Summary
אנו מתארים טכניקה לפרופיל microRNAs בעוברי עכבר מוקדם. פרוטוקול זה מתגבר על האתגר של קלט תאים נמוך והעשרת RNA קטנה. תוואי זה יכול לשמש כדי לנתח שינויים בביטוי miRNA לאורך זמן בנסיגות תאים שונים של עובר העכבר המוקדם.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) חשובים לרגולציה מורכבת של החלטות גורל התא ותזמון התפתחותי. במחקרי vivo של התרומה של miRNAs במהלך פיתוח מוקדם הם מאתגרים מבחינה טכנית בשל מספר התא המגביל. יתר על כן, גישות רבות דורשות miRNA של עניין להיות מוגדר בהגדרה כגון כתמים צפוניים, מיקרו-מסוף, ו qPCR. לכן, הביטוי של miRNAs רבים והזופורמים שלהם לא נחקרו במהלך התפתחות מוקדמת. כאן, אנו מדגימים פרוטוקול עבור רצף RNA קטן של תאים ממוינות מעוברי עכבר מוקדם כדי לאפשר פרופיל משוחד יחסית של miRNAs באוכלוסיות מוקדמות של תאי ציצה עצביים. אנו מתגברים על האתגרים של קלט תא נמוך ובחירה בגודל במהלך הכנת הספרייה באמצעות הגדלה וטיהור מבוסס ג'ל. אנו מזהים את הגיל העוברי כחשבונאות משתנה עבור וריאציה בין משכפלים ועוברי עכבר תואמי במה חייב לשמש לפרופיל מדויק miRNAs בשכפולים ביולוגיים. התוצאות שלנו מצביעות על כך שניתן להחיל שיטה זו בהרחבה על פרופיל הביטוי של miRNAs מנושאים אחרים של תאים. לסיכום, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד כיצד miRNAs לווסת תוכניות התפתחותיות בנסיגות תאים שונות של עובר העכבר המוקדם.
Introduction
שאלה מרכזית של ביולוגיה התפתחותית היא איך תא אחד לא מוערך יכול לגרום אורגניזם שלם עם סוגי תאים מורכבים רבים. במהלך embryogenesis, הפוטנציאל ההתפתחותי של תאים הופך בהדרגה מוגבל ככל האורגניזם מתפתח. דוגמה אחת היא תיחינת הפסגה העצבית, אשר בהדרגה מבדיל מאוכלוסיית תאים רב-תכליתיים לתוך נגזרות מסוף שונות, כגון נוירונים היקפיים, גליה, עצם גולגולת, וסחוס. תאי ציצה עצביים מוגדרים מן ectoderm במהלך gastrulation ולאחר מכן לעבור אפיתל למעבר mesenchymal ולעבור דרך העובר למיקומים דיסקרטיים בכל הגוף שבו הםיבדילו באופן סופני 1. עשרות שנים של עבודה חשפו רשת רגולטורית גנטית שעתוק, אבל הרבה פחות ידוע על המנגנונים של רגולציה פוסט תמלול לשלוט בתזמון של התפתחות ציצה עצבית.
עבודה קודמת מצביעה על כך microRNAs (miRNAs) לדכא ביטוי גנים עבור תזמון התפתחותי תקין וגורל תא החלטות2,,3,,4,,5,6. מחקרים של miRNAs בפיתוח ציצה עצבית התמקדו בעיקר בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות הגולגולת. לדוגמה, miR-17~92 ו- miR-140 הם קריטיים עבור palatogenesis במהלך פיתוח הגולגולת בעכבר ותדגי זברה,בהתאמה 7,8. תרומתם של miRNAs להחלטות הגורל העצביות המוקדמות ביותר של העובר לא נחקרה ביסודיות. מחקרים של miRNAs בהחלטות גורל מוקדם הוגבלו על ידי אתגרים טכניים כגון מספר התא הנמוך הנוכחי בעוברים מוקדמים.
MiRNAs כבר פרופיל במבחנה מקווי תא באמצעות גופים עובריים בשלבים שונים של בידול מודל פיתוח עכבר מוקדם9. החקירה של RNAs קטן בvivio במהלך פיתוח יונקים מוקדמים היה מוגבל יחסית. שיטות קודמות לפרופיל miRNAs הובילו להטיה כרצף ידוע משמש לניתוח ביטוי של miRNA ספציפי בשיטות כגון qPCR, מיקרו-מראיות, וכתמיםצפוניים 10. הדור הבא רצף ושיפור כלים מולקולריים עכשיו לאפשר ניתוח משוחד יחסית של ביטוי miRNA ללמוד את תרומתם להתפתחות יונקים מוקדמת החלטות גורל תא.
