Summary
Vi beskriver en teknik til profilering af mikroRNA'er i tidlige museembryoner. Denne protokol overvinder udfordringen med lavt celleinput og lille RNA-berigelse. Denne analyse kan bruges til at analysere ændringer i miRNA udtryk over tid i forskellige celle slægter af den tidlige mus embryo.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er vigtige for den komplekse regulering af celle skæbne beslutninger og udviklingsmæssige timing. In vivo-undersøgelser af miRNA'ernes bidrag i den tidlige udvikling er teknisk udfordrende på grund af det begrænsende celletal. Desuden kræver mange tilgange en miRNA af interesse, der skal defineres i analyser såsom nordlige blotting, microarray, og qPCR. Derfor er udtrykket af mange miRNA'er og deres isoforms ikke blevet undersøgt i den tidlige udvikling. Her demonstrerer vi en protokol for små RNA-sekventering af sorterede celler fra tidlige museembryoner for at muliggøre relativt upartisk profilering af miRNA'er i tidlige populationer af neurale crestceller. Vi overvinder udfordringerne ved lav celleinput og størrelsesvalg under biblioteksforberedelse ved hjælp af forstærkning og gelbaseret rensning. Vi identificerer embryonale alder som en variabel regnskabsmæssig behandling af variation mellem replikater og fase-matchede museembryoner skal anvendes til præcist profil miRNA'er i biologiske replikater. Vores resultater tyder på, at denne metode kan anvendes bredt til at profilere udtrykket af miRNA'er fra andre slægter af celler. Sammenfattende kan denne protokol bruges til at undersøge, hvordan miRNAs regulere udviklingsprogrammer i forskellige celle slægter af den tidlige mus embryo.
Introduction
Et centralt spørgsmål om udviklingsbiologi er, hvordan en enkelt udifferentieret celle kan give anledning til en hel organisme med mange komplekse celletyper. Under embryogenese bliver cellernes udviklingspotentiale gradvist begrænset, efterhånden som organismen udvikler sig. Et eksempel er den neurale crest afstamning, som gradvist adskiller sig fra en multipotent celle befolkning i forskellige terminal derivater, såsom perifere neuroner, glia, kranieknogle, og brusk. Neurale crest celler er angivet fra ectoderm under gastrulation og derefter gennemgå en epitel til mesenkymale overgang og migrere gennem fosteret til diskrete steder i hele kroppen, hvor de vil terminalt differentiere1. Årtiers arbejde har afdækket en transskriptionel gen reguleringsnetværk, men langt mindre er kendt om mekanismerne i post-transskriptionel regulering, der styrer timingen af neurale våbenskjold udvikling.
Tidligere arbejde tyder på, at microRNAs (miRNAs) undertrykker genekspression for korrekt udviklingstiming og celle skæbnebeslutninger 2,3,4,5,6. Undersøgelser af miRNA'er i neurale våbenskjold udvikling har i vid udstrækning fokuseret på senere stadier af kraniofacial udvikling. For eksempel, miR-17 ~ 92 og miR-140 er afgørende for palatogenesis under kraniofacial udvikling i mus og zebrafisk,henholdsvis 7,8. Bidraget fra miRNA'er til de tidligste neurale crest skæbne beslutninger af fosteret er ikke blevet grundigt undersøgt. Undersøgelser af miRNA'er i beslutninger om tidlig skæbne er blevet begrænset af tekniske udfordringer såsom det lave celletal, der er til stede i tidlige embryoner.
MiRNA'er er blevet profileret in vitro fra cellelinjer ved hjælp af embryoidorganer på forskellige stadier af differentiering til at modellere tidlig museudvikling9. Undersøgelsen af små RNA'er in vivo under udviklingen af et tidligt pattedyr har været relativt begrænset. Tidligere metoder til profil miRNA'er har ført til bias som en kendt sekvens bruges til at analysere udtryk for en bestemt miRNA i metoder som qPCR, microarrays, og nordlige blots10. Næste generation sekventering og stadig bedre molekylære værktøjer nu giver mulighed for relativt upartisk analyse af miRNA udtryk til at studere deres bidrag til tidlig pattedyr udvikling og celle skæbne beslutninger.
