Summary
Nous décrivons une technique de profilage des microARN chez les premiers embryons de souris. Ce protocole surmonte le défi de l’entrée de cellules faibles et de l’enrichissement de l’ARN. Ce test peut être utilisé pour analyser les changements dans l’expression miRNA au fil du temps dans différentes lignées cellulaires de l’embryon de souris précoce.
Abstract
Les microARN (miARN) sont importants pour la réglementation complexe des décisions relatives au destin cellulaire et du calendrier de développement. Les études in vivo de la contribution des miARN au début du développement sont techniquement difficiles en raison du nombre de cellules limitantes. De plus, de nombreuses approches exigent qu’un miARN d’intérêt soit défini dans des essais tels que le blotting nordique, le microarray et le qPCR. Par conséquent, l’expression de nombreux miARN et de leurs isoformes n’ont pas été étudiées au cours du développement précoce. Ici, nous démontrons un protocole pour le séquençage de petits ARN des cellules triées des embryons de souris tôt pour permettre le profilage relativement impartial des miARN dans les premières populations de cellules de crête neurale. Nous surmontons les défis de l’entrée de cellules faibles et la sélection de la taille au cours de la préparation de la bibliothèque en utilisant l’amplification et la purification à base de gel. Nous identifions l’âge embryonnaire comme une variable tenant compte de la variation entre les répliques et les embryons de souris appariés au stade doit être utilisé pour profiler avec précision les miARN dans les répliques biologiques. Nos résultats suggèrent que cette méthode peut être largement appliquée pour profiler l’expression des miARN d’autres lignées de cellules. En résumé, ce protocole peut être utilisé pour étudier comment les miARN régulent les programmes de développement dans différentes lignées cellulaires de l’embryon de souris précoce.
Introduction
Une question centrale de la biologie du développement est de savoir comment une seule cellule indifférenciée peut donner naissance à un organisme entier avec de nombreux types de cellules complexes. Pendant l’embryogenèse, le potentiel développemental des cellules devient progressivement limité au fur et à mesure que l’organisme se développe. Un exemple est la lignée de crête neurale, qui se différencie progressivement d’une population cellulaire multipotente en divers dérivés terminaux, tels que les neurones périphériques, la glie, l’os crânien et le cartilage. Les cellules de crête neurale sont spécifiées à partir de l’ectoderme pendant la gastrulation, puis subissent une transition épithéliale à mésenchymale et migrent à travers l’embryon à des endroits discrets dans tout le corps où ils se différencieront en phase terminale1. Des décennies de travaux ont mis au jour un réseau de régulation des gènes transcriptionnels, mais on en sait beaucoup moins sur les mécanismes de régulation post-transcriptionnelle qui contrôlent le moment du développement de la crête neuronale.
Des travaux antérieurs suggèrent que les microARN (miARN) répriment l’expression des gènes pour un bon moment de développement et des décisions relatives au destin cellulaire2,3,4,5,6. Les études des miARN dans le développement de crêtes neuronales se sont largement concentrées sur les stades ultérieurs du développement craniofacial. Par exemple, miR-17~92 et miR-140 sont essentiels pour la palatogenèse lors du développement craniofacial chez la souris et le poisson zèbre, respectivement7,8. La contribution des miARN aux premières décisions sur le sort de la crête neuronale de l’embryon n’a pas fait l’objet d’une étude approfondie. Les études sur les miARN dans les décisions relatives au destin précoce ont été limitées par des défis techniques tels que le faible nombre de cellules présentes dans les embryons précoces.
Les MiARN ont été profilés in vitro à partir de lignées cellulaires à l’aide de corps embryoïdes à différents stades de différenciation pour modéliser le développement précoce de la souris9. L’étude des petits ARN in vivo au cours du développement précoce des mammifères a été relativement limitée. Les méthodes précédentes pour profiler les miARN ont conduit à un biais comme une séquence connue est utilisée pour analyser l’expression d’un miRNA spécifique dans des méthodes telles que qPCR, microarrays, et taches nordiques10. Le séquençage de la prochaine génération et l’amélioration constante des outils moléculaires permettent maintenant une analyse relativement impartiale de l’expression miRNA pour étudier leur contribution au développement précoce des mammifères et aux décisions relatives au destin cellulaire.
