Summary
We beschrijven een techniek voor het profileren van microRNAs in vroege muisembryo's. Dit protocol overwint de uitdaging van lage celinput en kleine RNA-verrijking. Deze test kan worden gebruikt om veranderingen in miRNA expressie na verloop van tijd te analyseren in verschillende celvormen van het vroege muisembryo.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) zijn belangrijk voor de complexe regulering van cellot beslissingen en ontwikkelingstiming. In vivo studies van de bijdrage van miRNAs tijdens de vroege ontwikkeling zijn technisch uitdagend als gevolg van de beperkende cel nummer. Bovendien vereisen veel benaderingen een miRNA van belang om te worden gedefinieerd in tests zoals noordelijke blotting, microarray en qPCR. Daarom is de expressie van veel miRNAs en hun isovormen niet bestudeerd tijdens de vroege ontwikkeling. Hier demonstreren we een protocol voor kleine RNA-sequencing van gesorteerde cellen uit vroege muisembryo's om relatief onbevooroordeelde profilering van miRNAs mogelijk te maken in vroege populaties van neurale kuifcellen. We overwinnen de uitdagingen van lage celinvoer en grootteselectie tijdens de voorbereiding van de bibliotheek met behulp van versterking en gelgebaseerde zuivering. We identificeren embryonale leeftijd als een variabele die rekening houdt met variatie tussen replica's en geënsceneerde muisembryo's die moeten worden gebruikt om miRNAs nauwkeurig te profileren in biologische replica's. Onze resultaten suggereren dat deze methode breed kan worden toegepast om de expressie van miRNAs uit andere vormen van cellen te profileren. Samengevat kan dit protocol worden gebruikt om te bestuderen hoe miRNAs ontwikkelingsprogramma's reguleren in verschillende cellijnen van het vroege muisembryo.
Introduction
Een centrale vraag van ontwikkelingsbiologie is hoe één enkele ongedifferentieerde cel aanleiding kan geven tot een heel organisme met talrijke complexe celtypes. Tijdens embryogenese wordt het ontwikkelingspotentieel van cellen geleidelijk beperkt naarmate het organisme zich ontwikkelt. Een voorbeeld is de neurale kamlijn, die geleidelijk onderscheidt van een multipotente celpopulatie in verschillende terminale derivaten, zoals perifere neuronen, glia, schedelbot en kraakbeen. Neurale kuifcellen worden gespecificeerd vanaf het ectoderm tijdens gastrulation en ondergaan vervolgens een epitheliale naar mesenchymale overgang en migreren via het embryo naar discrete locaties door het hele lichaam waar ze terminaaldifferentiëren 1. Decennia van het werk hebben ontdekt een transcriptie gen regelgevende netwerk, maar veel minder is bekend over de mechanismen van post-transcriptional regelgeving die de timing van neurale crest ontwikkeling controle.
Eerder werk suggereert dat microRNAs (miRNAs) de genexpressie onderdrukken voor een goede ontwikkelingstiming en beslissingen over het lot van cellen2,3,4,5,6. Studies van miRNAs in neurale kuif ontwikkeling hebben grotendeels gericht op latere stadia van craniofaciale ontwikkeling. MiR-17~92 en miR-140 zijn bijvoorbeeld van cruciaal belang voor palatogenese tijdens craniofaciale ontwikkeling bij muizen en zebravissen, respectievelijk7,8. De bijdrage van miRNAs aan de vroegste neurale kuif lot beslissingen van het embryo is niet grondig onderzocht. Studies van miRNAs in het vroege lot beslissingen zijn beperkt door technische uitdagingen, zoals de lage cel aantal aanwezig in de vroege embryo's.
MiRNAs zijn geprofileerd in vitro van cellijnen met behulp van embryoide lichamen in verschillende stadia van differentiatie om vroege muis ontwikkelingmodel 9. Het onderzoek naar kleine RNAs in vivo tijdens de vroege ontwikkeling van zoogdieren is relatief beperkt. Eerdere methoden om miRNAs te profileren hebben geleid tot bias als een bekende sequentie wordt gebruikt om expressie van een specifieke miRNA te analyseren in methoden zoals qPCR, microarrays en noordelijke vlekken10. Volgende generatie sequencing en steeds verbetering van moleculaire instrumenten nu zorgen voor relatief onbevooroordeelde analyse van miRNA expressie om hun bijdrage aan de vroege zoogdierontwikkeling en cel lot beslissingen te bestuderen.