Her rapporterer vi en teknik til at høste og sekvens små RNA'er udtrykt i neurale crestceller fra tidlige museembryoner, der spænder over gastrulation (E7.5) til begyndelsen af organogenese (E9.5). Denne teknik er ligetil og kombinerer afstamningssporing, cellesortering og gelbaseret størrelsesvalg for at forberede små RNA-sekventeringsbiblioteker fra et minimalt antal celler til næste generations sekvensering. Vi fremhæver vigtigheden af streng somit fase matchning af embryoner til at løse 6-timers tidsintervaller for at opnå et omfattende overblik over miRNA'er under de hurtige ændringer i den tidlige udvikling. Denne metode kan anvendes i vid udstrækning på genetiske og udviklingsmæssige undersøgelser og undgår sammenlægning af embryoner. Vi beskriver en måde at overvinde udfordringer af nuværende metoder såsom miRNA berigelse ved hjælp af gel-baseret rensning, bibliotek kvantificering, og minimere bias indført fra PCR. Denne metode er blevet brugt til at identificere miRNA udtryksmønstre over tid for at undersøge, hvordan miRNAs styrer udviklingstids timing i den neurale crest afstamning af museembryoner.
Protocol
Alle forskning og pasning procedurer blev godkendt af Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Udvalg og har til huse i Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care-godkendte dyr facilitet på Baylor College of Medicine. Alle stammer blev fastholdt på C57BL6 baggrund.
1. Dissektion af embryoner (E7.5-E9.5)
- Fjern livmoderhorn fra en gravid kvindelig mus, sterilisere maven med 70% ethanol, hvor snittet skal foretages.
- Rengør livmoderen ved at skylle med fosfatbufferet saltvand (PBS). Placer livmoderen i en steril plast 10 cm skål.
- Brug mikrodissektion saks, adskille hver decidua indeholder region fra hinanden. Skræl livmodermusklen af og udsæt alle deciduae. En efter en, fjerne decidua fra hvert foster.
- Fjern æggeblomme sæk fra hvert foster og gem til genotyping.
- Flyt alle embryoner ind i en ny skål af frisk PBS til billedbehandling.
- Tag et billede af hele kuldet. Image hvert embryon individuelt og tælle antallet af somites af hvert foster. Hold forstørrelse og eksponering (for fluorescens) det samme mellem eksperimenter.
BEMÆRK: Vi finder, at 50-200 ms eksponering er tilstrækkelig til fluorescens, og at 20 ms er tilstrækkelig til lyse felt indstilling.
2. Dissociation og cellesortering af embryoner
- For hvert embryon, der skal sorteres fra, skal du gøre følgende.
- Halshugge lige over otic placode for embryoner ældre end E8.0 (hvis kun mærket celler i kranieregionen ønskes). For E7.5 embryoner fjernes ekstraembryoniske strukturer (hvis kun det egentlige foster ønskes).
- Flyt hovedet i et minimalt volumen PBS over til en ren brønd på en 48-brøndplade. Der tilsættes 250 μL papain (27 U/ml). Pipette forsigtigt op og ned ved hjælp af en p200.
- Check under mikroskopet og se efter klumper og enkelte celler.
- Gentag blid pipettering op og ned, indtil en enkelt celle suspension er opnået (normalt tre runder pipettering op og ned, som bør svare til mellem 30 s til 1 min for E7.5-E9.5).
- Slukket med 250 μL føtalt kvægserum (FBS).
- Trin 2.1.1-2.1.5 gentages for hvert embryon, der skal sorteres.
- 500 μL cellesuspension filtreres gennem et 35 μm nylonnetfilterdækrør for at fjerne klumper.
- Tag filtratet og flyt til det nye 1,5 ml rør og drej ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatant omhyggeligt og overføre til nye rør (gem indtil levende celler er kendt for at være i pellet).