כאן, אנו מדווחים על טכניקה לקצור ורצף RNAs קטן לידי ביטוי בתאי ציצה עצביים מעוברי עכבר מוקדם המשתרעים gastrulation (E7.5) לתחילת organogenesis (E9.5). טכניקה זו פשוטה ומשלבת מעקב נסיון, מיון תאים ובחירה בגודל מבוסס ג'ל כדי להכין ספריות רצף RNA קטנות ממספר מינימלי של תאים לדור הבא. אנו מדגישים את החשיבות של התאמת שלב somite קפדנית של עוברים כדי לפתור מרווחי זמן של 6 שעות כדי לקבל תצוגה מקיפה של miRNAs במהלך השינויים המהירים של התפתחות מוקדמת. שיטה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על מחקרים גנטיים והתפתחותיים ונמנעת מאסף עוברים. אנו מתארים דרך להתגבר על אתגרים של שיטות נוכחיות כגון העשרה miRNA באמצעות טיהור מבוסס ג'ל, כימות ספריה, ומזעור הטיה שהוצגה מ- PCR. שיטה זו שימשה לזיהוי דפוסי ביטוי miRNA לאורך זמן כדי ללמוד כיצד miRNAs לשלוט תזמון התפתחותי ב ציווי הפסגה העצבית של עוברי עכבר.
Protocol
כל הליכי המחקר והטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי המכללה לרפואה ביילור מוסדי טיפול ובעלי חיים הוועדה לשימוש ושוכנו האגודה להערכה והסמכה של מעבדה בעלי חיים שאושרו טיפול בבעלי חיים מתקן במכללת ביילור לרפואה. כל הזנים נשמרו על רקע C57BL6.
1. פירוק עובר (E7.5-E9.5)
- הסר את קרני הרחם מעכבר נקבה בהריון, עיקור הבטן עם 70% אתנול שבו יש לחתך.
- לנקות את הרחם על ידי שטיפה עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS). מניחים את הרחם בצלחת פלסטיק סטרילית ב-10 ס"מ.
- באמצעות מספריים microdissection, להפריד כל החלטה המכילה אזור אחד מהשני. מקלפים את שריר הרחם וחושפים את כל ההחלטות. אחד אחרי השני, הסירו את ההכרעה מכל עובר.
- מוציאים את שאק החלמון מכל עובר ושמור על גנוטיפינג.
- להעביר את כל העוברים לתוך צלחת חדשה של PBS טרי להדמיה.
- תדמיתי את כל ההמלטה. תדמינו כל עובר בנפרד ותספור את מספר הנוכלים של כל עובר. שמור על הגדלה וחשיפה (לפלואורסצנס) זהה בין ניסויים.
הערה: אנו מוצאים כי חשיפה של 50-200 ms מתאימה לפלואורססנטיות וש-20 ms מתאימה להגדרת שדה בהיר.
2. פירוק עובר ומיון תאים
- כדי שכל עובר ימיין, עשה את הפעולות הבאות.
- ערפו את ראשם ממש מעל המקודד העילית עבור עוברים מעל E8.0 (אם רק תאים המסווים בתווית של אזור הגולגולת רצויים). עבור עוברי E7.5, הסר מבנים אקסטרמבריים (אם רק העובר הנכון רצוי).
- הזז את הראש בעוצמה מינימלית של PBS מעל לבאר נקייה של צלחת 48 באר. להוסיף 250 μL של פפאין (27 U /mL). פיפטה למעלה ומטה בעדינות באמצעות p200.
- בדוק מתחת למיקרוסקופ וחפש גושים ותאים בודדים.
- חזור על pipetting עדין למעלה ומטה עד מתלה תא יחיד מושגת (בדרך כלל שלושה סיבובים של pipetting למעלה ומטה אשר צריך להשוות בין 30 s ל 1 דקות עבור E7.5-E9.5).
- הרווה עם 250 μL של סרום בקר עוברי (FBS).
- חזור על שלבים 2.1.1-2.1.5 עבור כל עובר למיון.
- מסנן 500 μL של מתלה תא באמצעות צינור מכסה מסנן רשת ניילון 35 μm כדי להסיר גושים.
- קח את הסינון ולעבור חדש 1.5 מ"ל שפופרת ספין ב 200 x g במשך 5 דקות. הסר supernatant בזהירות ולהעביר צינור חדש (לשמור עד תאים חיים ידועים להיות גלולה).
