Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ידידותית למשתמש, תפוקה גבוהה ותוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62832
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

Summary

מיקרוסקופיה הקפאה-אלקטרונית של חלקיק יחיד דורשת חבילת תוכנה מתאימה וצנרת ידידותית למשתמש לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. כאן, אנו מציגים את היישום של חבילת תוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת תמונות, Latitude-S, וצינור מעשי לאיסוף נתונים של ביומולקולים משוקלים בתנאים במינון נמוך.

Abstract

בשנים האחרונות, ההתקדמות הטכנולוגית והמתודולוגית במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד (cryo-EM) סללה דרך חדשה לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים. למרות ההתקדמות המדהימה בהקפאה-EM, עדיין יש היקף לשיפור בהיבטים שונים של זרימת העבודה של ניתוח חלקיקים בודדים. ניתוח חלקיקים בודדים דורש חבילת תוכנה מתאימה לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. בשמונה השנים האחרונות פותחו מספר חבילות תוכנה אוטומטיות לרכישת נתונים להדמיה אוטומטית עבור קריו-EM של חלקיק יחיד. מאמר זה מציג יישום של צינור רכישת תמונה אוטומטי לחלוטין עבור biomolecules מנוצל בתנאים במינון נמוך.

הוא מדגים חבילת תוכנה, שיכולה לאסוף נתוני cryo-EM באופן מלא, אוטומטי ומדויק. בנוסף, פרמטרים מיקרוסקופיים שונים נשלטים בקלות על ידי חבילת תוכנה זו. פרוטוקול זה מדגים את הפוטנציאל של חבילת תוכנה זו בהדמיה אוטומטית של תסמונת הנשימה החריפה החמורה-נגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2) חלבון ספייק עם מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים 200 keV המצויד בגלאי אלקטרונים ישיר (DED). כ-3,000 תמונות של סרטי קריו-EM נרכשו במפגש אחד (48 שעות) של איסוף נתונים, שהניבו מבנה ברזולוציה אטומית של חלבון הספייק של SARS-CoV-2. יתר על כן, מחקר מבני זה מצביע על כך שחלבון הספייק מאמץ שני קונפורמציות עיקריות, 1-RBD (תחום מחייב קולטן) פתוח וכל RBD למטה קונפורמציות סגורות.

Introduction

קריו-EM חלקיק יחיד הפך טכניקה ביולוגית מבנית המיינסטרים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של macromolecules ביולוגי1. שחזור חלקיק יחיד תלוי ברכישת מספר עצום של מיקרוגרפים של דגימות מוויטוריות כדי לחלץ תמונות חלקיקים דו-ממדיות (2D), המשמשות לאחר מכן לשחזור מבנה תלת מימדי (תלת-ממדי) של מקרו-קולקול ביולוגי2,3. לפני הפיתוח של DEDs, ההחלטה שהושגה משחזור חלקיק יחיד נע בין 4 ל 30 Å4,5. לאחרונה, הרזולוציה ברת השגה של קריו-EM חלקיק יחיד הגיעה מעבר 1.8 Å6. DED ותוכנה אוטומטית לרכישת נתונים היו התורמים העיקריים למהפכת החלטה זו7, שבה ההתערבות האנושית באיסוף נתונים היא מינימלית. בדרך כלל, הדמיית cryo-EM מבוצעת בשיעורי מינון אלקטרונים נמוכים (20-100 e/Å2) כדי למזער נזקי קרינה הנגרמים על ידי קרן אלקטרונים של דגימות ביולוגיות, מה שתורם ליחס האות לרעש הנמוך (SNR) בתמונה. SNR נמוך זה מונע את האפיון של המבנים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים באמצעות ניתוח חלקיקים בודדים.