- Resuspend cell pellet i 300 μL PBS indeholder 0,5-1% kvæg serum albumin og holde på is, indtil sortering (minimere tiden mellem nu og slutningen af sortering).
- Hvis det ønskes, skal du tage 10 μL cellesuspension og kombinere med 10 μL Trypan blå (0,4%) og tælle ved hjælp af et hæmocytometer til at identificere omtrentlig celle kvantificering og levedygtighed som Trypan blå kun pletter døde celler.
- Lige før sortering, filtrere hver prøve igen gennem et filter cap rør og tilsæt DAPI plet for levende celler.
- Hver prøve sorteres i 500 μL RNA-ekstraktionslyisopløsning (se Materialetabel) på cellesortering med 70 μm dyse.
- Der blandes og opbevares ved -80 °C, indtil alle prøver er høstet. Gå kun videre fra dette punkt, når alle prøver, der er nødvendige for et eksperiment, høstes for at reducere den tekniske variation mellem runder af bibliotekets forberedelse.
3. RNA-udvinding
BEMÆRK: Protokollen er tilpasset fra RNA isolation kit; se Materialetabel.
- Der tilsættes 500 μL RNA-ekstraktionslysopløsning (se materialetabel)til hver prøve for at gøre det samlede volumen 1000 μL.
- Tø hver prøve op ved stuetemperatur.
- Vortex hver prøve i 1,5 min, og sørg for, at hætten er sikkert på hvert rør, før du starter homogenisering. Homogenatet inkuberes ved stuetemperatur (15-25 °C) i 5 min.
- Der tilsættes 140 μL chloroform, hætterøret sikkert og ryst kraftigt i 15 s. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min.
- Centrifuge i 15 min ved 12.000 x g ved 4 °C. Overfør den øvre vandige fase til et nyt opsamlingsrør på is. Overfør ikke nogen interfase eller nogen organisk fase. Når du nærmer dig den lyserøde organiske fase, tip røret til side og fjerne små aliquots indtil ingen klar vandig fase kan indsamles.
- Mål mængden af RNA, der indeholder vandig fase indsamlet fra hver prøve for den korrekte beregning i næste trin.
- Der tilsættes 1,5 volumener (normalt 525 μL, men kan være lidt mere eller mindre) af 100 % ethanol og blandes grundigt ved pipettering.
- Pipette op til 700 μL prøve, herunder bundfald, i kolonne i et 2 ml opsamlingsrør. Luk låget og centrifugen ved ≥8.000 x g i 15 s ved stuetemperatur. Kassér gennemstrømningen.
- Trin 3.8 gentages med resten af prøven.
- Vask kolonnen i henhold til producentens anvisninger. Tør kolonnen ved at dreje ved fuld hastighed i 1 min. Overfør kolonnen til et nyt 1,5 ml opsamlingsrør.
- Pipette 11 μL nukleasefrit vand på midten af membranen. Lad sidde ved stuetemperatur i 1 min. Spin max hastighed i 1 min til elute off kolonnen.
- RNA-koncentrationen måles ved hjælp af et spektrofotometer og et parallelt kapillært elektroforeseinstrument (Materialetabel).
4. Udarbejdelse af bibliotek
BEMÆRK: Protokollen er tilpasset fra lille RNA bibliotek forberedelse kit håndbog; se Tabel over materialer.
- Gennemfør denatureringen og 3' adapter ligation som angivet i den lille RNA bibliotek forberedelse kit håndbog ved hjælp af 1 / 4 fortynding af 3 'adapter.
- Fortsæt med at overskydende 3 'adapter fjernelse.
- Fuldfør adapterudtyndingen som angivet i håndbogen til udarbejdelse af det lille RNA-biblioteksforberedelsessæt. Sørg for at bruge frisklavet 80% ethanol til peradoprydningen, og at al overskydende ethanol fjernes helt lige før resuspensionen i nukleasefrit vand uden overtørrende perlerne (revner i perlepellet observeres ved overtørring).