- גלולת תא resspend ב 300 μL של PBS המכיל 0.5-1% אלבומין סרום בקר ולשמור על קרח עד מיון (למזער את הזמן מעכשיו ועד סוף המיון).
- אם תרצה, לקחת 10 μL של מתלה תא ולשלב עם 10 μL של כחול Trypan (0.4%) ולספור באמצעות hemocytometer לזהות כימות תאים משוערים וכדאיות כמו כחול Trypan רק מכתים תאים מתים.
- רגע לפני המיון, לסנן כל דגימה שוב דרך צינור מכסה מסנן ולהוסיף כתם DAPI עבור תאים חיים.
- מיין כל דגימה לתוך 500 μL של פתרון ליסיס חילוץ RNA (ראה טבלת חומרים) על סדרן תאים עם זרבובית 70 μm.
- מערבבים ומאחסנים ב-80°C עד שנקצרים את כל הדגימות. המשך לנקודה זו רק כאשר כל הדגימות הדרושות לניסוי נקצרות כדי להפחית את השונות הטכנית בין סבבי הכנת הספרייה.
3. חילוץ RNA
הערה: הפרוטוקול מותאם מערכת הבידוד של RNA; ראה טבלת חומרים.
- להוסיף 500 μL של פתרון ליסיס חילוץ RNA (ראה טבלת חומרים)לכל מדגם כדי להפוך את אמצעי האחסון הכולל 1000 μL.
- להפשיר כל דגימה בטמפרטורת החדר.
- מערבולת כל דגימה במשך 1.5 דקות, לוודא כי הכובע הוא מאובטח על כל צינור לפני תחילת homogenization. דגירה הומוגנית בטמפרטורת החדר (15-25 °C) במשך 5 דקות.
- להוסיף 140 μL של כלורופורם, צינור כובע בבטחה לנער במרץ עבור 15 s. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
- צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 x גרם ב-4°C. מעבירים את שלב המים העליון לצינור אוסף חדש על קרח. אין להעביר כל שלב בין-פאזה או כל שלב אורגני. כאשר מתקרבים לשלב האורגני הוורוד, הקצה את הצינור לצד ולהסיר aliquots קטן עד לא ניתן לאסוף שלב מים ברור.
- מדוד את אמצעי האחסון של RNA המכיל שלב מים שנאסף מכל דוגמה עבור החישוב הנכון בשלב הבא.
- להוסיף 1.5 כרכים (בדרך כלל 525 μL אבל יכול להיות קצת פחות או יותר) של 100% אתנול ולערבב ביסודיות על ידי pipetting.
- פיפט עד 700 מדגם μL, כולל כל משקע, לתוך עמודה בצינור אוסף 2 מ"ל. סגור את המכסה ואת הצנטריפוגה ב-≥,000 x g עבור 15 שניות בטמפרטורת החדר. תמחק את הזרימה.
- חזור על שלב 3.8 באמצעות שאר הדגימה.
- שטוף את העמודה בהתאם להוראות היצרן. יבש את העמודה על ידי סיבוב במהירות מלאה במשך 1 דקות. העבר את העמודה לצינור קולקציה חדש של 1.5 מ"ל.
- פיפט 11 μL של מים חינם גרעין על מרכז הממברנה. מאפשרים לשבת בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. סובב מהירות מרבית למשך דקה אחת כדי להמריא מהעמודה.
- למדוד ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר ומכשיר אלקטרופורזה נומי מקביל(טבלת חומרים).
4. הכנת הספרייה
הערה: הפרוטוקול מותאם ממדריך קטן של ערכת הכנה לספריית RNA; ראה טבלת חומרים.
- השלם את ההתרסה ואת קשירה מתאם 3' כאמור במדריך ערכת הכנה ספריית RNA קטן באמצעות דילול 1/4 של מתאם 3' .
- המשך להסרת מתאם עודף של 3'.
- השלם את ריקון המתאם כאמור במדריך הכנת ספריית RNA הקטן. הקפד להשתמש טרי מוכן 80% אתנול לניקוי חרוז, כי כל האתנול העודף מוסר לחלוטין רק לפני resuspension במים ללא גרעין מבלי לייבש יתר על פני החרוזים (פיצוח של גלולת החרוז נצפתה על ייבוש יתר).
- המשך ישירות להשבתת מתאם עודף.
- השלם את אי-הפעלה עודפת המתאם כאמור במדריך הכנת ספריית RNA הקטן הרכבת כל reagents על קרח.