גלאי האלקטרונים מהדור החדש הם גלאים מבוססי CMOS (מוליכים למחצה משלימים של תחמוצת מתכת), שיכולים להתגבר על מכשולים נמוכים אלה הקשורים ל- SNR. מצלמות CMOS לזיהוי ישיר אלה מאפשרות קריאה מהירה של האות, שבגללו המצלמה תורמת פונקציית התפשטות נקודה טובה יותר, SNR מתאים ויעילות קוונטית בלשית מעולה (DQE) עבור מקרומולקולים ביולוגיים. מצלמות זיהוי ישיר מציעות SNR8 גבוה ורעש נמוך בתמונות המוקלטות, וכתוצאה מכך עלייה כמותית ביעילות הקוונטית הבלשית (DQE) - מדד של כמות הרעש שהגלאי מוסיף לתמונה. מצלמות אלה גם מקליטות סרטים במהירות של מאות פריימים לשנייה, מה שמאפשר רכישת נתונים מהירה9,10. כל המאפיינים האלה הופכים מצלמות זיהוי ישיר מהירות המתאימות ליישומים במינון נמוך.

תמונות מחסנית מתוקנות בתנועה משמשות לעיבוד נתונים כדי לחשב סיווג 2D ולשחזר מפת צפיפות תלת-ממדית של פקודות מאקרו באמצעות חבילות תוכנה שונות כגון RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 ו- EMAN215. עם זאת, עבור ניתוח חלקיקים בודדים, ערכת נתונים עצומה נדרשת כדי להשיג מבנה ברזולוציה גבוהה. לכן, אגרת רכישת נתונים אוטומטית חיונית מאוד לאיסוף נתונים. כדי להקליט ערכות נתונים גדולות של Cryo-EM, נעשה שימוש במספר חבילות תוכנה בעשור האחרון. חבילות תוכנה ייעודיות, כגון AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS ו- EPU, פותחו לרכישת נתונים אוטומטית.

חבילות תוכנה אלה משתמשות במשימות שגרתיות כדי למצוא מיקומי חור באופן אוטומטי על-ידי מתאם התמונות בהגדלה נמוכה לתמונות בהגדלה גבוהה, המסייעת בזיהוי חורים עם קרח מרץ של עובי קרח ניכוס לרכישת תמונה בתנאים במינון נמוך. חבילות תוכנה אלה הפחיתו את מספר המשימות החוזרות ונשנות והגדילו את התפוקה של איסוף נתוני cryo-EM על ידי רכישת כמות עצומה של נתונים באיכות טובה במשך מספר ימים ברציפות, ללא כל הפרעה ונוכחות פיזית של המפעיל. Latitude-S היא חבילת תוכנה דומה, המשמשת לרכישת נתונים אוטומטית לניתוח חלקיקים בודדים. עם זאת, חבילת תוכנה זו מתאימה רק למטעני K2/K3 ומסופק לגלאים אלה.

פרוטוקול זה מדגים את הפוטנציאל של Latitude-S ברכישת תמונה אוטומטית של חלבון ספייק SARS-CoV-2 עם גלאי אלקטרונים ישיר המצויד בהקפאה-EM של 200 keV (ראה טבלת החומרים). באמצעות כלי איסוף נתונים זה, 3,000 קבצי סרט של חלבון ספייק SARS-CoV-2 נרכשים באופן אוטומטי, ועיבוד נתונים נוסף מתבצע כדי להשיג מבנה חלבון ספייק ברזולוציה של 3.9-4.4 Å.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: שלושה שלבים חשובים נדרשים לאיסוף נתונים cryo-EM: 1. הכנת רשת cryo-EM, 2. כיול ויישור של המיקרוסקופ, 3. איסוף נתונים אוטומטי (איור 1). יתר על כן, איסוף נתונים אוטומטי מחולק ל- a. בחירת שטח מתאימה, ב. אופטימיזציה של Latitude-S, c. התחל בחירת חורים אוטומטית ו- d. התחל רכישת נתונים אוטומטית (איור 1).