- Gå direkte videre til overdreven inaktivering af adapteren.
- Fuldfør den overskydende inaktivering af adapteren som angivet i håndbogen til den lille RNA-biblioteksforberedningspakke, der samler alle reagenser på is.
- Fortsæt til 5' 4N adapter ligation.
- Komplet 5 ' adapter ligation som angivet i den lille RNA bibliotek forberedelse kit håndbog at være sikker på at bruge en 1 / 4 fortynding af 5 'adapter og samle alle reagenser på is.
- Fortsæt til omvendt transskription.
- Komplet omvendt transskriptions-første streng syntese som angivet i den lille RNA bibliotek forberedelse kit håndbog og passe på at samle alle reagenser på is og ikke holde enzymet ud af fryseren i længere tid.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan protokollen standses, og prøverne kan opbevares natten over ved 4 °C. Alternativt kan du fortsætte til PCR-forstærkning. - Komplet PCR forstærkning ved at samle reagenser som anført i den lille RNA bibliotek forberedelse kit håndbog og minimere antallet af PCR cykler. Antallet af PCR-cyklusser bør bestemmes eksperimentelt for hver applikation, og det mindste antal cyklusser bør anvendes. Her brugte vi 16 cyklusser til at forstærke vores små RNA-biblioteker.
- Fortsæt direkte til størrelsesvalg.
5. Valg af størrelse
- Til hver prøve tilsættes 5 μL 6x gel loading farvestof og pipette til at blande.
- Læg 10 μL stige til den første brønd af gelen, så brønden straks til højre tom. Læg hele produktet fra trin 5.1 på en 6% Tris/borate/ethylenediaminetetraacetic syre – polyacryamidgel (TBE-PAGE) og lad 1 vognbane være mellem hver prøve.
BEMÆRK: Opbevar beholderen, som gelen kom ind i, til de efterfølgende trin. - Kør gelen ved 150 V i ca. 30-40 min i 0,5 x TBE løbebuffer (indtil det nederste farvestofbånd er nær bunden af gelen, 0,5-1 cm).
- Gør 1 L farvningsopløsning, mens gelen kører: SYBR Gold fortyndet 1:10.000 i 0,5 x TBE.
- Når gelen er færdig med at løbe (dvs. lavere farvestofbånd er nær bunden af gelen), fjern forsigtigt gelen fra glaspladerne og notere gelens retning.
- Placer gelen i bakken på den originale emballage. Fjern 0,5x TBE og udskift den med farvningsopløsningen fra trin 5.5. Pletgel i 15 min. Farvningstiden skal muligvis øges.
- Placer gelen på en UV-transilluminator, idet du skal passe på ikke at rive gelen og opretholde den ovenfor bemærkede orientering (re-pletten i ekstra tid, hvis bånd af stigen ikke kan ses tydeligt).
- Billede gelen, når farvningen er færdig på UV transilluminator med et kamera.
- Hvis der er behov for et bedre billede, skal du først bruge et andet billedapparat end UV-transilluminatoren til at tage et billede af gelen, før båndene klippes ud på en UV-transilluminator, da billeddannelse direkte på UV-transilluminatoren forårsager den variable farve på baggrunden som vist i figur 3A-B. Flyt ikke gelen for mange gange, da den er sart og kan rive den i stykker.
- Identificer og fjern ~150 bp-båndet ved hjælp af et rent barberblad og placer det rene 1,5 ml rør. Skær ikke ~130 bp-båndet ud (adapterdæmpningsprodukt).
- Billede gelen igen efter fjernelse af skiver, der indeholder bibliotekets produkt til dokumentationsformål.
- Drej mikrocentrifugerørene, der indeholder gelskivet ved maksimal hastighed i 30 s for at samle skiverne i bunden af hvert rør.
- Brug en p200 spids til hver prøve til at knuse skiven af gel i de mindste bits muligt. Skub hver spids ud i hvert rør.