Hier rapporteren we een techniek om kleine RNAs te oogsten en te sequencen, uitgedrukt in neurale kuifcellen van vroege muisembryo's die gastrulation (E7.5) tot het begin van organogenese (E9.5) overspannen. Deze techniek is eenvoudig en combineert lijntracering, celsordening en gelgebaseerde grootteselectie om kleine RNA-sequencingbibliotheken van een minimaal aantal cellen voor te bereiden voor de volgende generatie sequencing. We benadrukken het belang voor strikte somite fase matching van embryo's om 6-uurs tijdsintervallen op te lossen om een uitgebreid beeld van miRNAs te verkrijgen tijdens de snelle veranderingen van vroege ontwikkeling. Deze methode kan op grote schaal worden toegepast op genetische en ontwikkelingsstudies en vermijdt het bundelen van embryo's. We beschrijven een manier om uitdagingen van de huidige methoden te overwinnen, zoals miRNA-verrijking met behulp van gelgebaseerde zuivering, bibliotheekkwantificering en het minimaliseren van bias geïntroduceerd vanuit PCR. Deze methode is gebruikt om miRNA-expressiepatronen in de loop van de tijd te identificeren om te bestuderen hoe miRNAs de ontwikkelingstiming in de neurale kamlijn van muisembryo's controleren.
Protocol
Alle onderzoeks- en dierverzorgingsprocedures werden goedgekeurd door het Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee en ondergebracht in de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care-goedgekeurde dierenfaciliteit aan het Baylor College of Medicine. Alle stammen werden gehandhaafd op C57BL6 achtergrond.
1. Embryodissectie (E7.5-E9.5)
- Verwijder baarmoederhoorns van een zwangere vrouwelijke muis, steriliseren van de buik met 70% ethanol waar de incisie moet worden gemaakt.
- Reinig de baarmoeder door te spoelen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Plaats de baarmoeder in een steriele plastic schaal van 10 cm.
- Met behulp van microdissection schaar, scheiden elke decidua met regio van elkaar. Pel de baarmoederspier af en stel alle deciduae bloot. Verwijder één voor één de decidua uit elk embryo.
- Verwijder de dooier zak uit elk embryo en behalve voor genotyping.
- Verplaats alle embryo's in een nieuw gerecht van verse PBS voor beeldvorming.
- Maak een foto van het hele nest. Beeld elk embryo afzonderlijk en tel het aantal somites van elk embryo. Houd de vergroting en blootstelling (voor fluorescentie) hetzelfde tussen experimenten.
OPMERKING: We vinden dat 50-200 ms blootstelling voldoende is voor fluorescentie en dat 20 ms voldoende is voor heldere veldinstelling.
2. Embryo-dissociatie en celsorde
- Voor elk embryo te sorteren uit, doe het volgende.
- Onthoofding net boven de otic placode voor embryo's ouder dan E8.0 (al was het maar gelabelde cellen van het schedelgebied gewenst). Voor E7.5 embryo's, verwijder extraembryonische structuren (als alleen het embryo juiste gewenst is).
- Verplaats het hoofd in een minimaal volume PBS naar een schone put van een 48-put plaat. Voeg 250 μL papaïne (27 U/mL) toe. Pipet zachtjes op en neer met behulp van een p200.
- Controleer onder de microscoop en zoek naar klonten en enkele cellen.
- Herhaal zachte pipetting op en neer totdat een enkele cel schorsing is bereikt (meestal drie rondes van pipetting op en neer, wat moet neerkomen op tussen 30 s tot 1 min voor E7.5-E9.5).
- Blus met 250 μL foetaal runderserum (FBS).
- Herhaal stap 2.1.1-2.1.5 voor elk te sorteren embryo.
- Filter 500 μL celsuspensie door een nylon mesh filterdopbuisbuis van 35 μm om klonten te verwijderen.
- Neem het filtraat en ga naar een nieuwe 1,5 mL buis en draai op 200 x g gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant zorgvuldig en breng over naar nieuwe buis (behalve totdat levende cellen bekend zijn in de pellet).