- המשך ל-5' קשירה מתאם 4N.
- השלם 5' קשירה מתאם כאמור במדריך הכנת ספריית RNA קטן להיות בטוח להשתמש 1/4 דילול של מתאם 5 ' והרכבת כל reagents על קרח.
- המשך לתמלול הפוך.
- סינתזת גדיל ים-ראשון שעתוק הפוך מלא כאמור במדריך ערכת הכנה ספריית RNA קטן וטיפול להרכיב את כל reagents על קרח ולא לשמור את האנזים מחוץ למקפיא לפרקי זמן ממושכים.
הערה: בשלב זה, ניתן לעצור את הפרוטוקול, עם דגימות המאוחסנות למשך הלילה ב- 4 °C. לחלופין המשך להגדלת PCR. - השלם את ההגדלה של PCR על-ידי הרכבת הריגנטים כאמור במדריך קטן של ערכת הכנת ספריית RNA ומזעור מספר מחזורי PCR. יש לקבוע באופן ניסיוני את מספר מחזורי PCR עבור כל יישום ויש להשתמש במספר המחזורים המינימלי. כאן השתמשנו ב-16 מחזורים כדי להגביר בהצלחה את ספריות ה-RNA הקטנות שלנו.
- המשך ישירות לבחירת גודל.
5. בחירת גודל
- לכל דוגמה, להוסיף 5 μL של 6x ג'ל טעינת צבע פיפטה לערבב.
- טען 10 μL של סולם לבאר הראשונה של הג'ל, עוזב את הבאר מיד ימינה ריקה. טען את כל המוצר מ שלב 5.1 על 6% Tris / borate / אתילנדיאמיןtraacetic חומצה – ג'ל polyacrylamide (TBE-PAGE) ולהשאיר נתיב אחד בין כל מדגם.
הערה: שמור את המיכל שהז'ל נכנס לצעדים הבאים. - הפעל את הג'ל ב- 150 V למשך כ- 30-40 דקות במאגר ריצה של 0.5x TBE (עד שרצועה נמוכה יותר של צבע קרוב לתחתית הג'ל, 0.5-1 ס"מ).
- הפוך 1 L של תמיסת כתמים בזמן הג'ל פועל: זהב SYBR מדולל 1:10,000 ב 0.5x TBE.
- כאשר הג'ל סיים לרוץ (כלומר, רצועה בצבע נמוך יותר הוא ליד החלק התחתון של הג'ל), בזהירות להסיר את הג'ל מהצלחות זכוכית, ציון הכיוון של הג'ל.
- מניחים ג'ל במגש האריזה המקורית שלו. הסר את ה- TBE 0.5x והחלף בפתרון הכתמים בשלב 5.5. ג'ל כתם למשך 15 דקות. ייתכן שיהיה צורך להגדיל את זמן ההכתמה.
- מניחים את הג'ל על טרנסילום UV, דואגים לא לקרוע את הג'ל ולשמור על הכיוון ציין לעיל (כתם מחדש לזמן נוסף אם להקות של סולם לא ניתן לראות בבירור).
- תמונה הג'ל פעם הכתמה הושלמה על טרנסילום UV עם מצלמה.
- אם נדרשת תמונה טובה יותר, השתמש תחילה בהדמיה מלבד טרנסילומבינטור UV כדי ללכוד תמונה של הג'ל לפני חיתוך הרצועות על טרנסילומינגור UV כמו הדמיה ישירות על טרנסילום UV גורם צביעה משתנה של הרקע כפי שמצג איור 3A-B. אין להזיז את הג'ל פעמים רבות מדי כפי שהוא עדין עלול לקרוע.
- זהה והסר את הרצועה ~ 150 bp באמצעות סכין גילוח נקי ומקום לתוך צינור נקי 1.5 מ"ל. אל תחתוך את פס ~ 130 bp (מוצר dimer מתאם).
- תדמיינו שוב את הג'ל לאחר הסרת הפרוסות המכילות את מוצר הספרייה למטרות תיעוד.
- סובבו את צינורות המיקרו-צנטריפוגה המכילים את פרוסת הג'ל במהירות מרבית של 30 שניות כדי לאסוף את הפרוסות בתחתית כל שפופרת.
- השתמש בעצה p200 עבור כל דגימה כדי לרסק את פרוסת הג'ל לתוך הסיביות הקטנות ביותר האפשריות. תפלוט כל קצה לתוך כל צינור.
- לכל שפופרת, להוסיף 300 μL של חוצץ חוצץ, טיפול לשטוף חתיכות ג'ל מהצד של הצינור ולצרף מחדש את קצה p200 ולשטוף את הקצה עבור כל דגימה.