- Til hvert rør tilsættes 300 μL elution buffer, idet der skal vaskes gelbits fra siden af røret og sætte p200-spidsen på igen og vaskes af spidsen for hver prøve.
- Eluterende prøverne hældes i en rystende inkubator, der er indstillet til 25 °C. Inkuber natten over med 1000 omrystning. Fjern rør fra inkubator og spin ved maksimal hastighed i 10 min ved stuetemperatur.
- Overfør supernatanten, der indeholder bibliotekets produkt, til en 2 ml RNase-fri 96 brøndplade. Pas på ikke at overføre gel.
- Tilsæt 50 μL oprydning perler til hver prøve og bland ved pipettering. Umiddelbart tilsættes 350 μL isopropanol og blandes ved pipettering. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter med rokkende.
- Pulse spin plade til pellet perler og derefter magnetisere i 2 min. Fjern og kassér forsigtigt supernatanten.
- Der tilsættes 950 μL 80 % ethanol. Inkubere i 30 s. Fjern alle supernatant. Gentag for i alt to ethanol vasker.
- Prøven tørres i 3 min. Ved dette trin skal du passe på at fjerne eventuel resterende ethanol, der opsamler i bunden af hver brønd (ikke mere end én gang) og ikke overtørre perlerne (overtørring vil resultere i revner i perle pellet).
- Fjern al resterende væske i bunden af brønden. Fjern pladen fra magnetstanden.
- Opspærret pellet i 13 μL resuspension buffer. Bland med pipette indtil homogen. Inkuber i 2 min og magnetiser derefter i 3 min.
- Overfør 12 μL supernatant til et rent rør eller en brønd ren plade til efterfølgende opbevaring. Alle prøver opbevares ved 4 °C natten over eller -20 °C på lang sigt.
- Kontroller størrelsen og koncentrationen af fragmenter til stede i hvert bibliotek ved hjælp af kapillær elektroforese høj følsomhed DNA-analyse. Bekræft koncentrationen med mere end én metode.
BEMÆRK: Vi har lejlighedsvis brugt standardfølsomhedssættet til at undgå overbelastning af kapillær elektroforese.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure, der er demonstreret her, har vi høstet embryoner på E7.5, E8.5 og E9.5. Extraembryoniske strukturer blev fjernet fra alle embryoner, og derefter blev embryoner somite iscenesat for at løse 6-timers tidsintervaller (Figur 1A-1B). Ved hjælp af principkomponentanalyse til at gruppere prøver baseret på lighed finder vi, at prøverne klynger efter alder, hvilket fremhæver variationen som følge af embryonale alder og behovet for omhyggelig somitmatchning for biologiske replikater (Figur 1C). Vi profileret pluripotent epiblast på E7.5, afstamning spores præmigratoriske og vandrende neurale crest celler ved hjælp af Wnt1-Cre på E8.5 og vandrende neurale crest celler ved hjælp af Sox10-Cre på E9.5 (Figur 1D). Her høster vi specifikt kranieneuralsk våbenskjold ved at halshugge fosteret lige over otic-placode. En sammenligning af de to Cre-drivere (Wnt1 og Sox10), der ofte bruges til at mærke neurale crest celler bekræfter, at de markerer forskellige populationer i tidlige mus embryoner (Figur 1E). Gating-strategier blev anvendt til at opnå levende enkelt RFP-positive celler, som blev sorteret direkte i RNA-ekstraktionslyisopløsning (se materialetabel) og opbevaret ved -80 °C (Figur 1F). Det er vigtigt at holde styr på, hvor mange celler der blev høstet fra hver prøve.