Ici, nous rapportons une technique de récolte et de séquence de petits ARN exprimés dans les cellules de crête neurale des embryons de souris tôt couvrant la gastrulation (E7.5) au début de l’organogenèse (E9.5). Cette technique est simple et combine le traçage des lignées, le tri cellulaire et la sélection de la taille à base de gel pour préparer de petites bibliothèques de séquençage de l’ARN à partir d’un nombre minimal de cellules pour le séquençage de la prochaine génération. Nous soulignons l’importance pour l’appariement strict de stade somite des embryons pour résoudre des intervalles de temps de 6 heures pour obtenir une vue complète des miARN pendant les changements rapides du développement tôt. Cette méthode peut être largement appliquée aux études génétiques et développementales et évite la mise en commun des embryons. Nous décrivons une façon de surmonter les défis des méthodes actuelles telles que l’enrichissement miRNA en utilisant la purification à base de gel, la quantification de bibliothèque, et de minimiser les biais introduits à partir de PCR. Cette méthode a été utilisée pour identifier les modèles d’expression miRNA au fil du temps pour étudier comment les miARN contrôlent le moment du développement dans la lignée des crêtes neuronales des embryons de souris.
Protocol
Toutes les procédures de recherche et de soins aux animaux ont été approuvées par le Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee et logées dans l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care approuvé pour les animaux au Baylor College of Medicine. Toutes les souches ont été maintenues sur le fond C57BL6.
1. Dissection d’embryon (E7.5-E9.5)
- Retirer les cornes utérines d’une souris femelle enceinte, en stérilisant l’abdomen avec 70% d’éthanol où l’incision doit être faite.
- Nettoyez l’utérus en rinçant avec de la solution saline tamponnée de phosphate (PBS). Placer l’utérus dans un plat stérile en plastique de 10 cm.
- À l’aide de ciseaux de microdissection, séparez chaque decidua contenant la région les uns des autres. Peler le muscle utérin et exposer tous les deciduae. Un par un, retirez la decidua de chaque embryon.
- Retirer le sac jaune de chaque embryon et conserver le génotypage.
- Déplacez tous les embryons dans un nouveau plat de PBS frais pour l’imagerie.
- Prenez une image de toute la litière. Imager chaque embryon individuellement et compter le nombre de somites de chaque embryon. Gardez le grossissement et l’exposition (pour la fluorescence) de la même façon entre les expériences.
REMARQUE : Nous constatons que l’exposition de 50 à 200 ms est adéquate pour la fluorescence et que 20 ms sont adéquates pour un réglage de champ lumineux.
2. Dissociation de l’embryon et tri cellulaire
- Pour chaque embryon à trier, procédez comme suit.
- Décapiter juste au-dessus du placode otique pour les embryons plus anciens que E8.0 (si seulement les cellules étiquetées de la région crânienne sont souhaitées). Pour les embryons E7.5, enlever les structures extraembryonnaires (si seulement l’embryon proprement dit est désiré).
- Déplacez la tête dans un volume minimal de PBS sur un puits propre d’une plaque de 48 puits. Ajouter 250 μL de papain (27 U/mL). Pipette de haut en bas doucement à l’aide d’un p200.
- Vérifiez sous le microscope et recherchez des amas et des cellules individuelles.
- Répétez le pipetage doux de haut en bas jusqu’à ce qu’une seule suspension de cellule soit réalisée (habituellement trois tours de pipetage de haut en bas qui devraient équivaloir à entre 30 s à 1 min pour E7.5-E9.5).
- Étancher avec 250 μL de sérum bovin fœtal (FBS).
- Répétez les étapes 2.1.1-2.1.5 pour chaque embryon à trier.
- Filtrer 500 μL de suspension cellulaire à travers un tube de 35 μm de bouchon de filtre en nylon pour enlever les amas.
- Prenez le filtrate et passez au nouveau tube de 1,5 mL et tournez à 200 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement le supernatant et transférez-le dans un nouveau tube (sauf jusqu’à ce que les cellules vivantes soient connues pour être dans le granulé).
- Resuspender le granulé de cellules dans 300 μL de PBS contenant de l’albumine de sérum bovin de 0,5 à 1 % et conserver sur la glace jusqu’au tri (minimiser le temps entre maintenant et la fin du tri).