- מניחים את דגימות ההתחכך באינקובטור רועד ל-25 מעלות צלזיוס. דגירה לילה עם 1000 סל"ד רועד. הסר צינורות מהאינקובטור וסובב במהירות מרבית למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- העבר את supernatant המכיל את מוצר הספרייה לצלחת 2 מ"ל RNase חינם 96 באר. תדאג לא להעביר ג'ל.
- להוסיף 50 μL חרוזי ניקוי לכל מדגם ולערבב על ידי pipetting. מיד, להוסיף 350 μL של isopropanol ולערבב על ידי pipetting. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות עם נדנדה.
- צלחת ספין דופק לחרוזי כדורי ולאחר מכן מגנטיזציה במשך 2 דקות. הסירו בזהירות וזרקו את הסופרנטנט.
- להוסיף 950 μL של 80% אתנול. דגירה ל-30 שניות. הסר את כל הסופרנטנטים. חזור על הפעולה עם שתי שטיפה אתנול.
- מייבשים את הדגימה למשך 3 דקות. בשלב זה יש לדאוג להסיר כל שאריות אתנול האוסף בתחתית כל באר (לא יותר מפעם אחת) ולא לייבש יתר על כן את החרוזים (ייבוש יתר יגרום לפיצוח של גלולת החרוז).
- הסר את כל שאריות הנוזל בתחתית הבאר. הסר את הלוח מהעמדה המגנטית.
- תוסתה מחדש את הכדור ב-13 μL של מאגר תגמול מחדש. מערבבים לפיפט עד להומוגני. דגירה במשך 2 דקות ולאחר מכן מגנטיזציה במשך 3 דקות.
- להעביר 12 μL של supernatant לצינור נקי או גם של צלחת נקייה לאחסון הבא. אחסן את כל הדגימות ב- 4°C בלילה או -20 °C לטווח ארוך.
- בדוק את הגודל והריכוז של שברים הנוכחים בכל ספרייה באמצעות אלקטרופורזה נימה רגישות גבוהה DNA אסה. אשר את הריכוז ביותר משיטה אחת.
הערה: השתמשנו מדי פעם בערכת הרגישות הסטנדרטית כדי להימנע מעומס יתר על האלקטרופורזה של נימה.
Representative Results
באמצעות ההליך שהוצג כאן, קצרנו עוברים ב E7.5, E8.5, ו E9.5. מבנים אקסטרמבריים הוסרו מכל העוברים ולאחר מכן העוברים היו somite מבוים כדי לפתור מרווחי זמןשל 6שעות ( איור 1A-1B). באמצעות ניתוח רכיבים עקרוניים לקבץ דגימות המבוססות על דמיון, אנו מוצאים כי דגימות אשכול לפי גיל, הדגשת וריאציה כתוצאה של גיל עוברי ואת הצורך התאמת somite זהיר עבור משכפלים ביולוגיים (איור 1C). יצרנו פרופיל epiblast pluripotent ב E7.5, lineage מעקב תאי ציצה עצבית נודדת באמצעות Wnt1-Cre ב E8.5 ותאי ציצה עצבית נודדים באמצעות Sox10-Cre ב E9.5 (איור 1D). כאן אנו קוצרים באופן ספציפי את הפסגה העצבית הגולגולתית על ידי עריפת ראשו של העובר ממש מעל המקודד האוטי. השוואה בין שני נהגי Cre (Wnt1 ו- Sox10) המשמשים לעתים קרובות לסימון תאי ציצה עצביים מאשרת שהם מסמנים אוכלוסיות שונות בעוברי עכברמוקדמים (איור 1E). אסטרטגיות Gating שימשו כדי להשיג תאים חיוביים RFP יחיד חי אשר היו ממוינים ישירות לתוך פתרון תמצית RNA (ראה טבלת חומרים)ומאוחסנים ב -80 °C(איור 1F). חשוב לעקוב אחר מספר התאים שנקצרו מכל דגימה.