RNA-isolering blev udført ved hjælp af en modificeret version af RNA-kitprotokollen. Konkret bruger vi mini RNA kolonner, der skal opbevares ved 4 °C. Disse kolonner er nyttige til eluting i et lille volumen (11 μL) for at opnå den højest mulige koncentration af RNA fra prøver, hvor celleinput er begrænsende. Af samme grund er det vigtigt at opnå hele den vandige fase efter phenolchloroformekstraktionen. Langsom pipettering og vippe røret til den ene side, mens indsamling er afgørende for at maksimere udbyttet. I denne procedure kvantificerer vi RNA'et ved hjælp af både et spektrofotometer for at indhente oplysninger om salt-/proteinforurening og en kapillær elektroforese til måling af koncentration (Figur 2). Spektrofotometersporingen afslører, at RNA blev isoleret uden forurenende proteiner, men har et højt saltindhold (Figur 2A-2B). Ideelt set 260/280 forholdet skal være ~ 1,8 og 260/230 forholdet skal være > 2,0. Det samlede RNA-udbytte målt ved spektrofotometeret blev ikke større med alderen mellem E8.5-E9.5. Dette skyldes, at spektrofotometerets opløsning ikke er følsom nok til at påvise ændringer i RNA-koncentrationen fra antallet af celler, vi høster, og vi anbefaler, at der anvendes koncentrationsoplysninger fra kapillær elektroforese (figur 2C). Kapillær elektroforese spor kan bruges til at vurdere koncentration og størrelse af RNA fragmenter. Toppe <1000 nukleotider er tegn på nedbrydning. Den repræsentative sporing er i overensstemmelse med RNA, der ikke er nedbrudt. Toppe ved 2000 nukleotider og 5100 nukleotider er henholdsvis 18'ere og 28'ere rRNA. Den lille RNA-region er placeret på ~ 150 nukleotider (Figur 2D).
Små RNA-sekventeringsbiblioteker blev klargjort ved hjælp af det lille RNA-biblioteksforberedelsessæt, der er beskrevet i materialetabellen. Her bruger vi lige mindre end halvdelen af RNA fra hver prøve (4 μL af 11 μL elution, ~ 80-120 ng), der gør det muligt RNA-sekventering biblioteker, der skal syntetiseres fra de resterende RNA fra hver prøve. Her fortynder vi 3' og 5' små RNA-adaptere 1/4 for at sænke mængden af adapterdæmpere til stede og foreslår, at adapterens ligation, oprydning og omvendt transskriptionstrin udføres så meget som muligt på en kontinuerlig måde. Vi har brugt 16 PCR-cyklusser til at forstærke bibliotekerne og foreslå, at det mindste antal PCR-cyklusser for ethvert eksperiment bestemmes empirisk. Ved at fuldføre overskydende PCR cykler, kunne man kunstigt puste læse tælle af en ringe udtrykt miRNA.
Størrelse valg er bydende nødvendigt at berige for biblioteker af miRNAs og ikke adapter dimers, som typisk er til stede. Bibliotekets produktstørrelse (150 bp) og adapterdæmpere (130 bp) er meget ens i størrelse. Gelekstraktion bruges til at isolere de små RNA-sekventeringsbiblioteker væk fra adapterns dimers (Figur 3). Et billede af en PAGE gel før excision viser, at et væld af produktstørrelser er til stede i hver prøve (Figur 3A). Det er vigtigt at lade en vognbane stå åben mellem to prøver eller en stige, der er lastet på gelen. Migrationsfronten i bunden af gelen er let buet, hvilket indikerer, at det kan være nødvendigt at køre med en langsommere hastighed, hvis 150 bp-båndet er vanskeligt at skelne for alle prøver. Dette repræsentative billede viser også en overflod af 150 bp produkt fra den højere koncentration af positiv kontrol RNA (total RNA fra hjernen af en rotte), der gik ind i biblioteket prep i forhold til det, der gik ind i hver embryonale prøve. Den negative kontrol viser, at reagenserne var fri for at forurene nukleinsyrearter (figur 3A). Excision af 150 bp-båndet skal udføres med et rent barberblad, og det indsamlede område er vist i figur 3B. Kapillær elektroforese spor før og efter størrelse udvælgelse viser den dramatiske forbedring af renheden af de 150 bp bibliotek produkt med gel rensning (Figur 3C-3D). Det er vigtigt at bemærke, at sporene i figur 3C-3D har prøvetoppe, der er højere end markørerne, hvilket indikerer overbelastning. I disse tilfælde kan fragmenternes størrelse være nøjagtig, men koncentrationen kan ikke. Kvantificering kan opnås ved at fortynde bibliotekerne i markernes rækkevidde eller ved hjælp af alternative metoder. Vi finder en vis variation på tværs af alternative metoder til bibliotek kvantificering og anbefaler, at flere metoder til kvantificering testes empirisk. Nøjagtig kvantificering af koncentrationen er afgørende for at maksimere antallet af prøver, der skal sorteres på én gang. Biblioteker vil blive fortyndet ned til 1,3 pM for sekventering og generelt overalt fra 15-25 prøver kan sekvenseres på én gang på en 150 cyklus sekventering kit, der giver ~ 140 millioner læser. Dette resulterer i omkring 5 millioner læser per prøve. Generelt kortlægning satser er mellem 60-80%.