- Resuspend cell pellet in 300 μL PBS met 0,5-1% runderserum albumine en houd op ijs tot het sorteren (minimaliseer de tijd tussen nu en het einde van het sorteren).
- Neem indien gewenst 10 μL celsuspensie en combineer met 10 μL Trypan blauw (0,4%) en tellen met behulp van een hemocytometer om bij benadering cel kwantificering en levensvatbaarheid te identificeren als Trypan blauw alleen vlekken dode cellen.
- Net voor het sorteren, filter elk monster opnieuw door een filter dop buis en voeg DAPI vlek voor levende cellen.
- Sorteer elk monster in 500 μL RNA-extractieoplossing (zie Tabel van Materialen)op celsorteerder met 70 μm-mondstuk.
- Meng en bewaar bij -80 °C tot alle monsters zijn geoogst. Ga vanaf dit punt alleen verder wanneer alle monsters die nodig zijn voor een experiment worden geoogst om de technische variatie tussen de rondes van de voorbereiding van de bibliotheek te verminderen.
3. RNA-extractie
OPMERKING: Het protocol is aangepast aan de RNA isolatiekit; zie Tabel met materialen.
- Voeg aan elk monster 500 μL rna-extractieoplossing (zie tabel van materialen)toe om het totale volume 1000 μL te maken.
- Ontdooi elk monster op kamertemperatuur.
- Vortex elk monster voor 1,5 min, ervoor te zorgen dat de dop veilig is op elke buis voordat u begint met homogenisatie. Het homogenaat gedurende 5 minuten incubeermen bij kamertemperatuur (15-25 °C).
- Voeg 140 μL chloroform, dopbuis stevig toe en schud krachtig gedurende 15 s. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
- Centrifuge gedurende 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C. Breng de bovenste waterfase over naar een nieuwe inzamelbuis op ijs. Breng geen interfase of een organische fase over. Bij het naderen van de roze organische fase, tip de buis aan de zijkant en verwijder kleine aliquots totdat er geen duidelijke waterige fase kan worden verzameld.
- Meet het volume RNA dat waterige fase bevat die uit elk monster is verzameld voor de juiste berekening in de volgende stap.
- Voeg 1,5 volumes (meestal 525 μL, maar kan iets meer of minder) van 100% ethanol en meng grondig door pipetting.
- Pipet tot 700 μL monster, inclusief eventuele neerslag, in kolom in een 2 mL collectie buis. Sluit het deksel en centrifuge op ≥8.000 x g voor 15 s bij kamertemperatuur. Gooi de doorstroom weg.
- Herhaal stap 3.8 met de rest van het monster.
- Was de kolom volgens de instructies van de fabrikant. Droog de kolom door te draaien op volle snelheid gedurende 1 min. Breng de kolom over naar een nieuwe 1,5 mL-opvangbuis.
- Pipet 11 μL nucleasevrij water op het midden van het membraan. Laat zitten op kamertemperatuur gedurende 1 min. Spin max snelheid voor 1 min om elute uit de kolom.
- Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer en een parallel capillaire elektroforese-instrument(Tabel van materialen).
4. Voorbereiding van de bibliotheek
OPMERKING: Het protocol is aangepast uit het handboek van de kleine RNA-bibliotheekvoorbereidingskit; zie Tabel met materialen.
- Voltooi de denaturatie en 3'-adapter ligatie zoals vermeld in het kleine RNA-bibliotheekpreparaathandboek met behulp van 1/4 verdunning van 3'-adapter.
- Doorgaan met overtollige 3 'adapter verwijderen.
- Vul de adapteruitputting in zoals vermeld in het kleine RNA-bibliotheekvoorbereidingspakkethandboek. Zorg ervoor dat u vers bereide 80% ethanol te gebruiken voor de kraal opruimen en dat alle overtollige ethanol is volledig verwijderd net voor de resuspensie in nuclease-vrij water zonder over-drogen van de kralen (kraken van de kraal pellet wordt waargenomen bij overdroging).
- Ga direct over tot overmatige adapter inactivatie.
- Voltooi de overtollige adapter inactivatie zoals vermeld in de kleine RNA bibliotheek voorbereiding kit handboek samenstellen van alle reagentia op ijs.