1. הכנת רשת Cryo-EM וטעינה לדוגמה לרכישת נתונים אוטומטית

  1. נקו את הרשתות באמצעות פריקה זוהרת ושנו את הפרמטרים של הפרשות זוהרות בהתבסס על דרישות ניסיוניות (כאן, 60 s ב-20 mA).
  2. הוסיפו דגימת חלבון טרייה (3 מיקרו-אל) לרשת המשוחררת בזוהר ודגרו במשך 10 מטרים.
  3. כתם הרשתות עבור 3-5 s ב 100% לחות במהירות לצלול אותם לתוך אתאן נוזלי באמצעות בוכנה הקפאה.
  4. מהדק את הרשתות באופן ידני לתוך טבעת קליפ כדי ליצור את המחסנית באמצעות טבעת C-קליפ גמישה.
  5. טען את הרשתות הקפואות המותקנות על מחסנית לתוך קלטת הטעינה האוטומטית והעבר את הקלטת על ידי מכסה הננו לטוען האוטומטי המכוסה מראש של המיקרוסקופ לאיסוף נתונים.

2. כוונון מיקרוסקופ ויישור בסיסי לפני רכישת נתונים אוטומטית

  1. הזזת קרן
    1. לחץ על הזזת Beam מהכרטיסיה יישור ישיר .
    2. הפחת את ההגדלה ומרכז את הקרן לציר האופטי באמצעות ידית X ו- Y הרב-תכליתית .
  2. יישור נקודת ציר
    1. לחץ על האפשרות הטיית קרן ביישור ישיר pp X מהכרטיסיה יישור ישיר .
    2. מעבים את הקרן לנקודה וממזערים את התנועה באמצעות ידית Multifunction X ו- Y .
  3. מרכוז צמצם C2
    1. בחר את צמצם המרוכז מהכרטיסיה יישור .
    2. מעבים את הקרן לנקודה, מרכזים את הקרן לציר האופטי, ואז מרחיבים את הקרן כדי לכסות את המעגל באופן שווה.
    3. חזור על שלבים אלה עד לצמצם Condenser 2 מותאם.
  4. יישור ללא תרדמת
    1. לחץ על יישור X ללא תרדמת מהכרטיסיה יישור ישיר כדי ליישר את הקרן לציר האופטי.
    2. השתמש במידית הרב-תכליתית כדי למזער את הצורה והתנועה של ה- FFT (ודא שהיא יציבה).
    3. חזור על אותו הליך עבור תרדמת - יישור חינם Y.
  5. הגדר תאורה מקבילה לפני איסוף נתונים בהקפאה-EM בגלל עדשת התאום C.
    1. הכנס את הצמצם האובייקטיבי (70 מיקרומטר) במצב עקיפה.
    2. למקד את הצמצם האובייקטיבי על המישור המוקד הקדמי של עדשת העקיפה על ידי שליטה על ידית עוצמת defocus (עדשה אובייקטיבית וזרם עדשת C2).
    3. ודא כי הקצה החד של הצמצם האובייקטיבי נראה לאחר נטרול נכון.
    4. מכניסים את פקק הקרן ומפזרים את העוצמה עד למזעור טבעות עקיפה של אבקת הזהב.
      הערה: אם הקרן מתפשטת כראוי, טבעת עקיפה ברורה של אבקת הזהב נראית על המסך, מה שמצביע על כך שהקרן מקבילה.
    5. יש לבטל את פקק הקרן לאחר הגדרת התאורה המקבילה ולשנות את מצב המיקרוסקופ לגשושית Nano.
      הערה: בדוק את כוונון המיקרוסקופ לפני תחילת איסוף הנתונים כדי להבטיח את הביצועים האופטימליים של המיקרוסקופ. כל ההגדרות הללו יבוצעו בכרטיסיית GUI יישור ישיר של מיקרוסקופ. כל כוונון המיקרוסקופ מתבצע באמצעות רשת בדיקה לפני איסוף נתונים.