בידוד RNA בוצע באמצעות גירסה שהשתנתה של פרוטוקול ערכת RNA. באופן ספציפי, אנו משתמשים בעמודות RNA המצומצם שיש לאחסן ב- 4 °C. עמודות אלה שימושיות עבור התחכך אמצעי אחסון קטן (11 μL) כדי לקבל את הריכוז הגבוה ביותר האפשרי של RNA מדגימות שבו קלט התא מגביל. מאותה סיבה, חשוב להשיג את כל השלב המיוחל לאחר החילוץ פנול כלורופורם. התפתות איטיות והטיית הצינור לצד אחד תוך כדי איסוף הן קריטיות כדי למקסם את התשואה. בהליך זה, אנו לכמת את RNA באמצעות ספקטרופוטומטר, כדי לקבל מידע על זיהום מלח / חלבון, ואלקטרופורזה נימה כדי למדודריכוז (איור 2). עקבות הספקטרופוטומטר מגלה כי RNA היה מבודד ללא חלבונים מזהמים אבל יש תכולת מלח גבוהה(איור 2A-2B). באופן אידיאלי יחס 260/280 צריך להיות ~ 1.8 ואת יחס 260/230 צריך להיות >2.0. תפוקת ה-RNA הכוללת כפי שנמדדה על ידי ספקטרופוטומטר לא גדלה עם הגיל בין E8.5-E9.5. זאת בשל הרזולוציה של ספקטרופוטומטר לא להיות רגיש מספיק כדי לזהות שינויים בריכוז RNA ממספר התאים שאנו קוצרים, ואנחנו ממליצים להשתמש במידע הריכוז המתקבל אלקטרופורזה נימה(איור 2C). ניתן להשתמש במעקב האלקטרופורזה של נימה כדי להעריך את הריכוז והגודל של שברי ה-RNA. פסגות <1000 נוקלאוטידים מצביעות על השפלה. העקבות המייצגות תואמות ל- RNA אינו מושפל. פסגות ב 2000 נוקלאוטידים ו 5100 נוקלאוטידים הם 18s ו 28s rRNA, בהתאמה. אזור RNA הקטן ממוקם ב ~ 150 נוקלאוטידים (איור 2D).
ספריות רצף RNA קטנות הוכנו באמצעות ערכת ההכנה הקטנה לספריית RNA המתוארת בטבלת החומרים. כאן אנו משתמשים רק פחות ממחצית RNA המתקבל מכל מדגם (4 μL של 11 μL elution, ~ 80-120 ng) המאפשר ספריות רצף RNA להיות מסונתז מן RNA הנותרים מכל מדגם. כאן אנו מדללים את מתאמי ה-RNA הקטנים של 3 ו-5 אינץ' 1/4 כדי להפחית את כמות דימרים המתאם הנוכחיים ולהציע כי הרצועות של המתאם, הניקוי וצעדי שעתוק הפוך יושלמו ככל האפשר באופן רציף. השתמשנו 16 מחזורי PCR כדי להגביר את הספריות ולהציע כי המספר המינימלי של מחזורי PCR עבור כל ניסוי ייקבע באופן אמפירי. על ידי השלמת מחזורי PCR עודפים, אחד יכול באופן מלאכותי לנפח את ספירת הקריאה של miRNA מבוטא נמוך.
בחירת גודל היא הכרחית כדי להעשיר עבור ספריות של miRNAs ולא dimers מתאם, אשר קיימים בדרך כלל. גודל המוצר של הספרייה (150 bp) ו dimers מתאם (130 bp) דומים מאוד בגודלם. מיצוי ג'ל משמש לבידוד ספריות רצף RNA קטנות הרחק מעומעמים המתאם (איור 3). תמונה של ג'ל PAGE לפני ההתבקות מראה כי מספר רב של גדלי מוצר נמצאים בכל דוגמה(איור 3A). חשוב להשאיר נתיב אחד פתוח בין כל שתי דגימות או סולם נטען על הג'ל. חזית הנדידה בתחתית הג'ל מעוקלת במקצת ומעידה על כך שריצה במהירות איטית יותר עשויה להיות נחוצה אם קשה להבחין בין רצועה של 150 bp לכל הדגימות. תמונה מייצגת זו גם מראה שפע של מוצר 150 bp מן הריכוז הגבוה יותר של RNA שליטה חיובית (RNA הכולל ממוח של חולדה) שנכנס הכנה הספרייה לעומת זה שנכנס לכל מדגם עוברי. השליטה השלילית מגלה כי הריגנטים היו חופשיים מזן חומצה גרעין מזוהם(איור 3A). ניתוב של פס 150 bp צריך להיעשות עם סכין גילוח נקי ואת האזור שנאסף מוצג איור 3B. עקבות אלקטרופורזה נימה לפני ואחרי בחירת גודל להראות את השיפור הדרמטי של הטוהר של המוצר ספריית 150 bp עם טיהור ג'ל (איור 3C-3D). חשוב לציין כי העקבות באות 3C-3D יש פסגות מדגם גבוה יותר מאשר סמנים, המציין עומס יתר. במקרים אלה, גודל השברים יכול להיות מדויק, עם זאת הריכוז לא יכול. ניתן להשיג כימות על-ידי דילול הספריות לטווח הסמנים או שימוש בשיטות חלופיות. אנו מוצאים וריאציה מסוימת על פני שיטות חלופיות של כימות ספרייה וממליצו כי שיטות מרובות של כימות ייבחנו באופן אמפירי. כימות מדויקת של ריכוז היא חיונית בעת מקסום מספר הדגימות להיות רצף בו זמנית. ספריות יהיה מדולל עד 1.3 pM לרצף ובדרך כלל בכל מקום בין 15-25 דגימות ניתן לרצף בו זמנית על 150 מחזור רצף ערכת המספק ~ 140 מיליון קורא. התוצאה היא כ-5 מיליון קריאה לכל מדגם. בדרך כלל שיעורי המיפוי הם בין 60%-80%.