- Ga verder naar 5' 4N adapter ligation.
- Complete 5 'adapter ligation zoals vermeld in de kleine RNA bibliotheek voorbereiding kit handboek wordt zeker een 1 / 4 verdunning van de 5 'adapter te gebruiken en het monteren van alle reagentia op ijs.
- Ga verder met het terugdraaien van transcriptie.
- Volledige omgekeerde transcriptie-eerste streng synthese zoals vermeld in de kleine RNA bibliotheek voorbereiding kit handboek en het verzorgen van alle reagentia monteren op ijs en niet het houden van het enzym uit de vriezer voor langere tijd.
OPMERKING: Op dit punt kan het protocol worden gestopt, met monsters die 's nachts bij 4 °C zijn opgeslagen. U ook doorgaan met PCR-versterking. - Complete PCR versterking door het monteren van de reagentia zoals vermeld in de kleine RNA bibliotheek voorbereiding kit handboek en het minimaliseren van het aantal PCR cycli. Het aantal PCR-cycli moet voor elke toepassing experimenteel worden bepaald en het minimumaantal cycli moet worden gebruikt. Hier gebruikten we 16 cycli om onze kleine RNA-bibliotheken succesvol te versterken.
- Ga direct naar de grootte selectie.
5. Grootteselectie
- Voeg aan elk monster 5 μL 6x gel ladingkleurstof en pipet toe om te mengen.
- Laad 10 μL ladder naar de eerste put van de gel, waardoor de put onmiddellijk aan de rechterkant leeg. Laad al het product van stap 5.1 op een 6% Tris/borate/ethyleenediaminetetraacetic acid – polyacrylamide gel (TBE-PAGE) en laat 1 rijstrook tussen elk monster.
OPMERKING: Bewaar de container die de gel heeft aangetroffen voor volgende stappen. - Voer de gel op 150 V voor ongeveer 30-40 min in 0,5x TBE lopende buffer (totdat de onderste kleurstof band is in de buurt van de onderkant van de gel, 0,5-1 cm).
- Maak 1 L kleuroplossing terwijl de gel draait: SYBR Gold verdund 1:10.000 in 0,5x TBE.
- Wanneer de gel klaar is met lopen (d.w.z. de onderste kleurstofband ligt aan de onderkant van de gel), verwijder dan voorzichtig de gel van de glasplaten, waarbij de oriëntatie van de gel wordt vermeld.
- Plaats de gel in de lade van de originele verpakking. Verwijder de 0,5x TBE en vervang de kleuroplossing vanaf stap 5.5. Vlekgel gedurende 15 minuten. De kleuringstijd moet mogelijk worden verhoogd.
- Plaats de gel op een UV-transilluminator, zorg ervoor dat de gel niet rippen en het behoud van de oriëntatie hierboven vermeld (re-vlek voor extra tijd als banden van de ladder niet duidelijk kan worden gezien).
- Beeld de gel zodra de kleuring is voltooid op UV-transilluminator met een camera.
- Als een beter beeld nodig is, gebruik dan eerst een ander beeldvormingsapparaat dan de UV-transilluminator om een beeld van de gel vast te leggen voordat u de banden op een UV-transilluminator uitknipt als beeldvorming rechtstreeks op de UV-transilluminator, veroorzaakt de variabele kleuring van de achtergrond zoals afgebeeld in figuur 3A-B. Beweeg de gel niet te vaak omdat deze delicaat is en kan scheuren.
- Identificeer en verwijder de ~ 150 bp band met behulp van een schoon scheermesje en plaats in schone 1,5 mL buis. Knip de ~130 bp-band (adapter dimerproduct) niet uit.
- Afbeelding van de gel opnieuw na het verwijderen van de plakjes met het bibliotheekproduct voor documentatiedoeleinden.
- Draai de microcentrifugebuizen met de gelschijf op maximale snelheid voor 30 s om de plakjes aan de onderkant van elke buis te verzamelen.
- Gebruik een p200-tip voor elk monster om het plakje gel in de kleinst mogelijke stukjes te verpletteren. Gooi elke punt in elke buis.
- Voeg aan elke buis 300 μL elutiebuffer toe, waarbij u ervoor zorgt dat de gelbits van de buis worden gewassen en de p200-tip opnieuw worden vastgehaakt en de punt voor elk monster wordt afgewassen.
