をモデル化する細胞株からインビトロでプロファイリングされている9.哺乳類の初期の発達の間に生体内での小さなRNAの調査は比較的限られている。miRNAをプロファイルする以前の方法は、既知の配列としてバイアスを導いた、qPCR、マイクロアレイ、およびノーザンブロット10のような方法で特定のmiRNAの発現を分析するために使用される。次世代のシーケンシングと分子ツールの改良により、miRNA発現の比較的公平な分析が可能になり、初期の哺乳類の発達と細胞運命の決定に対する彼らの貢献を研究できるようになりました。
ここでは、胃(E7.5)から器官形成の始まりまでの初期マウス胚から神経堤細胞で発現する小さなRNAを収穫し、配列する技術を報告する。この手法は簡単で、系統トレース、細胞ソート、およびゲルベースのサイズ選択を組み合わせて、次世代シーケンシング用の最小数の細胞から小さなRNAシーケンシングライブラリを作成します。我々は、初期の発達の急速な変化の間にmiRNAの包括的な視野を得るために6時間の時間間隔を解決するために胚の厳密なスマイト段階の一致の重要性を強調する。この方法は、遺伝的および発達的研究に広く適用され、胚のプールを回避することができる。ゲル法による精製によるmiRNA濃縮、ライブラリ定量、PCRから生じるバイアスの最小化など、現在の手法の課題を克服する方法について説明します。この方法は、miRNAがマウス胚の神経堤系統における発達タイミングを制御する方法を研究するために、時間の経過とともにmiRNA発現パターンを同定するために使用されてきた。
Protocol
すべての研究および動物ケア手順は、ベイラー医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認され、ベイラー医科大学の実験動物ケア承認動物施設の評価と認定協会に収容されました。すべての株はC57BL6の背景に維持された。
1. 胚解剖(E7.5-E9.5)
- 妊娠中の雌マウスから子宮の角を取り除き、切開が行われる70%エタノールで腹部を殺菌する。
- リン酸緩衝生理食塩分(PBS)ですすいで子宮をきれいにしてください。子宮を無菌のプラスチック10cm皿に入れます。
- マイクロディションはさみを使用して、領域を含む各デシドゥアを互いに分離する。子宮筋を剥がし、すべてのデシドゥアを露出させる。各胚からデシドゥアを1つずつ取り除きます。
- 各胚から黄身嚢を取り除き、ジェノタイピングのために保存します。
- すべての胚をイメージング用の新鮮なPBSの新しい皿に移動します。
- ごみ全体の画像を撮る。各胚を個別に画像化し、各胚のスマイト数をカウントする。実験の間に倍率と露出(蛍光の場合)を同じに保ちます。
注: 50~200 ms の曝露は蛍光に適しており、明視野設定には 20 ms が適していることがわかります。
2. 胚解離と細胞の並べ替え
- 各胚のソート元に対して、以下の手順を実行します。
- E8.0より古い胚のオティックプラコードのすぐ上の首を切る(頭蓋領域の標識された細胞だけが望まれる場合)。E7.5胚の場合、胚外構造を除去する(適切な胚だけが望まれる場合)。
- PBSの最小量で頭を48ウェルプレートのきれいな井戸に移動します。パパイン(27 U/mL)を250μL加えます。ピペットはp200を使用して穏やかに上下に。
- 顕微鏡の下で確認し、塊と単一細胞を探します。
- 単一の細胞懸濁液が達成されるまで、穏やかなピペットを上下に繰り返します(通常、E7.5-E9.5の場合は30〜1分の間に相当する3ラウンドのピペットアップとダウン)。
- 牛胎児血清(FBS)の250 μLでクエンチ。
- ソートする各胚について、ステップ 2.1.1~2.1.5 を繰り返します。
- 35 μmナイロンメッシュフィルターキャップチューブを通して500 μLのセルサスペンションをフィルターし、塊を取り除きます。
- 濾液を取り、新しい1.5 mLチューブに移動し、5分間200 x g で回転します。上清を注意深く取り除き、新しいチューブに移します(生細胞がペレットに入ると分かるまで保存してください)。
- 0.5〜1%のウシ血清アルブミンを含むPBSの300 μLで細胞ペレットを再懸濁し、ソートするまで氷の上に保ちます(今から選別の終わりまでの時間を最小限に抑えます)。
- 必要に応じて、セル懸濁液を10 μLとし、10 μLのトリパンブルー(0.4%)と組み合わせます。そして、トリパンブルーが死んだ細胞のみを染色するように、おおよその細胞定量と生存率を識別するために血球計を使用してカウントします。