3. רכישת נתונים עם Latitude-S

  1. הפעל את תוכנת רכישת הנתונים האוטומטית של Latitude-S.
    הערה: התקנת Latitude-S דורשת גם כיול מיקרוסקופ, שיבוצע לפני איסוף הנתונים, וההגדרות יאוחסנו לצמיתות. חמישה מצבים שונים לאיסוף נתונים מכוילים בארבע הגדלות שונות (איור 1 ואיור 2). מצב אטלס ומצב הרשת נמצאים בשתי הגדלות שונות במצב LM (טווחי הגדלה נמוכה). מצב החור נמצא במצב שיוך (טווחי הגדלה גבוהה) אך עם הגדלה מתונה. מיקוד ומצב נתונים משתמשים במצב שיוך הפעלה בהגדלה גבוהה.
    1. לחץ על DigitalMicrograph מתפריט התחלה , או לחץ פעמיים על סמל DigitalMicrograph בשולחן העבודה.
    2. בחר את סמל מנהל הטכניקות מתוך DigitalMicrograph.
      הערה: מערכת זו תציג סמלי TEM ו - Latitude-S (איור 2 ואיור משלים S1).
    3. בחר את סמל Latitude-S לאיסוף נתונים אוטומטי של חלקיק יחיד.
      הערה: מצלמת K2 פועלת בשלושה מצבים: ליניארי/משולב, נספר ורזולוציית-על. המשתמש יכול לבחור כל מצב בממשק של DigitalMicrograph. ניתן לשמור תמונות נתונים כערימות תמונה מחולקות במינון או כתמונות שסוכמו בקבצי MRC, TIF או .dm4 עם עומק סיביות שונה. יתר על כן, ניתן לשמור נתונים כתמונות מתוקנות בתנועה עבור מצלמת K3. במצלמת K2, ניתן לשמור מחסנית תמונות לא מעובדת כקבצי MRC, TIF של 8 סיביות או 8 סיביות.
  2. צור הפעלה חדשה בהתבסס על ההגדרות מהפעלה קודמת.
    1. סמן את תיבת הסימון מבוסס על הפעלה קודמת בלוח הצבעים.
    2. בחר בלחצן חדש .
    3. בחר את התיקיה המכילה את ההפעלה שעליה מבוססות הגדרות ההפעלה החדשה. עבור אל ספריית ההפעלה הקודמת כדי ליצור את ההפעלה החדשה. בחר את התיקיה לשמירת ההפעלה החדשה והנתונים המשויכים.
    4. בחר ובחר את התיקיה שבה יישמרו ההפעלה החדשה והנתונים המשויכים.
      הערה: כל מצב וההגדרות הבסיסיות שלו (הגדלה, תנאי תאורה, תמונה או מקרן) ופרמטרים של הזזת קרן ומצלמה (חשיפה כוללת, חשיפה למסגרת אחת ו- binning) ייוצאו מההפעלה הקיימת להפעלה החדשה. נתיב התיקיה מוצג כמחרוזת טקסט בתחתית לוח הצבעים. לכל אחד מהמדדים ולוחות התצורה יש כוכבית (*) המצורפת לכותרת כדי להראות שהיא כבר הוגדרה והיא מוכנה לשימוש.
  3. המשך הפעלה קיימת.
    1. לחץ על לחצן המשך בלוח הצבעים כדי להמשיך הפעלה קיימת.
      הערה: אין אפשרות לשנות את מונטאז' האטלס.
    2. בחר ונווט אל התיקיה המכילה את ההפעלה שיש להמשיך.
  4. התחל הפעלה חדשה לגמרי.
    1. לחץ על הכרטיסיה חדש בלוח הצבעים. בחר את התיקיה המכילה את ההפעלה להמשך. בחר תיקיה לשמירת הנתונים.
      הערה: שם התיקיה המוגדר כברירת מחדל נבנה באמצעות התאריך והשעה.
    2. לחץ על סמל ההגדרה . בתיבה נהל סייר במצב שמופיע, הוסף מצב, הגדר את תנאי TEM, את תנאי המצלמה ואת התמונה/מחסנית ולאחר מכן תן שם למצב.
      הערה: זרימת העבודה האוטומטית של רכישת נתונים משתמשת ב- 5 מצבים שונים לאיסוף נתונים אוטומטי. מצבים אלה מוגדרים ומאוחסנים בלוחות המצב המתאימים שלהם. סיכום המצב ניתן בטבלה 1.
  5. קבע את תצורת מצב האטלס.
    1. לחץ על לוח המצב של אטלס.
    2. קבע את תצורת מצב האטלס עם הפרמטרים הבאים: הגדלה 115x LM מצב בגשושית ננו, תנאי תאורה-ספוט גודל 8 ובהירות 934400, binning: 1 וזמן חשיפה למצלמה: 1.0 s להדמיה בהגדלה נמוכה. עיין בסיכום המצב שניתן בטבלה 1.
    3. לחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא.
      הערה: מצב אטלס הוא מצב ההגדלה הנמוך ביותר, המספק את הסקר של הרשת כולה (איור משלים S2). בדרך כלל, מצב זה עוזר לנו לדמיין את הרשתות כולן בהגדלה נמוכה ולשפוט את עובי הקרח, השטוחות והכיכר השבורה של הרשתות. מומלץ ליצור את האטלס באזורים שונים של הרשת כדי לבחון את עובי הקרח האופטימלי ואת עובי הקרח התת-אופטימלי של הרשתות (איור משלים S3). הפרמטרים שהוזכרו יכולים להיות מגוונים בהתאם לצרכי המשתמש.