איור 1: קצירת תאים עוברים של עכבר לצורך רצף RNA קטן. (A)E8.5 עובר העכבר כדי להדגיש את הסרת sac חלמון ו somites המשמשים כדי לקבוע את השלב של העובר (ב)ההיערכות Somite של עוברי עכבר כדי ללכוד את השלבים של התפתחות ציצה עצבית (ג) עיקרון ניתוח רכיבים של ספריות שהוכנו מתאי ציצה עצביים ממוינת מראה כי קבוצת דגימות לפי גיל (D) סכמטי מראה כיצד דגימות נקצרו באמצעות Wnt1-Cre ב E8.5 כדי לתייג premi תאי ציצה עצביים נודדים ותאי Sox10-Cre ב- E9.5 כדי לתייג רק תאי ציצה עצביים נודדים (ה) ניתוח רכיב עקרוני של ספריות שהוכן מcrecre עצבי מסוג wildtype ממוין תאים המציגים דגימות קבוצה יחד על ידי Cre-driver ללא קשר לגיל (F) Gating אסטרטגיה המשמשת לבודד RFP + תאי ציצה עצביים מעוברי E8.5 ו- E9.5 באמצעות מיון FACS. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: בידוד RNA מ- E7.5-E9.5 עוברי עכבר. (א)נציג ספקטרופוטומטר עקבות של בידוד RNA מהשלב הצעיר ביותר של העובר שיישנו פרוטוקול זה. (ב)טבלה המציגה את הערכים המייצגים של איכות RNA שהתקבלו מהספקטרופוטומטר. (ג)דוגמה של RNA שנקצרו מתאי ציצה עצביים ממוין מעוברים של כל גיל (D) עקבות אלקטרופורזה נימה מראה RNA באיכות טובה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ספריות miRNA לפני ואחרי בחירת גודל. (A) ג'ל TBE-PAGE המציג ספריות RNA קטנות מייצגות עבור ארבע דגימות ופקדים לפני ו- (B) לאחר 150 bp band excision. החצים מייצגים את פס 150 bp להיות excised (C) אלקטרופורזה נימה עקבות של ספריית RNA קטנה לפני ו - (D) לאחר בחירת גודל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
תהליכים התפתחותיים יכולים להתקדם במהירות, ותאים עוברים מפרטים רציף רבים כך כדי ללכוד תצוגה מקיפה של miRNAs התורם להחלטות גורל מוקדם, היערכות ספציפית יותר נדרשת מאשר התוחלות חצי יום בשימוש נרחב. מחקר שנערך לאחרונה ביצע רצף RNA מ Theiler שלב 12 עוברים אשר נע בין בעל 3 כדי 6 somites11. אנו מוצאים כי במהלך תקופה זו של זמן, תאי הפסגה העצבית מוגדרים (3 somites של גיל), delaminate (4 somites של גיל), ולנדיד (5-6 somites של גיל). כמו כן, אנו מוצאים כי מלבד נהג Cre המשמש לאוכלוסיות תאי מעקב ים, גיל הוא המקור הגדול ביותר של וריאציה בין דגימות ביולוגיות, ורק עוברים תואמים somite צריך להיחשב שכפולים. יש לקחת בחשבון גם בעת השוואת עוברים טרנסגנית לפקדי wildtype.