- 並べ替える直前に、フィルター キャップ チューブを通して各サンプルを再度フィルターし、ライブ セルの DAPI 染色を追加します。
- 70 μmノズルを備えた細胞選別機で、各サンプルを500 μLのRNA抽出溶解溶液( 材料表を参照)に並べ替えます。
- すべてのサンプルが収穫されるまで-80 °Cで混合して保存します。この時点から進むのは、実験に必要なすべてのサンプルが収集され、ライブラリ準備のラウンド間の技術的なばらつきが減少した場合のみです。
3. RNA抽出
注: プロトコルは RNA 分離キットから調整されます。「材料表」を参照してください。
- 各サンプルに500 μLのRNA抽出溶解溶液( 材料表を参照)を加えると、合計体積は1000 μLになります。
- 各サンプルを室温で解凍します。
- 各サンプルを1.5分間渦し、均質化を開始する前にキャップが各チューブにしっかりと固定されていることを確認します。室温(15~25°C)で5分間、ホモジュネートをインキュベートします。
- クロロホルムを140μL、キャップチューブをしっかりと加え、15秒の間激しく振ります。室温で3分間インキュベートします。
- 遠心分離機 15分 12,000 x g で 4 °C. 上部水相を氷上の新しいコレクションチューブに移します。相間または有機相を移さない。ピンクの有機相に近づくとき、チューブを左右に傾け、明確な水相が採取できないまで小さなアリコートを取り除きます。
- 次のステップで正しい計算をするために各サンプルから採取した水相を含むRNAの体積を測定します。
- 100%エタノールの1.5ボリューム(通常は525μLですが、わずかに多くまたは少ない場合があります)を加え、ピペットで十分に混ぜます。
- 2 mL採取チューブのカラムに、任意の沈殿物を含む最大700 μLのサンプルをピペット。蓋と遠心分離機を室温で 15s の≥8,000 x gで閉じます。フロースルーを破棄します。
- 残りのサンプルを使用して、ステップ 3.8 を繰り返します。
- 製造元の指示に従ってカラムを洗います。全速で1分間回転させて柱を乾かします。カラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに移します。
- ピペット11μLのヌクレアーゼフリー水を膜の中心に取り付けます。室温で1分間座ります。カラムを外すために1分間の最大速度を回転させます。
- 分光光度計と平行キャピラリー電気泳動装置を用いてRNA濃度を測定する(材料表)。
4. 図書館の準備
注:プロトコルは、小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックから適応されています。 「 材料表」を参照してください。
- 3'アダプターの1/4希釈を使用した小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックに記載されているように、変性と3'アダプタライゲーションを完了します。
- 超過3'アダプタの取り外しを続けます。
- 小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックに記載されているように、アダプターの枯渇を完了します。ビードのクリーンアップのために作りたての80%エタノールを使用し、ビーズを過剰乾燥させることなくヌクレアーゼを含まない水で再懸濁する直前に、余分なエタノールをすべて完全に除去してください(ビーズペレットの割れ目は過剰乾燥時に観察されます)。
- 過剰なアダプターの非アクティブ化に直接進みます。
- 氷上のすべての試薬を組み立てる小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックに記載されているように、過剰なアダプターの不活性化を完了します。
- 5'4Nアダプターライゲーションに続きます。
- 5'アダプターの1/4希釈を使用し、氷上のすべての試薬を組み立てることを確認している小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックに記載されている完全な5'アダプタライゲーション。
- 逆転写に進みます。
- 小さなRNAライブラリー調製キットハンドブックに記載されている完全な逆転写第一鎖合成と氷上のすべての試薬を組み立て、長期間冷凍庫から酵素を保たないように注意してください。