- Plaats de eluting monsters in een schudden incubator ingesteld op 25 °C. Incubeer 's nachts met 1000 rpm schudden. Verwijder buizen uit de couveuse en draai op maximale snelheid gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng de supernatant met het bibliotheekproduct over op een 2 mL RNase gratis 96 putplaat. Zorg ervoor dat u geen gel overdraagt.
- Voeg 50 μL opruimen kralen aan elk monster en meng door pipetting. Voeg onmiddellijk 350 μL isopropanol toe en meng door pipetting. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met schommelen.
- Pulse spin plaat om kralen pellet en vervolgens magnetiseren voor 2 min. Verwijder en gooi de supernatant voorzichtig weg.
- Voeg 950 μL ethanol toe. Incubeer voor 30 s. Verwijder alle supernatant. Herhaal dit voor in totaal twee ethanolwasbeurten.
- Droog het monster 3 min. Bij deze stap zorg voor het verwijderen van eventuele resterende ethanol die verzamelt aan de onderkant van elke put (niet meer dan een keer) en niet overdrogen van de kralen (overdrogen zal resulteren in scheuren van de kraal pellet).
- Verwijder alle restvloeistof aan de onderkant van de put. Haal de plaat van de magnetische standaard.
- Resuspend de pellet in 13 μL resuspensie buffer. Meng door pipet tot homogeen. Incubeer gedurende 2 min en magnetiseer vervolgens gedurende 3 min.
- Breng 12 μL supernatant over naar een schone buis of een put van schone plaat voor latere opslag. Bewaar alle monsters 's nachts op 4 °C of -20 °C op lange termijn.
- Controleer de grootte en concentratie van fragmenten aanwezig in elke bibliotheek met behulp van de capillaire elektroforese hoge gevoeligheid DNA-test. Bevestig de concentratie met meer dan één methode.
OPMERKING: We hebben af en toe de standaard gevoeligheidskit gebruikt om overbelasting van de capillaire elektroforese te voorkomen.
Representative Results
Aan de hand van de hier aangetoonde procedure hebben we embryo's geoogst op E7.5, E8.5 en E9.5. Extraembryonische structuren werden verwijderd uit alle embryo's en vervolgens embryo's werden somiet geënsceneerd om 6-uurs tijdintervallen op te lossen (Figuur 1A-1B). Met behulp van principe component analyse om monsters te groeperen op basis van gelijkenis, vinden we dat monsters cluster naar leeftijd, met de nadruk op de variatie als gevolg van de embryonale leeftijd en de noodzaak van zorgvuldige somite matching voor biologische replica's (Figuur 1C). We geprofileerd de pluripotente epiblast op E7.5, lineage getraceerd premigratoratory en migrerende neurale kam cellen met behulp van Wnt1-Cre op E8.5 en migrerende neurale kuif cellen met behulp van Sox10-Cre op E9.5 (Figuur 1D). Hier oogsten we specifiek de schedelneurale kam door het embryo net boven de otische vlechtcode te onthoofden. Een vergelijking van de twee Cre-drivers (Wnt1 en Sox10) die vaak worden gebruikt om neurale kuifcellen te labelen, bevestigt dat ze verschillende populaties markeren in vroege muisembryo's(figuur 1E). Gating-strategieën werden gebruikt om levende afzonderlijke RFP-positieve cellen te verkrijgen die rechtstreeks werden gesorteerd in RNA-extractieoplossing (zie tabel van materialen)en opgeslagen bij -80 °C (figuur 1F). Het is belangrijk om bij te houden hoeveel cellen werden geoogst uit elk monster.