- Si désiré, prendre 10 μL de suspension cellulaire et mélanger avec 10 μL de bleu Trypan (0,4%) et compter à l’aide d’un hémocytomètre pour identifier la quantification et la viabilité approximatives des cellules que trypan bleu ne tache que les cellules mortes.
- Juste avant le tri, filtrer chaque échantillon à nouveau à travers un tube de bouchon de filtre et ajouter la tache DAPI pour les cellules vivantes.
- Trier chaque échantillon en 500 μL de solution de lyse d’extraction d’ARN (voir tableau des matériaux)sur le trieur de cellules avec une buse de 70 μm.
- Mélanger et conserver à -80 °C jusqu’à ce que tous les échantillons soient récoltés. Procédez à partir de ce point seulement lorsque tous les échantillons nécessaires à une expérience sont récoltés afin de réduire la variation technique entre les tours de préparation de la bibliothèque.
3. Extraction de l’ARN
REMARQUE : Le protocole est adapté à partir du kit d’isolation de l’ARN; voir Tableau des matériaux.
- Ajouter 500 μL de solution de lyse d’extraction d’ARN (voir tableau des matériaux)à chaque échantillon pour faire le volume total 1000 μL.
- Décongeler chaque échantillon à température ambiante.
- Vortex chaque échantillon pendant 1,5 min, en s’assurant que le bouchon est solidement sur chaque tube avant de commencer l’homogénéisation. Incuber l’homogénéité à température ambiante (15–25 °C) pendant 5 min.
- Ajouter 140 μL de chloroforme, le tube de bouchon solidement et secouer vigoureusement pendant 15 s. Incuber à température ambiante pendant 3 min.
- Centrifugeuse pendant 15 min à 12 000 x g à 4 °C. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de collecte sur glace. Ne transférez aucune interphase ou aucune phase organique. À l’approche de la phase organique rose, inclinez le tube sur le côté et retirez les petites aliquots jusqu’à ce qu’aucune phase aqueuse claire ne puisse être recueillie.
- Mesurer le volume d’ARN contenant la phase aqueuse prélevée dans chaque échantillon pour le calcul correct à l’étape suivante.
- Ajouter 1,5 volume (habituellement 525 μL mais peut être légèrement plus ou moins) d’éthanol à 100 % et bien mélanger par pipetage.
- Pipette jusqu’à 700 μL échantillon, y compris tout précipité, dans la colonne dans un tube de collecte de 2 mL. Fermer le couvercle et la centrifugeuse à ≥8 000 x g pour 15 s à température ambiante. Jetez le flux à travers.
- Répétez l’étape 3.8 à l’aide du reste de l’échantillon.
- Laver la colonne selon les instructions du fabricant. Sécher la colonne en tournant à pleine vitesse pendant 1 min. Transférer la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 mL.
- Pipette 11 μL d’eau libre de nucléase sur le centre de la membrane. Laisser reposer à température ambiante pendant 1 min. Tournez la vitesse maximale pendant 1 min pour arracher la colonne.
- Mesurer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre et d’un instrument électrophorèse capillaire parallèle (Table des matériaux).
4. Préparation de la bibliothèque
REMARQUE : Le protocole est adapté à partir du petit manuel de la trousse de préparation de la bibliothèque d’ARN; voir Tableau des matériaux.
- Terminez la dénaturation et la ligature de l’adaptateur de 3' comme indiqué dans le petit manuel du kit de préparation de la bibliothèque d’ARN à l’aide d’une dilution de 3' d’adaptateur.
- Continuer à l’excès de suppression de l’adaptateur 3'.
- Terminez l’épuisement de l’adaptateur comme indiqué dans le petit manuel de préparation de la bibliothèque d’ARN. Assurez-vous d’utiliser de l’éthanol fraîchement préparé à 80 % pour le nettoyage des perles et que tout l’excès d’éthanol est complètement éliminé juste avant la résuspension dans de l’eau sans nucléase sans trop sécher les perles (la fissuration du granulé de perles est observée lors du sursèchement).
- Passez directement à l’inactivation de l’adaptateur excédentaire.