Figur 1: Høst af celler fra museembryoner til små RNA-sekvensering. (A)E8.5 mus embryo for at fremhæve fjernelse af æggeblomme sæk og somitter, der anvendes til at bestemme den fase af fosteret (B) Somite iscenesættelse af museembryoner til at fange de stadier af neurale crest udvikling (C) Princip komponent analyse af biblioteker prepped fra sorteret wildtype neurale crest celler viser, at prøver gruppe efter alder (D) Skematisk viser, hvordan prøver blev høstet ved hjælp af Wnt1-Cre på E8.5 til etiket præmigratoriske og vandrende neurale crestceller og Sox10-Cre på E9.5 at mærke kun vandrende neurale crest celler (E) Princip komponent analyse af biblioteker prepped fra sorteret wildtype neurale crest celler viser prøver gruppe sammen af Cre-driver uanset alder (F) Gating strategi, der anvendes til at isolere RFP + neurale crest celler fra E8.5 og E9.5 embryo ved hjælp af FACS sortering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: RNA-isolering fra E7.5-E9.5 museembryoner. (A) Repræsentative spektrofotometer spor af en RNA isolation fra den yngste fase af embryo, at vi har anvendt denne protokol. b)Tabelmed de repræsentative værdier af RNA-kvalitet, der er opnået ved spektrofotometeret. (C)Eksempel på RNA høstet fra sorterede neurale crest celler fra embryoner i hver alder (D) Kapillær elektroforese spor viser god kvalitet RNA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: miRNA-biblioteker før og efter størrelsesvalg. (A) TBE-PAGE gel viser repræsentative små RNA biblioteker for fire prøver og kontrol før og (B) efter 150 bp band excision. Pilene repræsenterer de 150 bp-bånd, der skal fjernes (C) Kapillær elektroforesesporing af lille RNA-bibliotek før og (D) efter størrelsesvalg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Udviklingsprocesser kan gå hurtigt, og celler gennemgår mange sekventielle specifikationer, således at fange et omfattende overblik over miRNA'er, der bidrager til tidlige skæbne beslutninger, mere specifik iscenesættelse er nødvendig end den udbredte halvdags stigning. En nylig undersøgelse har udført RNA sekventering fra Theiler fase 12 embryoner, der spænder fra at have 3 til 6 somites11. Vi finder, at i løbet af denne periode, de neurale crest celler er angivet (3 somitter af alder), delaminat (4 somitter af alder), og migrere (5-6 somitter af alder). Vi finder også, at ud over Cre-driver bruges til afstamning sporcellepopulationer, alder er den største kilde til variation mellem biologiske prøver, og kun somit matchede embryoner bør betragtes som replikater. Dette bør også tages i betragtning, når transgene embryoner sammenlignes med kontrol af vilde typer.