RNA-isolatie werd uitgevoerd met behulp van een aangepaste versie van het RNA-kitprotocol. Concreet gebruiken we de mini RNA kolommen die bij 4 °C moeten worden opgeslagen. Deze kolommen zijn nuttig voor het eluting in een klein volume (11 μL) om de hoogst mogelijke concentratie van RNA te verkrijgen uit monsters waar de celinvoer beperkt is. Om dezelfde reden is het belangrijk om alle waterige fase na de fenolchloroforme extractie te verkrijgen. Langzaam pipetten en kantelen van de buis aan de ene kant tijdens het verzamelen zijn van cruciaal belang om de opbrengst te maximaliseren. In deze procedure kwantificeren we het RNA met behulp van zowel een spectrofotometer, om informatie te verkrijgen over zout/eiwitverontreiniging en een capillaire elektroforese om de concentratie te meten (figuur 2). De spectrofotometer spoor blijkt dat RNA werd geïsoleerd zonder besmette eiwitten, maar heeft een hoog zoutgehalte (Figuur 2A-2B). Idealiter moet de 260/280 verhouding ~1,8 zijn en de 260/230-verhouding moet >2,0 zijn. De totale RNA-opbrengst zoals gemeten door de spectrofotometer steeg niet met de leeftijd tussen E8.5-E9.5. Dit is te wijten aan de resolutie van de spectrofotometer die niet gevoelig genoeg is om veranderingen in de RNA-concentratie te detecteren van het aantal cellen dat we oogsten, en we raden aan de concentratie-informatie te gebruiken die is verkregen uit de capillaire elektroforese(figuur 2C). Het capillaire elektroforesespoor kan worden gebruikt om de concentratie en grootte van de RNA-fragmenten te schatten. Pieken <1000 nucleotiden zijn indicatief voor degradatie. Het representatieve spoor is consistent met RNA dat niet wordt afgebroken. Pieken in 2000 nucleotiden en 5100 nucleotiden zijn respectievelijk 18s en 28s rRNA. De kleine RNA-regio bevindt zich op ~150 nucleotiden (figuur 2D).
Kleine RNA sequencing bibliotheken werden voorbereid met behulp van de kleine RNA bibliotheek prep kit beschreven in de tabel van materialen. Hier gebruiken we iets minder dan de helft van het RNA verkregen uit elk monster (4 μL van de 11 μL elutie, ~ 80-120 ng) waarmee RNA-sequencing bibliotheken kunnen worden gesynthetiseerd uit het resterende RNA uit elk monster. Hier verdunnen we de 3' en 5 'kleine RNA adapters 1/ 4 om de hoeveelheid adapter dimers aanwezig te verlagen en suggereren dat de adapter ligation, cleanup, en reverse transcriptie stappen worden voltooid zoveel mogelijk op een continue manier. We hebben 16 PCR-cycli gebruikt om de bibliotheken te versterken en suggereren dat het minimumaantal PCR-cycli voor elk experiment empirisch wordt bepaald. Door het invullen van overtollige PCR cycli, kan men kunstmatig blazen de gelezen telling van een nederig uitgedrukte miRNA.
Grootte selectie is noodzakelijk om te verrijken voor bibliotheken van miRNAs en niet adapter dimers, die meestal aanwezig zijn. De bibliotheek productgrootte (150 bp) en adapter dimers (130 bp) zijn zeer vergelijkbaar in grootte. Gelextractie wordt gebruikt om de kleine RNA-sequencingbibliotheken uit de buurt van de adapterdimers te isoleren (figuur 3). Een afbeelding van een PAGE gel voor excisie toont aan dat in elk monster een veelheid aan productformaten aanwezig zijn(figuur 3A). Het is belangrijk om één rijstrook open te laten tussen twee monsters of een ladder die op de gel wordt geladen. De migratie voorzijde aan de onderkant van de gel is licht gebogen wat aangeeft dat het lopen op een lagere snelheid nodig kan zijn als de 150 bp band is moeilijk te onderscheiden voor alle monsters. Deze representatieve afbeelding toont ook een overvloed van 150 bp product van de hogere concentratie van positieve controle RNA (totale RNA uit de hersenen van een rat) die ging in de bibliotheek prep in vergelijking met die welke ging in elke embryonale monster. Uit de negatieve controle blijkt dat de reagentia vrij waren van besmettende nucleïnezuursoorten (figuur 3A). Excisie van de 150 bp band moet worden gedaan met een schoon scheermesje en het verzamelde gebied wordt weergegeven in figuur 3B. Capillaire elektroforese sporen voor en na grootte selectie tonen de dramatische verbetering van de zuiverheid van de 150 bp bibliotheek product met gel zuivering (Figuur 3C-3D). Het is belangrijk op te merken dat de sporen in figuur 3C-3D monsterpieken hoger hebben dan de markers, wat wijst op overbelasting. In deze gevallen kan de grootte van de fragmenten nauwkeurig zijn, maar de concentratie kan niet. Kwantificering kan worden verkregen door de bibliotheken te verdunnen in het bereik van de markers of met behulp van alternatieve methoden. We vinden enige variatie tussen alternatieve methoden van bibliotheek kwantificering en raden aan dat meerdere methoden van kwantificering empirisch worden getest. Nauwkeurige kwantificering van de concentratie is essentieel bij het maximaliseren van het aantal monsters dat in één keer moet worden gesequenced. Bibliotheken zullen worden verdund tot 1,3 pM voor sequencing en over het algemeen overal van 15-25 monsters kunnen worden gesequenced in een keer op een 150 cyclus sequencing kit die ~ 140 miljoen leest biedt. Dit resulteert in ongeveer 5 miljoen reads per steekproef. Over het algemeen mapping tarieven zijn tussen de 60-80%.