注: この時点で、プロトコルは、4 °Cで一晩保存されたサンプルで、停止することができます。 あるいは、PCR増幅を継続する。 - 小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックに記載されている試薬を組み立て、PCRサイクルの数を最小限に抑えることで、PCR増幅を完了します。PCR サイクルの数は、各アプリケーションについて実験的に決定し、最小サイクル数を使用する必要があります。ここでは、小さなRNAライブラリの増幅に16サイクルを使用しました。
- サイズ選択に直接進みます。
5. サイズの選択
- 各サンプルに、6倍のゲルローディング染料とピペットを5 μL加えて混合します。
- 10 μLのラダーをゲルの最初のウェルに積み込み、すぐに右の空の井戸に残します。ステップ5.1から6%トリス/ホウ酸/エチレンジアナトラ酢酸に全製品をロードし、ポリアクリルアミドゲル(TBE-PAGE)を各サンプルの間に1レーン放置します。
注:後のステップのためにゲルが入ってきた容器を保管してください。 - 0.5x TBEランニングバッファで約30〜40分間、ゲルを150Vで実行します(下色帯がゲルの底部近くまで0.5〜1cm)。
- ゲルの実行中に1 Lの染色液を作る:SYBRゴールドは0.5x TBEで1:10,000希釈した。
- ゲルの走行が終了したら(すなわち、下色帯がゲルの底付近にある)、ゲルの向きに注意してガラス板からゲルを慎重に取り除いてください。
- ゲルを元のパッケージのトレイに入れる。0.5x TBEを取り外し、ステップ5.5の染色溶液で交換します。15分間の染色ゲル。染色時間を増やす必要があるかもしれません。
- ゲルをUVトランスイルミエーターに置き、ゲルを裂かないように注意し、上記の向きを維持します(はしごのバンドがはっきりと見えない場合は、追加の時間のために再染色)。
- カメラでUVトランスイルミエーターで染色が完了したら、ゲルを画像化します。
- より良い画像が必要な場合は、UVトランイルミエータ上のバンドをUVトランイルミエーターで直接イメージングする前に、UVトランスイルミエータ以外のイメージング装置を使用してゲルの画像をキャプチャすると、 図3A-Bに示すように背景の色が変化する。繊細で破れる可能性があるため、ゲルを何度も動かさないで下さいます。
- きれいなカミソリの刃を使用して~150 bpバンドを識別して取り外し、きれいな1.5 mLチューブに入れなさい。~130 bp帯(アダプターダイマー製品)を切り取らないでください。
- ドキュメント化のためにライブラリ製品を含むスライスを取り除いた後、ゲルを再びイメージします。
- ゲルスライスを含むマイクロ遠心チューブを最高速度で30s回転し、各チューブの底部のスライスを収集します。
- 各サンプルにp200チップを使用して、ゲルのスライスを可能な限り最小のビットに粉砕します。各先端を各チューブに取り出します。
- 各チューブに溶出バッファーを300 μL加え、チューブの側面からゲルビットを洗浄し、p200チップを再び取り付け、サンプルごとにチップを洗い流します。
- 溶出サンプルを25°Cに設定した振れインキュベーターに入れます。 1000 rpmの振盪で一晩インキュベートする。インキュベーターからチューブを取り外し、室温で10分間最高速度でスピンします。
- ライブラリ製品を含む上清を2 mL RNaseフリー96ウェルプレートに移します。ゲルを転写しないように注意してください。
- 各サンプルに50 μLのクリーンアップビーズを加え、ピペットで混ぜます。すぐに、イソプロパノールの350 μLを加え、ピペットで混ぜます。ロッキングで10分間室温でインキュベートします。
- パルススピンプレートをペレットビーズにし、2分間磁化します。上清を慎重に取り出して捨てます。
- 80%エタノールの950 μLを加えます。30 sのインキュベート。上清をすべて取り除く。合計2回のエタノールを繰り返します。
- サンプルを3分間乾燥させます。このステップでは、各ウェルの底部に集まる残留エタノール(複数回)を除去し、ビーズを過度に乾燥させないように注意してください(過剰乾燥するとビーズペレットの割れになります)。
- ウェルの底に残った液体をすべて取り除きます。磁気スタンドからプレートを取り外します。
- ペレットを13 μLの再懸濁液バッファーに再懸濁します。均質になるまでピペットで混ぜます。2分間インキュベートし、3分間磁化します。