שיטות קודמות פרופיל miRNAs במהלך פיתוח מוקדם השתמשו בין 10-100 ng של קלט RNA עבור הכנת ספריית רצף RNA קטן יש מאגר עוברים מרובים לתוך מדגםאחד 13,14. אנו מדגימים בידוד RNA והכנת ספרייה מעובר E7.5 יחיד או מתאי ציצה עצביים ממוינות ב E8.5 ו- E9.5 באמצעות כ 100 ng של RNA הכולל כקלט. בעת ניתוק עוברים למיון, יש לדאוג לצפות בדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ ולהרוות את התגובה כדי לבחון מתי מתקבלים תאים בודדים. אנו מוצאים כי ניתוח של האזור הגולגולתי של E8.5-E9.5 עוברים הוא כמעט מיידי עם pipetting ידני עדין כמתואר בפרוטוקול. עבור רקמות גדולות יותר ועוברים מבוגרים יותר ויותר, זמן הדיסוציאציה עשוי להיות ארוך יותר בהתאם לחלק של העובר להיות מנותא. עבור עוברי E7.5-E9.5, גושי תאים גלויים בקלות מתחת למיקרוסקופ והדיסוציאציה צריכה להימשך עד שלא יהיו גושים נוספים גלויים. תאים בודדים גלויים בפתרון אם אתה מתאים את המוקד באמצעות הפתרון בבאר שלך בכל מקום מ 5-10x. שיטות קודמות למיין תאים ישירות לתוך מאגר lysis עבור רצף RNA כדי להכין RNA בצובר ממספר נמוך של תאים14. כאן אנו ממוינות ישירות לפתרון ליסיס החילוץ של RNA, כך שניתן יהיה לבודד את ה-RNA לפני תחילת הכנת הספרייה. שימוש בעמודות מיני עם נפח 11 μL elution מותר לריכוז RNA מספיק גבוה כך הכנה RNA יחיד יכול להיות מפוצל בין RNA קטן ו רצף RNA בתפזורת.
מגבלה נוכחית אחת של רוב שיטות רצף RNA הקטנות היא ההגברה PCR של cDNA מומר. השיטה שלנו אינה מתגברת על מגבלה זו, אך הצלחנו למזער את מספר מחזורי ה-PCR מ-25 המקסימום המומלצים עד 16 מחזורים. הפחתה זו בהגדלה מפחיתה הטיית ההגדלה המלאכותית שהוצגה על ידי PCR. מקור נוסף של הטיה הוא קשירה של מתאמים, שם ידוע כי רצפים ספציפיים הממוקמים בקצות מתאמים וmiRNAs יכול ligate יחד עם יעילות רבה יותר מאשר רצפים אחרים. כדי להימנע מכך, המתאמים המשמשים בפרוטוקול זה כוללים 4 בסיסים אקראיים המשולבים בסוף כל מתאם כדי למנוע הטיה בתגובות קשירה. בנוסף, בעיה נפוצה נוספת היא כמות dimers מתאם הטופס כאשר קלט RNA נמוך. ערכת הכנת הספריה כוללת שלבים לצמצום היווצרות דימר מתאם כגון אי-הפעלה של מתאם וניקוי חרוזים להסרת מתאמים עודפים לאחר כל קשירה. כמו כן דיללנו את מתאמי 3' ו-5 אינץ' 4N ב-1/4 כדי להפחית את כמות dimer המתאם שיכול ליצור. מצאנו כי כאשר לא מדולל, עוצמת הלהקה 130 bp מגביר מה שהופך את זה קשה להבחין בין 150 bp הלהקה המכילה את ספריות RNA קטן הרצוי על ג'ל.
אתגר נוכחי נוסף של הכנת ספריות רצף הוא הכימות המדויקת של המוצר לפני רצף. מצאנו כי שיטות שונות לתת תוצאות שונות באותה ספרייה. אנו מציעים כי החוקרים להשתמש בשיטות מרובות של כימות כדי לקבל הערכה מדויקת של ריכוז.
פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן נרחב על גנטי, מחקרים התפתחותיים, או יישומים אחרים שבו RNA הוא נקטף ממספר נמוך של תאים. גישה זו מפשטת את מחקרי הזמן על ידי הימנעות מאספו של עוברים ותוחלת בקלות על תאים לא ממוין ומיינו.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
פרויקט זה נתמך על ידי קרן אנדרו מקדונו B+ וקרן NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. הוא חוקר CPRIT בחקר הסרטן (RR150106) ו V Scholar בחקר הסרטן (V Foundation). המחברים גם רוצים להכיר Cytometry ו- Cell מיון ליבה ב BCM למתן ציוד הדרוש עבור פרויקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P. Potential pitfalls in microRNA profiling. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 3 (5), 601-616 (2012).
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