Figuur 1: Het oogsten van cellen uit muisembryo's voor kleine RNA-sequencing. (A) E8.5 muisembryo om de verwijdering van de dooierzak en somites te benadrukken die worden gebruikt om het stadium van het embryo te bepalen (B) Somite enscenering van muisembryo's om de stadia van neurale kamontwikkeling(C) Te vangen Principecomponentanalyse van bibliotheken die zijn voorbereid op gesorteerde neurale kamcellen die aantoont dat monsters groeperen op leeftijd (D) Schema dat laat zien hoe monsters werden geoogst met behulp van Wnt1-Cre op E8.5 om premig te etiketteren Recreante en migrerende neurale kamcellen en Sox10-Cre op E9.5 om alleen migrerende neurale kuifcellen(E)Te etiketteren Principecomponentanalyse van bibliotheken die zijn voorbereid op gesorteerde neurale kamcellen die monsters tonen die door Cre-driver worden samengebracht, ongeacht leeftijd(F)Gating-strategie die wordt gebruikt om RFP+ neurale kuifcellen te isoleren van E8.5- en E9,5-embryo's met behulp van FACS-sortering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: RNA isolatie van E7.5-E9.5 muisembryo's. (A) Representatief spectrofotometerspoor van een RNA-isolatie van het jongste embryostadium dat we dit protocol hebben toegepast. (B) Tabel met de representatieve waarden van de RNA-kwaliteit die uit de spectrofotometer zijn verkregen. (C) Voorbeeld van het RNA geoogst uit gesorteerde neurale kamcellen uit embryo's van elke leeftijd(D) Capillaire elektroforese spoor met een goede kwaliteit RNA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: miRNA-bibliotheken voor en na grootteselectie. (A) TBE-PAGE gel met representatieve kleine RNA-bibliotheken voor vier monsters en controles vóór en (B) na 150 bp band excisie. De pijlen vertegenwoordigen de 150 bp band te worden uitgesneden (C) Capillaire elektroforese spoor van kleine RNA bibliotheek voor en (D) na grootte selectie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Ontwikkelingsprocessen kunnen snel verlopen, en cellen ondergaan vele opeenvolgende specificaties zodanig dat om een uitgebreid beeld van de miRNAs bij te dragen aan vroege lotbeslissingen, meer specifieke fasering nodig is dan de veelgebruikte halve dagtoename. Een recente studie heeft uitgevoerd RNA sequencing van Theiler fase 12 embryo's die variëren van het hebben van 3 tot 6 somites11. We vinden dat tijdens deze periode, de neurale kam cellen worden gespecificeerd (3 somites van leeftijd), delamineren (4 somites van leeftijd), en migreren (5-6 somieten van leeftijd). We vinden ook dat naast de Cre-driver gebruikt om trace cel populaties stam, leeftijd is de grootste bron van variatie tussen biologische monsters, en alleen somiet overeenkomende embryo's moeten worden beschouwd als replica's. Hiermee moet ook rekening worden gehouden bij de vergelijking van transgene embryo's met wildtypecontroles.