- 12 μLの上清をクリーンチューブまたはクリーニングプレートに移し、その後の保管を行います。すべてのサンプルを一晩または-20 °Cの長期保存してください。
- 毛細管電気泳動高感度DNAアッセイを用いて、各ライブラリーに存在する断片のサイズと濃度を確認します。複数の方法で濃度を確認します。
注: キャピラリー電気泳動の過負荷を避けるために、標準感度キットを使用することがあります。
Representative Results
ここで示した手順を用いて、E7.5、E8.5、E9.5で胚を収穫しました。胚外構造は全ての胚から除去され、その後、胚を6時間の時間間隔を解決するためにスマイトを形成した(図1A-1B)。原理成分分析を用いて類似性に基づいてサンプルをグループ化し、胚年齢の結果としての変動と生物学的複製のための慎重なスマイトマッチングの必要性を強調する、年齢別にサンプルが集まることがわかりました(図1C)。E7.5で多能性エピブラストをプロファイリングし、E8.5でWnt1-Creを使用して系統トレース前回遊動および回遊性神経堤細胞、E9.5でSox10-Creを使用して回遊性神経堤細胞をプロファイリングした(図1D)。ここでは、オティックプラコードのすぐ上の胚を切断することによって、頭蓋神経堤を具体的に収穫します。神経堤細胞の標識に頻繁に使用される2つのCre-driver(Wnt1およびSox10)の比較は、それらが初期マウス胚の異なる集団をマークすることを確認する(図1E)。ガッティング戦略は、RNA抽出溶解溶液に直接分類された生きた単一RFP陽性細胞を得るために使用され( 材料表を参照)、−80°Cで保存された(図1F)。各サンプルから何個の細胞が採取されたかを追跡することが重要です。
RNA分離は、RNAキットプロトコルの改変バージョンを用いて行った。具体的には、4°Cで保存するミニRNAカラムを使用しています。 これらのカラムは、細胞入力が制限されているサンプルから可能な限り高いRNA濃度を得るために、小容量(11 μL)で溶出するのに役立ちます。これと同じ理由で、フェノールクロロホルム抽出後の水相のすべてを得ることが重要である。収集しながら、ゆっくりとピペットと片側にチューブを傾けることは、収量を最大化するために重要です。この手順では、分光光度計を用いてRNAを定量化し、塩/タンパク質汚染に関する情報を得るために、そして毛管電気泳動を測定して濃度を測定する(図2)。分光光度計のトレースは、RNAが汚染タンパク質なしで単離されたが、塩分が高いことを明らかにします(図2A-2B)。260/280 の比率は~1.8、260/230 の比率は 2.0 を指定することが理想的です。分光光度計で測定したRNAの総収量は、E8.5-E9.5の間の年齢とともに増加しなかった。これは、分光光度計の分解能が、採取している細胞数からのRNA濃度の変化を検出するのに十分な感度を持っていないため、毛細管電気泳動から得られた濃度情報を用いた情報を用いることを推奨する(図2C)。毛細管電気泳動のトレースは、RNA断片の濃度およびサイズを推定するために使用することができる。ピーク <1000 ヌクレオチドは分解を示します。代表的なトレースは分解されないRNAと一致する。2000ヌクレオチドおよび5100ヌクレオチドのピークはそれぞれ18および28s rRNAである。小さいRNA領域は、〜150ヌクレオチド(図2D)に位置する。
小さなRNAシーケンシングライブラリは 、材料表に記載されている小さなRNAライブラリの準備キットを使用して準備しました。ここでは、各サンプルから得られたRNAの半分以下(11μL溶出の4μL、〜80〜120ng)を使用して、各サンプルから残りのRNAからRNAシーケンシングライブラリを合成することができます。ここでは、3'および5'の小さなRNAアダプタを1/4に希釈して、存在するアダプタダイマーの量を減らし、アダプタライゲーション、クリーンアップ、および逆転写ステップが可能な限り連続的に完了することを示唆しています。我々は、ライブラリを増幅するために16のPCRサイクルを使用し、任意の実験のためのPCRサイクルの最小数が経験的に決定されることを示唆している。過剰なPCRサイクルを完了することにより、低発現miRNAの読み取り回数を人為的に膨らませることができる。