- Terminez l’inactivation de l’adaptateur excédentaire comme indiqué dans le petit manuel de la trousse de préparation de la bibliothèque d’ARN qui assemble tous les réactifs sur la glace.
- Continuer à 5' 4N ligature d’adaptateur.
- Compléter la ligature de l’adaptateur de 5' comme indiqué dans le petit manuel de la bibliothèque de préparation de l’ARN étant sûr d’utiliser une dilution 1/4 de l’adaptateur 5' et l’assemblage de tous les réactifs sur la glace.
- Procédez à la transcription inversée.
- Synthèse complète de la transcription inversée-premier brin comme indiqué dans le petit manuel de la bibliothèque d’ARN et en prenant soin d’assembler tous les réactifs sur la glace et de ne pas garder l’enzyme hors du congélateur pendant de longues périodes de temps.
REMARQUE : À ce stade, le protocole peut être arrêté, les échantillons ayant été stockés toute la nuit à 4 °C. Sinon, continuez à l’amplification PCR. - Compléter l’amplification du PCR en assemblant les réactifs comme indiqué dans le petit manuel du kit de préparation de la bibliothèque d’ARN et en minimisant le nombre de cycles pcr. Le nombre de cycles de PCR doit être déterminé expérimentalement pour chaque application et le nombre minimal de cycles doit être utilisé. Ici, nous avons utilisé 16 cycles pour amplifier avec succès nos petites bibliothèques d’ARN.
- Procédez directement à la sélection de la taille.
5. Sélection de la taille
- Pour chaque échantillon, ajouter 5 μL de colorant de chargement de gel 6x et pipette pour mélanger.
- Chargez 10 μL d’échelle jusqu’au premier puits du gel, laissant le puits immédiatement à droite vide. Chargez tout le produit de l’étape 5.1 sur un acide tris/borate/éthylènediaminetétraace – gel polyacrylamide (TBE-PAGE) et laissez 1 voie entre chaque échantillon.
REMARQUE : Gardez le contenant dans lequelle le gel est entré pour les étapes suivantes. - Exécutez le gel à 150 V pendant environ 30-40 min dans 0,5x tampon de fonctionnement TBE (jusqu’à ce que la bande inférieure de colorant est près du fond du gel, 0,5-1 cm).
- Faire 1 L de solution de coloration pendant que le gel est en cours d’exécution: SYBR Gold dilué 1:10,000 en 0.5x TBE.
- Lorsque le gel a terminé sa course (c.-à-d. que la bande de colorant inférieure est près du fond du gel), retirez soigneusement le gel des plaques de verre, en notant l’orientation du gel.
- Placez le gel dans le plateau de son emballage d’origine. Retirez le TBE 0,5 x et remplacez-le par la solution de coloration de l’étape 5.5. Gel à taches pendant 15 min. Le temps de coloration peut devoir être augmenté.
- Placez le gel sur un transilluminateur UV, en prenant soin de ne pas déchirer le gel et en maintenant l’orientation indiquée ci-dessus (re-tacher pendant plus de temps si les bandes d’échelle ne peuvent pas être clairement vus).
- Imagez le gel une fois que la coloration est complète sur le transilluminateur UV avec un appareil photo.
- Si une meilleure image est nécessaire, utilisez d’abord un appareil d’imagerie autre que le transilluminateur UV pour capturer une image du gel avant de découper les bandes sur un transilluminateur UV comme imagerie directement sur le transilluminateur UV provoque la coloration variable de l’arrière-plan comme indiqué à la figure 3A-B. Ne déplacez pas le gel trop souvent car il est délicat et peut se déchirer.
- Identifiez et retirez la bande de ~150 bp à l’aide d’une lame de rasoir propre et placez-la dans un tube propre de 1,5 mL. Ne coupez pas la bande ~130 bp (produit dimer adaptateur).
- Imagez à nouveau le gel après avoir enlevé les tranches contenant le produit de la bibliothèque à des fins de documentation.
- Faites tourner les tubes de microcentrifuge contenant la tranche de gel à une vitesse maximale de 30 s pour recueillir les tranches au fond de chaque tube.
- Utilisez une pointe p200 pour chaque échantillon afin d’écraser la tranche de gel dans les plus petits morceaux possibles. Éjecter chaque pointe dans chaque tube.