  6. קבע את תצורת מצב הרשת.
    1. לחץ על לוח המצבים של הרשת.
    2. קבע את תצורת מצב הרשת עם אופטיקת הדמיית המיקרוסקופ הבאה (מצב הגדלה 380x LM בגשושית Nano), תנאי תאורה (גודל ספוט: 8 ובהירות 626,200), binning: 1 וזמן חשיפה למצלמה: 1.0 שניות.
    3. עיין בסיכום המצב Latitude-S המופיע בטבלה 1.
    4. לחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא.
      הערה: מצב הרשת מוגדר בהגדלה גבוהה יותר ממצב האטלס כך ששדה הראייה הוא ריבוע רשת אחד (איור 2). בהגדלה מסוימת זו, נצפתה ריבוע רשת אחד. לכן, חורים נצפים כראוי בהגדלה זו, אשר מסייע לבדוק את עובי הקרח של החורים (איור משלים S4). מסנן bandpass פשוט משמש במצב הרשת כדי לאתר את החורים ברשת הפטנטים. הפרמטרים שהוזכרו יכולים להיות מגוונים בהתאם לצרכי המשתמש.
  7. קבע את תצורת מצב החור.
    1. לחץ על לוח החורים.
    2. קבע את תצורת מצב החור עם הגדרות המיקרוסקופ הבאות: אופטיקה הדמיה (מצב הגדלה 4500x SM בגשושית Nano), תנאי תאורה (גודל ספוט: 7 וקוטר קרן 8.81 מיקרומטר), binning: 1 וזמן חשיפה למצלמה: 1.0 s.
    3. שנה את הפרמטרים במידת הצורך בהתבסס על סוג הרשת. עיין בסיכום המצב המופיע בטבלה 1.
    4. לחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא.
      הערה: מצב שיוך (SA) מציין טווח הגדלה גבוה במיקרוסקופ האלקטרונים. מצב החור נמצא בטווח ההגדלה של SA עם שדה ראייה של כמה מיקרומטרים (10-20 מיקרומטר) (איור 2 ו-S4 איור משלים). טווח הגדלה זה גבוה ממצב אטלס או רשת אך קטן בהרבה ממצב מיקוד/נתונים. בהגדלה זו, חורים בודדים יהיו גלויים. גודל החור מתאים להתבונן בדרגות גבוהות של זיהומים, חורים ריקים, ואת עובי הקרח הנכון של החורים. החורים להדמיה נבחרים על סמך הנחות אלה. שני מסננים משמשים במצב החור: אחד למתאם צולב של תמונת הפניה לחור עם תמונת חור חדשה והשני להתאמת גובה הבמה לגובה האוצנטרי.
  8. קבע את תצורת מצב המוקד.
    1. לחץ על לוח פוקוס.
    2. קבע את תצורת מצב המיקוד עם הגדרות המיקרוסקופ הבאות: אופטיקה הדמיה (הגדלה של 45,000x SA במצב ננו-גשוש), תנאי תאורה (גודל ספוט: 8 ובהירות 934400), binning: 1 וזמן חשיפה למצלמה: 1.0 שניות.
    3. תתמקד באזור הפחמן האמורפי ליד החור. עיין בסיכום המצב Latitude-S המופיע בטבלה 1.
    4. לחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא.
      הערה: מצב שיוך (SA) מציין טווח הגדלה גבוה במיקרוסקופ האלקטרונים. מצב המוקד הוא הגדלת טווח שיוך ה- SA הגבוהה יותר. במצב מיקוד, הקרן מועברת לאזור פחמן סמוך של חור היעד ומבצעת מיקוד באופן אוטומטי כדי לאסוף את הנתונים במצב הנתונים. מסנן bandpass בשילוב עם מסנן הנינג או מסנן מלבני רך משמש במצב המיקוד כדי למדוד את ההיסט בין שתי תמונות של מצב מיקוד באותו אזור (איור 2). הפרמטרים שהוזכרו יכולים להיות מגוונים בהתאם לצרכי המשתמש.
  9. קבע את תצורת מצב הנתונים.
    1. לחץ על לוח נתונים.
    2. קבע את תצורת מצב הנתונים עם הגדרות המיקרוסקופ הבאות: אופטיקה הדמיה (למשל, הגדלה 28,000x, 45,000x, 54,000x במצב SA בגשושית ננו), תנאי תאורה (גודל ספוט: 8 ובהירות 934400), binning: 1 וזמן חשיפה למצלמה: 1.0 שניות.
    3. עיין בסיכום המצב Latitude-S שניתן בטבלה 1.
    4. לחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא.
      הערה: מצב הנתונים הוא ההגדלה הגבוהה ביותר שנבחרה בהתבסס על דרישות גודל הפיקסלים ורזולוציית היעד (איור 2). בדרך כלל, לאחר התמקדות, הקרן מועברת באופן אוטומטי לאזור היעד כדי לאסוף את הנתונים. ניתן לשנות את הפרמטרים הנ"ל בהתבסס על דרישות המשתמש.