サイズ選択は、通常存在するアダプター・ダイマーではなく、miRNA のライブラリーをエンリッチ化するために不可欠です。ライブラリのプロダクト サイズ(150 bp)とアダプタ ダイマー(130 bp)は、サイズが非常に似ています。ゲル抽出は、アダプターのダイマーから離れた小さな RNA シーケンシング ライブラリを分離するために使用されます (図 3)。切除前の PAGE ゲルの画像は、各サンプルに多数の製品サイズが存在することを示しています (図3A)。2つのサンプルまたはゲルにロードされたラダーの間に1つのレーンを開いたままにすることが重要です。ゲルの下部の移動前線は、150 bp帯が全てのサンプルで区別しにくい場合に、より遅い速度で走る必要があることを示すわずかに湾曲している。この代表的な画像はまた、各胚サンプルに入ったものと比較して、ライブラリの準備に入った陽性対照RNA(ラットの脳からの総RNA)のより高い濃度から150 bpの産物の豊富さを示しています。陰性対照は、試薬が核酸種を汚染することを含まないことを明らかにする(図3A)。150 bpバンドの切除は、きれいなカミソリブレードで行う必要があり、収集された領域は図3Bに示されています。サイズ選択前後のキャピラリー電気泳動トレースは、ゲル精製を伴う150bpライブラリ製品の純度の劇的な向上を示す(図3C-3D)。図 3C-3Dのトレースには、マーカーよりも高いサンプルピークがあり、オーバーロードを示していることに注意してください。これらの場合、断片のサイズは正確であり得るが、濃度はそうではないかもしれない。定量化は、ライブラリーをマーカーの範囲に希釈するか、または代替方法を使用することによって得ることができる。ライブラリ定量の代替方法にバリエーションがある場合があり、複数の定量方法を実証的にテストすることを推奨します。一度に配列されるサンプルの数を最大化する際には、濃度の正確な定量が不可欠です。ライブラリはシーケンシング用に1.3pMまで希釈され、一般的に15〜25個のサンプルの任意の場所を、約1億4,000万読み取りを提供する150サイクルシーケンシングキットで一度にシーケンスすることができます。この結果、サンプルあたり約 500 万読み取りが行われています。一般的にマッピング率は60〜80%です。
図1:小さなRNAシーケンシングのためにマウス胚から細胞を収穫する。(A) E8.5マウス胚は、胚の段階を決定するために使用される黄身嚢およびスマイトの除去を強調する(B)マウス胚のスマイトステージングが神経堤発達の段階を捕捉する(C)分類された野生型神経堤細胞から準備されたライブラリの主成分分析(D)、サンプルが年齢別に分類されたことを示す概略成分を示す( D ) サンプルがE8.5.に対してWnt1-Creを使用してどのように収穫されたかを示す概略図 E9.5の前回遊性および回遊性神経堤細胞およびSox10-Creは、FACSソートを使用してE8.5およびE9.5胚からRFP+神経堤細胞を分離するために使用される格子型ニューラルクレスト細胞(E)ソートされた野生型神経堤細胞から準備されたライブラリの原理成分分析(F)を除いてCre-driverによって一緒にサンプルグループを示す( F)G.5 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:E7.5-E9.5マウス胚からのRNA単離。(A)このプロトコルを適用した胚の最年少段階からのRNA分離の代表的な分光光度計の痕跡。(B)分光光度計から得られるRNA品質の代表値を示す表。(C)各年代の胚から選別された神経堤細胞から採取したRNAの例(D)良質RNAを示す毛細管電気泳動トレース。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:サイズ選択前後のmiRNAライブラリ。(A)TBE-PAGEゲルは、4つのサンプルとコントロールの代表的な小さなRNAライブラリを示し、150bpバンド切除後(B)。矢印は、小さなRNAライブラリーの切除される150bpバンド(C)の小さなRNAライブラリーの軌跡を表し、サイズ選択後(D)を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
発達過程は急速に進めることができ、細胞は、初期の運命決定に寄与するmiRNAの包括的なビューをキャプチャするために、広く使用されている半日の増分よりもより具体的なステージングが必要となるような多くのシーケンシャル仕様を受けています。最近の研究では、3〜6のスマイト11を有する範囲のTheilerステージ12胚からのRNAシーケンシングを行った。この期間中、神経堤細胞(年齢の3つのスマイト)、内半角(4歳)、および移行(年齢の5〜6スマイト)が指定されていることがわかります。また、微量細胞集団の系統化に使用されるCre-driverに加えて、年齢は生物学的サンプル間の変動の最大の源であり、一致した胚のみを複製とみなすべきであることもわかった。これは、トランスジェニック胚と野生型コントロールを比較する際にも考慮する必要があります。