- Dans chaque tube, ajouter 300 μL de tampon d’élution, en prenant soin de laver les morceaux de gel du côté du tube et de rattacher la pointe p200 et laver la pointe pour chaque échantillon.
- Placer les échantillons d’élution dans un incubateur de secousses réglé à 25 °C. Incuber pendant la nuit avec 1000 tr/min secouant. Retirer les tubes de l’incubateur et tourner à vitesse maximale pendant 10 min à température ambiante.
- Transférer le supernatant contenant le produit de la bibliothèque dans une plaque de puits 96 sans RNase de 2 mL. Prenez soin de ne pas transférer de gel.
- Ajouter 50 perles de nettoyage de μL à chaque échantillon et mélanger par pipetage. Immédiatement, ajouter 350 μL d’isopropanol et mélanger par pipetage. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes avec bascule.
- Pulser la plaque de rotation pour les perles de granulés, puis magnétiser pendant 2 min. Retirer soigneusement et jeter le supernatant.
- Ajouter 950 μL d’éthanol à 80 %. Incuber pendant 30 s. Retirez tous les supernatants. Répéter pour un total de deux lavages d’éthanol.
- Sécher l’échantillon pendant 3 min. À cette étape, prendre soin d’enlever tout éthanol résiduel qui s’accumule au fond de chaque puits (pas plus d’une fois) et de ne pas trop sécher les perles (le séchage excessif entraînera la fissuration de la boulette de perle).
- Retirer tout liquide résiduel au fond du puits. Retirez la plaque du support magnétique.
- Resuspendez le granulé dans 13 μL de tampon de resuspension. Mélanger par pipette jusqu’à consistance homogène. Incuber pendant 2 min, puis magnétiser pendant 3 min.
- Transférer 12 μL de supernatant dans un tube propre ou un puits de plaque propre pour un stockage ultérieur. Conserver tous les échantillons à 4 °C pendant la nuit ou à -20 °C à long terme.
- Vérifiez la taille et la concentration des fragments présents dans chaque bibliothèque à l’aide de l’essai d’ADN de haute sensibilité de l’électrophorèse capillaire. Confirmez la concentration avec plus d’une méthode.
REMARQUE : Nous avons parfois utilisé le kit de sensibilité standard pour éviter de surcharger l’électrophorèse capillaire.
Representative Results
En utilisant la procédure démontrée ici, nous avons récolté des embryons à E7.5, E8.5 et E9.5. Les structures extraémbryonnaires ont été enlevées de tous les embryons, puis les embryons ont été mis en scène pour résoudre les intervalles de temps de 6 heures (figure 1A-1B). En utilisant l’analyse de principe des composants pour regrouper des échantillons en fonction de la similitude, nous constatons que les échantillons se regroupent par âge, ce qui met en évidence la variation résultant de l’âge embryonnaire et la nécessité d’une correspondance soigneuse des somites pour les répliques biologiques (Figure 1C). Nous avons profilé l’épiblaste pluripotente à E7.5, la lignée a tracé les cellules prémigratrices et migratoires de crête neurale utilisant Wnt1-Cre à E8.5 et les cellules de crête neurale migratoire utilisant Sox10-Cre à E9.5 (Figure 1D). Ici, nous récoltons spécifiquement la crête neurale crânienne en décapitant l’embryon juste au-dessus du placode otique. Une comparaison des deux Cre-drivers (Wnt1 et Sox10) qui sont fréquemment utilisés pour étiqueter les cellules de crête neuronale confirme qu’ils marquent différentes populations dans les embryons de souris précoces (Figure 1E). Des stratégies de gating ont été utilisées pour obtenir des cellules positives simples en direct qui ont été triées directement dans la solution de lyse d’extraction d’ARN(voir tableau des matériaux) et stockées à -80 °C (figure 1F). Il est important de garder une trace du nombre de cellules récoltées dans chaque échantillon.