4. תצורת מיקוד

  1. לחץ על לוח התצורה של המוקד. ציין את טווח ערכי ההשבתה ואת גודל השלב בכרטיסיה הנתונה.
  2. לחץ על לחצן הבא כדי לעבור לשלב הבא.
    הערה: ניתן להשתמש בערכי נטרול נמוכים יותר לרכישת נתונים ברזולוציה גבוהה. בדרך כלל, ערכי נטרול של -0.5 עד -3.0 מיקרומטר עם גדלי שלב נטרול 0.25 או 0.5 משמשים לרכישת תמונה. משתמשים יכולים לדלג על שלב הגדרת המוקד אם ברצונם רק לסנן את הדוגמה. כל שעליך לעשות הוא ללחוץ על לחצן הבא בלוח הצבעים כדי לדלג על שלב קביעת התצורה של המוקד.

5. יישור עדין

  1. התמקד כמה תכונות על הרשת (למשל, קרח משושה זיהום קרח); ראו איור 3.
    הערה: התכונות לא צריכות להיות גדולות מדי או קטנות מדי. הם צריכים להיות גלויים הן בהגדלת מצב אטלס 115x (מצב LA) והן בהגדלת נתונים.
  2. לחץ על לחצן לכידה . מקם את סימן הצלב האדום באותה תכונה בכל תמונה של מצבים שונים.
  3. התחל עם מצבי מיקוד, נתונים וחורים מכיוון שתחום הראייה שלהם גדול בהרבה ממצהי האטלס והרשת. הגדל אטלס ומדיני רשת כדי למקם את סימן הצלב האדום באותה תכונה במצבי האטלס והרשת.
  4. לחץ על לחצן חשב כדי לחשב את המיקום של חמישה מצבים שונים, אשר יחשב את ההוזזים בין כל אחד מהמצבים וישקף אותם לחלון הפלט.
    הערה: ערכי ההיסט משולבים במדינות לשימוש נוסף (איור 3). יישור עדין מתבצע כדי לספק דיוק גבוה של המיקום של כל מדינה (איור 3). יישור עדין זה מסייע לאתר במדויק את המיקום המדויק בכל חמש המדינות. יישור עדין הוא קריטי לרכישת נתונים של חלקיק יחיד. לכן, מומלץ מאוד לבצע יישור עדין לפני הדמיה.