初期の開発中にmiRNAをプロファイリングする以前の方法は、小さなRNAシーケンシングライブラリ調製のために10〜100ngのRNA入力の間で使用され、複数の胚を1つのサンプル13、14,14にプールした。我々は、1つのE7.5胚またはE8.5およびE9.5の並べ替えられた神経堤細胞からのRNA単離およびライブラリー調製を、総RNAの約100ngを入力として使用して実証する。選別のために胚を解離する場合、顕微鏡で解離を見て、単一細胞が得られたときに観察する反応を消し止める必要があります。E8.5-E9.5胚の頭蓋領域の解離は、プロトコルに記載されているように穏やかな手動ピペットでほぼ瞬時であることがわかりました。より大きな組織およびますます古い胚の場合、解離される胚の部分に応じて解離時間が長くなる可能性がある。E7.5-E9.5胚の場合、細胞の塊は顕微鏡下で容易に見え、解離は塊が見えなくなるまで続くはずです。5~10倍の範囲で溶液を通してフォーカスを調整すると、単一のセルがソリューションに表示されます。これまでの方法では、細胞をリシスバッファーに直接分類して RNA シーケンシングを行い、細胞数が少ない14からバルク RNA を準備する。ここでは、RNA抽出溶解溶液に直接分類して、ライブラリー調製の開始前にRNAを単離できるようにします。11 μL溶出量のミニカラムを使用することで、単一のRNA準備が小さなRNAとバルクRNAシーケンシングの間で分割されるほどの高いRNA濃度が可能になります。
最も小さなRNAシーケンシング法の現在の制限の1つは、変換されたcDNAのPCR増幅です。この方法ではこの制限を克服することはできませんが、推奨される 25-最大から 16 サイクルまでの PCR サイクルの数を最小限に抑えることができました。この増幅の減少はPCRによって導入される人工的な増幅バイアスを減少させる。バイアスの別のソースは、アダプターの結紮であり、アダプターとmiRNAの端に位置する特定の配列が他のシーケンスよりも効率が高いと共にリゲートできることが知られている。これを避けるために、このプロトコルで使用されるアダプターは、ライゲーション反応の偏りを防ぐために、各アダプタの最後に4つのランダム塩基を組み込んでいます。さらに、もう 1 つの共通の問題は、RNA 入力が少ないときに形成されるアダプター ダイマーの量です。ライブラリ調製キットには、アダプターの不活性化やビードのクリーンアップなどのアダプターのダイマー形成を軽減し、各ライゲーション後に余分なアダプターを除去するステップが含まれています。また、3'と5'4Nのアダプタを1/4で希釈して、形成できるアダプタダイマーの量を減らしました。希釈しないと、130bpバンド強度が増加し、ゲル上に所望の小さなRNAライブラリを含む150bpバンドと区別することが困難であることがわかりました。
シーケンスライブラリを準備するもう 1 つの現在の課題は、シーケンス処理の前に製品を正確に定量することです。異なる方法が同じライブラリでさまざまな結果を与えることがわかりました。研究者は、濃度の正確な推定を得るために定量の複数の方法を使用することを示唆しています。
このプロトコルは、遺伝的、発達的研究、またはRNAが少数の細胞から収穫されている他のアプリケーションに広く適用することができます。このアプローチは、胚のプールを避けることによって一時的な研究を簡素化し、並べ替えのない細胞と並べ替えられた細胞の両方に簡単に適用することができます。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
このプロジェクトは、アンドリュー・マクドノーB+財団とNIH(R01-HD099252、R01-HD098131)によって支援されました。 R.J.P.は、がん研究(RR150106)のCPRIT学者であり、がん研究のV学者(V財団)です。著者らはまた、このプロジェクトに必要な機器を提供するためにBCMのサイトメトリーと細胞選別コアを認めたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P.
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