L’isolement de l’ARN a été effectué à l’aide d’une version modifiée du protocole du kit d’ARN. Plus précisément, nous utilisons les mini colonnes d’ARN qui doivent être stockées à 4 °C. Ces colonnes sont utiles pour éluder dans un petit volume (11 μL) afin d’obtenir la plus forte concentration possible d’ARN à partir d’échantillons où l’entrée de cellules est limitée. Pour cette même raison, il est important d’obtenir toute la phase aqueuse après l’extraction du chloroforme du phénol. Lent pipeting et l’inclinaison du tube d’un côté pendant la collecte sont essentiels pour maximiser le rendement. Dans cette procédure, nous quantifions l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre, pour obtenir des informations sur la contamination au sel/protéines, et d’une électrophorèse capillaire pour mesurer la concentration (figure 2). La trace du spectrophotomètre révèle que l’ARN a été isolé sans protéines contaminantes, mais qu’il a une teneur élevée en sel (figure 2A-2B). Idéalement, le ratio 260/280 devrait être de ~1,8 et le ratio 260/230 devrait être >2.0. Le rendement total de l’ARN mesuré par le spectrophotomètre n’a pas augmenté avec l’âge entre E8.5-E9.5. Cela est dû à la résolution du spectrophotomètre n’étant pas assez sensible pour détecter les changements dans la concentration d’ARN du nombre de cellules que nous récoltons, et nous recommandons d’utiliser les informations de concentration obtenues à partir de l’électrophorèse capillaire (Figure 2C). La trace d’électrophorèse capillaire peut être utilisée pour estimer la concentration et la taille des fragments d’ARN. Les pics <1000 nucléotides sont révélateurs de dégradation. La trace représentative est compatible avec l’ARN qui n’est pas dégradé. Les pics à 2000 nucléotides et 5100 nucléotides sont 18s et 28s rRNA, respectivement. La petite région d’ARN est située à ~150 nucléotides (figure 2D).
De petites bibliothèques de séquençage de l’ARN ont été préparées à l’aide du petit kit de préparation de la bibliothèque d’ARNdécrit dans la Table des matériaux. Ici, nous utilisons un peu moins de la moitié de l’ARN obtenu à partir de chaque échantillon (4 μL de l’ellion de 11 μL, ~80-120 ng) qui permet de synthétiser les bibliothèques de séquençage de l’ARN à partir de l’ARN restant de chaque échantillon. Ici, nous diluons les adaptateurs 3' et 5' petits ARN 1/4 pour abaisser la quantité de dimers adaptateur présents et suggèrent que la ligature de l’adaptateur, le nettoyage, et les étapes de transcription inverse sont terminées autant que possible d’une manière continue. Nous avons utilisé 16 cycles pcr pour amplifier les bibliothèques et suggérer que le nombre minimum de cycles de PCR pour toute expérience soit déterminé empiriquement. En complétant l’excès de cycles de PCR, on pourrait gonfler artificiellement le nombre de lecture d’un miARN faiblement exprimé.
La sélection de la taille est impérative pour enrichir pour les bibliothèques de miARN et non les dimrs adaptateurs, qui sont généralement présents. La taille du produit de la bibliothèque (150 pb) et les dimers d’adaptateur (130 pb) sont très similaires en taille. L’extraction de gel est utilisée pour isoler les petites bibliothèques de séquençage de l’ARN loin des dimers d’adaptateur (figure 3). Une image d’un gel PAGE avant l’excision montre qu’une multitude de tailles de produits sont présentes dans chaque échantillon (Figure 3A). Il est important de laisser une voie ouverte entre deux échantillons ou une échelle chargée sur le gel. Le front de migration au bas du gel est légèrement incurvé indiquant qu’il peut être nécessaire de courir à une vitesse plus lente si la bande de 150 pb est difficile à distinguer pour tous les échantillons. Cette image représentative montre également une abondance de 150 bp produit de la concentration plus élevée de l’ARN de contrôle positif (ARN total du cerveau d’un rat) qui est allé dans la préparation de la bibliothèque par rapport à celle qui est allé dans chaque échantillon embryonnaire. Le contrôle négatif révèle que les réactifs étaient exempts de contamination des espèces d’acide nucléique (figure 3A). L’excision de la bande de 150 pb doit être faite avec une lame de rasoir propre et la zone recueillie est indiquée à la figure 3B. Les traces d’électrophorèse capillaire avant et après la sélection de taille montrent l’amélioration spectaculaire de la pureté du produit de bibliothèque de 150 pb avec purification de gel (Figure 3C-3D). Il est important de noter que les traces de la figure 3C-3D ont des pics d’échantillon plus élevés que les marqueurs, ce qui indique une surcharge. Dans ces cas, la taille des fragments peut être exacte, mais la concentration ne peut pas. La quantification peut être obtenue en diluant les bibliothèques dans la gamme des marqueurs ou en utilisant des méthodes alternatives. Nous trouvons une certaine variation entre les méthodes alternatives de quantification de bibliothèque et recommandons que de multiples méthodes de quantification soient testées empiriquement. Une quantification précise de la concentration est essentielle pour maximiser le nombre d’échantillons à séquencer en même temps. Les bibliothèques seront diluées jusqu’à 1,3 pM pour le séquençage et généralement n’importe où de 15-25 échantillons peuvent être séquencés en même temps sur un kit de séquençage de cycle 150 qui fournit ~ 140 millions de lectures. Il en résulte environ 5 millions de lectures par échantillon. En général, les taux de cartographie se comptent entre 60 et 80 %.