6. הליך רכישת נתונים באמצעות Latitude-S

  1. לחץ על לוח הלכידה.
    הערה: בדרך כלל, נתוני אטלס נאספים בהגדלה נמוכה (115x) כדי לדמיין את רוב ריבועי הרשת.
  2. בחר את גודל האטלס כדי לכסות את הרשת כולה או חלק מהרשת בהתבסס על הדרישה (למשל, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 או 8 x 12).
    הערה: 16 על 16 גודל אטלס מכסה את הרשת כולה.
  3. לחץ על לחצן לכידה כדי ללכוד את האטלס.
    הערה: חלון הניווט הראשי של Latitude-S נפתח וממלא את השטח הזמין ב- DigitalMicrograph (איור משלים S5). שלוש חלוניות תמונה בחלון הניווט הראשי מציגות תמונות של מצבי המערכת בשלוש הגדלות שונות. האטלס הכולל מוצג כעת במצב הרכישה הנוכחי שלו בחלונית הימנית ביותר. אריחים באטלס יתמלאו כאשר כל לכידה מתרחשת.
  4. בחר את ריבוע הרשת בהתבסס על עובי הקרח על-ידי ניווט באטלס (איור משלים S5). לאחר בחירת ריבועי הרשת הרצויים, לחץ על לחצן לוח זמנים וצפה באריחים בריבוע הרשת מתמלאים כאשר כל ריבוע רשת נלכד.
  5. לחץ על לחצן תזמון לאחר בחירת ריבועי הרשת.
  6. בחר חור מייצג בריבוע הרשת על-ידי הוספת מיקומו. לאחר רכישת תמונת חור, הגדר את הנתונים ואת מיקומי המיקוד ושמור את הפריסה כתבנית (איור משלים S6).
  7. לחץ על חיפוש אוטומטי, תן את גודל החור (למשל, R1.2/1.3), ולחץ על כפתור חיפוש בתוכנית, אשר יגרום לתוכנית חיפוש למצוא באופן אוטומטי את החורים בהתבסס על קוטר החור. לאחר מכן, לחץ על לחצן סמן כדי להוסיף את התבנית (איור 4) והוסף סימוני עיגול אדומים בכל החורים ברשת אחת או בריבוע רשת חלקי.
  8. הגדר את העוצמה כדי להסיר את החורים מכיכר הרשת ומזיהום הקרח (איור 4).
    הערה: לבסוף, החורים שנבחרו יסומנו בצהוב לתזמון איסוף הנתונים.
  9. לחץ על לחצן תזמון במשימות Latitude לאחר הוספת החורים דרך חיפוש אוטומטי.
    הערה: לפני תזמון איסוף הנתונים האוטומטי, ודא שרמת מיכל החנקן הנוזלי מספיקה, משאבת הטורבו האוטומטית כבויה ושטח הכונן RAID פנוי. מנהל המשימות Latitude-S מציג את מספר מצבי האטלס, ריבוע הרשת, החור והנתונים המתוזמנים לאיסוף נתונים (איור 5). ב- Latitude-S GUI, ערכות צבעים שונות יהיו גלויות, ומשמעות ערכות הצבעים השונות תוצג: 1. צהוב מציין לא מתוכנן; 2. ירוק מציין מתוזמן; 3. כחול מציין שנרכש; 4. אדום מציין נכשל.

7. עיבוד נתונים Cryo-EM

הערה: עיבוד תמונה Cryo-EM של חלבון ספייק מתואר בפירוט בספרות האחרונה25.