Tidligere metoder til profil miRNA'er under den tidlige udvikling har anvendt mellem 10-100 ng RNA-input til små RNA-sekvenseringsbibliotekspræparat og har samlet flere embryoner i en prøve13,14. Vi demonstrerer RNA isolation og bibliotek forberedelse fra en enkelt E7.5 embryo eller fra sorteret neurale crest celler på E8.5 og E9.5 ved hjælp af ca 100 ng af samlede RNA som input. Når der dissociating embryoner til sortering, bør man passe på at se dissociation under et mikroskop og slukke reaktionen for at observere, når enkelte celler er opnået. Vi finder, at dissociation af kranieregionen E8.5-E9.5 embryoner er næsten øjeblikkeligt med blid manuel pipettering som beskrevet i protokollen. For større væv og stadig ældre embryoner kan dissociationstiden være længere afhængigt af den del af fosteret, der adskilles. For E7.5-E9.5-embryoner er klumper af celler let synlige under mikroskopet, og dissociationen bør fortsætte, indtil der ikke er flere klumper synlige. Enkelte celler er synlige i opløsning, hvis du justerer fokus gennem løsningen i din brønd overalt fra 5-10x. Tidligere metoder sorterer celler direkte i lysisbuffer for RNA-sekvensering for at forberede bulk-RNA fra et lavt antal celler14. Her sorterer vi direkte ind i RNA-ekstraktionslyis-opløsningen, så RNA kan isoleres, inden biblioteksforberedelsen påbegyndes. Brug af minikolonner med 11 μL elueringsvolumen tilladt for en tilstrækkelig høj RNA-koncentration, således at en enkelt RNA-prep kunne deles mellem lille RNA- og masse-RNA-sekvensering.
En aktuel begrænsning af de fleste små RNA sekventeringsmetoder er PCR forstærkning af konverterede cDNA. Vores metode ikke overvinde denne begrænsning, men vi var i stand til at minimere antallet af PCR cykler fra 25-maksimum anbefales ned til 16 cykler. Denne reduktion i forstærkning mindsker kunstig forstærkning bias indført ved PCR. En anden kilde til bias er ligation af adaptere, hvor det er kendt, at specifikke sekvenser placeret i enderne af adaptere og miRNAs kan ligate sammen med større effektivitet end andre sekvenser. For at undgå dette har de adaptere, der anvendes i denne protokol, 4 tilfældige baser indarbejdet i slutningen af hver adapter for at forhindre bias i ligationsreaktioner. Derudover er et andet almindeligt problem den mængde adapterdæmpere, der dannes, når RNA-indgangen er lav. Biblioteket forberedelse kit indeholder trin til at reducere adapter dimer dannelse såsom adapter inaktivering og perle oprydninger til at fjerne overskydende adaptere efter hver ligation. Vi har også fortyndet 3 'og 5' 4N adaptere med 1 / 4 for at reducere mængden af adapter dimer, der kan danne. Vi fandt, at når de ikke fortyndes, de 130 bp band intensitet øger gør det vanskeligt at skelne fra de 150 bp band, der indeholder de ønskede små RNA biblioteker på en gel.
En anden aktuel udfordring med at udarbejde sekventeringsbiblioteker er den nøjagtige kvantificering af produktet før sekvensering. Vi har konstateret, at forskellige metoder giver varierende resultater på samme bibliotek. Vi foreslår, at forskerne bruger flere metoder til kvantificering for at få en nøjagtig vurdering af koncentration.
Denne protokol kan anvendes bredt på genetiske, udviklingsundersøgelser eller andre anvendelser, hvor RNA høstes fra et lavt antal celler. Denne fremgangsmåde forenkler tidsmæssige undersøgelser ved at undgå sammenlægning af embryoner og kan let anvendes på både ikke-sorterede og sorterede celler.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af Andrew McDonough B+ Foundation og NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. er en CPRIT Scholar i Cancer Research (RR150106) og V Scholar in Cancer Research (V Foundation). Forfatterne vil også gerne anerkende Cytometri og Cell Sortering Core på BCM for at levere udstyr, der er nødvendige for dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P.
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