Figure 1 : Récolte de cellules à partir d’embryons de souris pour le séquençage de l’ARN. (A) Embryon de souris E8.5 pour mettre en évidence l’enlèvement du sac jaune et des somites utilisés pour déterminer le stade de l’embryon (B) Staging somite des embryons de souris pour capturer les stades du développement de la crête neuronale (C) Analyse des composants principaux des bibliothèques préparées à partir de cellules de crête neurales de type sauvage triés montrant que les échantillons groupe par âge (D) Schématique montrant comment les échantillons ont été récoltés à l’aide de Wnt1-Cre à E8.5 étiqueter les cellules prémigratrices et migratoires de crête neurale et Sox10-Cre à E9.5 pour étiqueter uniquement les cellules de crête neuronale migratoire (E) Analyse des composants principaux des bibliothèques préparées à partir de cellules de crête neurales de type sauvage triés montrant des échantillons regroupés par Cre-driver indépendamment de l’âge (F) Stratégie de gating utilisée pour isoler les cellules de crête neuronale RFP+ des embryons E8.5 et E9.5 utilisant le tri de facs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : isolement de l’ARN des embryons de souris E7.5-E9.5. (A) Trace de spectrophotomètre représentative d’un isolement d’ARN du stade le plus jeune de l’embryon que nous avons appliqué ce protocole. BB) Tableau indiquant les valeurs représentatives de la qualité de l’ARN obtenues à partir du spectrophotomètre. (C) Exemple de l’ARN prélevé à partir de cellules de crête neurales triées à partir d’embryons de chaque âge (D) Trace électrophorèse capillaire montrant un ARN de bonne qualité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : bibliothèques miRNA avant et après la sélection des tailles. (A) Gel TBE-PAGE montrant les petites bibliothèques d’ARN représentatives pour quatre échantillons et contrôles avant et (B) après l’excision de bande de 150 pb. Les flèches représentent la bande de 150 pb à exciser (C) trace électrophorèse capillaire de la petite bibliothèque d’ARN avant et (D) après la sélection de la taille. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Les processus de développement peuvent se dérouler rapidement, et les cellules subissent de nombreuses spécifications séquentielles de telle sorte que pour capturer une vue complète des miARN contribuant aux décisions de destin précoce, une mise en scène plus spécifique est nécessaire que l’augmentation d’une demi-journée largement utilisée. Une étude récente a effectué le séquençage de l’ARN à partir d’embryons de stade 12 de Theiler qui vont d’avoir 3 à 6 somites11. Nous constatons que pendant cette période, les cellules de crête neurale sont spécifiées (3 somites de l’âge), délaminate (4 somites d’âge), et migrent (5-6 somites d’âge). Nous constatons également qu’en plus du Cre-driver utilisé pour tracer les populations de cellules, l’âge est la plus grande source de variation entre les échantillons biologiques, et seuls les embryons appariés à la somite devraient être considérés comme des répliques. Cela devrait également être pris en considération lors de la comparaison des embryons transgéniques aux témoins de type sauvage.