Eerdere methoden om miRNAs tijdens de vroege ontwikkeling te profileren, hebben tussen 10-100 ng RNA-invoer gebruikt voor kleine RNA-sequencing bibliotheekpreparaat en hebben meerdere embryo's samengevoegd tot één monster13,14. We demonstreren RNA isolatie en bibliotheek voorbereiding van een enkele E7.5 embryo of van gesorteerde neurale kuif cellen op E8.5 en E9.5 met behulp van ongeveer 100 ng van de totale RNA als input. Bij het scheiden van embryo's voor het sorteren, moet men ervoor zorgen om de dissociatie onder een microscoop te bekijken en de reactie te doven om te observeren wanneer enkele cellen worden verkregen. We vinden dat dissociatie van de schedelstreek van E8.5-E9.5 embryo's bijna direct is met zachte handmatige pipetting zoals beschreven in het protocol. Voor grotere weefsels en steeds oudere embryo's kan de dissociatietijd langer zijn, afhankelijk van het gedeelte van het embryo dat gescheiden wordt. Voor E7.5-E9.5 embryo's zijn klonten cellen gemakkelijk zichtbaar onder de microscoop en moet de dissociatie doorgaan totdat er geen klontjes meer zichtbaar zijn. Enkele cellen zijn zichtbaar in oplossing als u de focus aan te passen door de oplossing in uw put overal van 5-10x. Eerdere methoden sorteren cellen rechtstreeks in lysebuffer voor RNA-sequencing om bulkRNA voor te bereiden uit een laag aantal cellen14. Hier sorteren we direct in RNA extractie lyse oplossing, zodat RNA kan worden geïsoleerd voor het begin van de bibliotheek voorbereiding. Het gebruik van minikolommen met een elutievolume van 11 μL zorgde voor een hoog genoeg RNA-concentratie, zodat een enkele RNA-prep kan worden gesplitst tussen kleine RNA- en bulkRNA-sequencing.
Een huidige beperking van de meeste kleine RNA sequencing methoden is de PCR versterking van geconverteerde cDNA. Onze methode niet te overwinnen deze beperking, maar we waren in staat om het aantal PCR-cycli te minimaliseren van de 25-maximale aanbevolen tot 16 cycli. Deze vermindering van de versterking vermindert kunstmatige versterking bias geïntroduceerd door PCR. Een andere bron van bias is de ligatie van adapters, waar bekend is dat specifieke sequenties gelegen aan de uiteinden van adapters en miRNAs kunnen ligate samen met een grotere efficiëntie dan andere sequenties. Om dit te voorkomen, de adapters die in dit protocol worden gebruikt, hebben 4 willekeurige bases aan het einde van elke adapter om bias in ligatiereacties te voorkomen. Bovendien, een ander gemeenschappelijk probleem is de hoeveelheid adapter dimers die vorm wanneer de RNA-ingang laag is. De bibliotheek voorbereiding kit bevat stappen om adapter dimer vorming te verminderen, zoals adapter inactivatie en kraal cleanups om overtollige adapters te verwijderen na elke ligatie. We hebben ook de 3' en 5' 4N adapters met 1/4 verdund om de hoeveelheid adapterverduister die zich kan vormen te verminderen. We vonden dat wanneer niet verdund, de 130 bp band intensiteit toeneemt waardoor het moeilijk te onderscheiden van de 150 bp band met de gewenste kleine RNA bibliotheken op een gel.
Een andere huidige uitdaging van de voorbereiding van sequencing bibliotheken is de nauwkeurige kwantificering van het product voorafgaand aan de sequencing. We hebben ontdekt dat verschillende methoden verschillende resultaten geven op dezelfde bibliotheek. We stellen voor dat de onderzoekers meerdere kwantificeringsmethoden gebruiken om een nauwkeurige schatting van de concentratie te krijgen.
Dit protocol kan op grote schaal worden toegepast op genetische, ontwikkelingsstudies, of andere toepassingen waar RNA wordt geoogst uit een laag aantal cellen. Deze aanpak vereenvoudigt temporele studies door het vermijden van het bundelen van embryo's en kan gemakkelijk worden toegepast op zowel niet-gesorteerde als gesorteerde cellen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door Andrew McDonough B+ Foundation en de NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. is een CPRIT Scholar in Cancer Research (RR150106) en V Scholar in Cancer Research (V Foundation). De auteurs willen ook de Cytometrie en Cell Sorting Core bij BCM erkennen voor het leveren van apparatuur die nodig is voor dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P.
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