Les méthodes antérieures de profil des miARN au début du développement ont utilisé entre 10 et 100 ng d’entrée d’ARN pour la préparation de la bibliothèque de séquençage des petits ARN et ont regroupé plusieurs embryons en un seul échantillon13,14. Nous démontrons l’isolement de l’ARN et la préparation de la bibliothèque à partir d’un seul embryon E7.5 ou à partir de cellules de crête neurales triées à E8.5 et E9.5 en utilisant environ 100 ng d’ARN total comme entrée. Lors de la dissociation des embryons pour le tri, il faut prendre soin de regarder la dissociation au microscope et éteindre la réaction pour observer quand des cellules uniques sont obtenues. Nous constatons que la dissociation de la région crânienne des embryons E8.5-E9.5 est presque instantanée avec le pipetage manuel doux comme décrit dans le protocole. Pour les tissus plus gros et les embryons de plus en plus âgés, le temps de dissociation peut être plus long selon la partie de l’embryon dissocié. Pour les embryons E7.5-E9.5, des amas de cellules sont facilement visibles au microscope et la dissociation doit se poursuivre jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’amas visibles. Les cellules simples sont visibles dans la solution si vous ajustez la mise au point à travers la solution dans votre puits n’importe où de 5-10x. Les méthodes précédentes trient les cellules directement dans le tampon de lyse pour le séquençage de l’ARN pour préparer l’ARN en vrac à partir d’un faible nombre de cellules14. Ici, nous trions directement dans la solution de lyse d’extraction d’ARN de sorte que l’ARN peut être isolé avant le début de la préparation de la bibliothèque. L’utilisation de mini colonnes avec un volume d’ellion de 11 μL a permis une concentration d’ARN suffisamment élevée de telle sorte qu’une seule préparation à l’ARN pourrait être répartie entre le petit ARN et le séquençage en vrac de l’ARN.
L’une des limites actuelles de la plupart des petites méthodes de séquençage de l’ARN est l’amplification pcr de l’ADNC converti. Notre méthode ne surmonte pas cette limitation, mais nous avons pu minimiser le nombre de cycles pcr du 25-maximum recommandé jusqu’à 16 cycles. Cette réduction de l’amplification diminue le biais d’amplification artificielle introduit par pcr. Une autre source de biais est la ligature des adaptateurs, où l’on sait que des séquences spécifiques situées aux extrémités des adaptateurs et des miARN peuvent lier avec une plus grande efficacité que d’autres séquences. Pour éviter cela, les adaptateurs utilisés dans ce protocole ont 4 bases aléatoires incorporées à la fin de chaque adaptateur pour prévenir le biais dans les réactions de ligature. En outre, un autre problème commun est la quantité de dimers adaptateur qui se forment lorsque l’entrée d’ARN est faible. Le kit de préparation de la bibliothèque comprend des étapes pour réduire la formation de dimer adaptateurs tels que l’inactivation de l’adaptateur et le nettoyage des perles pour supprimer les adaptateurs excédentaires après chaque ligature. Nous avons également dilué les adaptateurs 3' et 5' 4N de 1/4 pour réduire la quantité de dimer adaptateur qui peut se former. Nous avons constaté que lorsqu’elle n’est pas diluée, l’intensité de la bande de 130 pb augmente, ce qui rend difficile la distinction avec la bande de 150 pb contenant les petites bibliothèques d’ARN souhaitées sur un gel.
Un autre défi actuel de la préparation des bibliothèques de séquençage est la quantification précise du produit avant le séquençage. Nous avons constaté que différentes méthodes donnent des résultats variables sur la même bibliothèque. Nous suggérons que les chercheurs utilisent plusieurs méthodes de quantification pour obtenir une estimation précise de la concentration.
Ce protocole peut être largement appliqué à des études génétiques, développementales ou à d’autres applications où l’ARN est récolté à partir d’un faible nombre de cellules. Cette approche simplifie les études temporelles en évitant la mise en commun des embryons et peut facilement être appliquée aux cellules non triées et triées.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu par la Fondation Andrew McDonough B+ et les NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. est chercheur en recherche sur le cancer (RR150106) et chercheur en recherche sur le cancer (V Foundation). Les auteurs tiennent également à souligner le noyau de cytométrie et de tri cellulaire de BCM pour fournir l’équipement nécessaire à ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
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