  1. בצע עיבוד תמונה של חלבון ספייק של SARS-CoV2 באמצעות RELION 3.011.
  2. מסך תמונות הסרט שנאספו באמצעות Latitude-S באופן ידני, ובצע תיקון תנועה המושרה בקורה של הסרטים הבודדים באמצעות תוכנת MotionCor29. בצע את ההקרנה הראשונית של מיקרוגרפים מתוקנים בתנועה באופן ידני בעזרת חבילת תוכנה cisTEM14.
    הערה: כמעט 85% מהמיקרוגרפים שנרכשו באופן אוטומטי היו באיכות טובה, ולנתונים היה אות בתוך 3.7-5.2 Å, המחושב באמצעות תוכנת cisTEM14 (איור משלים S7A, B).
  3. עבד את הנתונים באמצעות חבילת התוכנה RELION 3.011.
    1. בחרו חלקיקי ספייק באופן ידני והכפפו אותם לסיווג מחלקה דו-יומי (איור משלים S7C). השתמש במחלקה הדו-ממדית הטובה ביותר כהפניה לבחירה אוטומטית של 3,99,842 חלקיקים חד-ספייק מהמיקרוגרפים באמצעות כלי הבחירה האוטומטית RELION11.
      הערה: שלושה סיבובים של סיווג 2D בוצעו לפני חשיפת החלקיקים לסיווג 3D (איור משלים S8). כ-2,55,982 חלקיקים בודדים נבחרו לסיווג תלת-ממדי, וערצת הנתונים סווגה לשש מחלקות. עידון אוטומטי תלת-ממדי סופי בוצע עם המעמד הטוב ביותר; 85,227 חלקיקי ספייק התקבלו מהסיווג 3D.
    2. לאחר עידון אוטומטי, בצע שיפור לכל נטרול חלקיקים עם פרמטרים מתאימים של הטיית קרן לשיפור הרזולוציה. לאחר מכן, הכפוף את החלקיקים לליטוש בייסיאן באמצעות חבילת התוכנה RELION 3.011. לבסוף, השתמש בערכת החלקיקים המלוטשים לסיבוב נוסף של עידון אוטומטי תלת-ממדי באמצעות RELION 3.011.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במצב המגיפה הנוכחי, cryo-EM ממלא תפקיד מרכזי באפיון המבנים של חלבונים שונים מ SARS-CoV-226,27,28,29, אשר עשויים לסייע בפיתוח חיסונים ותרופות נגד הנגיף. יש צורך דחוף במאמצי מחקר מהירים עם משאבי אנוש מוגבלים למאבק במחלת הקורונה של 2019. רכישת נתונים בהקפאה-EM של חלקיק יחיד היא צעד גוזל זמן אך מכריע בקביעת המבנה של מקרומולקולים. ההתפתחויות האחרונות ברכישת נתונים אוטומטית של Cryo-EM אפשרו התערבות אנושית מוגבלת באיסוף נתונים. תוכנת Latitude-S היא חבילת תוכנה חשובה לרכישת נתונים אוטומטית המשמשת כאן לאיסוף נתונים אוטומטי של חלבון ספייק SARS-CoV2 מטוהר.

רכישת נתוני Cryo-EM של חלבון ספייק SARS-CoV-2 בוצעה עם 200 keV cryo-EM המצויד ב- K2 Summit DED. המיקומים לרכישת נתונים ברשת עם עובי קרח רצוי והתפלגות חלקיקים סומנו באופן ידני. הפוזיציות סומנו במקביל במהלך רכישת נתונים שהתרחשו ברקע. בעמדות המסומנות, תוכנת Latitude-S ביצעה רכישת נתונים אוטומטית בהגדלה נומינלית של 42,200x בגודל פיקסל של 1.17 Å ברמת הדגימה. התצורה לאיסוף נתונים בהגדלה של פי 42,200 הוגדרה מראש ונבדקה כבר. בסך הכל נרשמו 40 מסגרות עבור 8 s עם מינון אלקטרונים של 2 e −/ Å2 לכל מסגרת; לפיכך, מינון כולל של 80 e−/Å2 שימש לאיסוף נתונים (איור משלים S9). הנתונים נרכשו בטווח נטרול של −0.75 מיקרומטר ו- −2.25 מיקרומטר, עם 3,000 קבצי סרטים שנאספו ביומיים. כל 4 שעות, בדיקות תקופתיות והתאמות בוצעו על ידי התוכנה כדי להבטיח כי כל קבצי הסרט שנאספו מעל 48 שעות היו באיכות טובה ולא היה שינוי קרן או שינוי יישור. הנתונים נאספו באופן עצמאי ללא כל התערבות אנושית. בנוסף, Latitude-S מפסיקה באופן אוטומטי את ההדמיה בזמן מילוי חנקן נוזלי, מה שמפחית רטט מיותר או סחף מכני בתמונות.

כפי שהוזכר בסעיף הפרוטוקול, ההקרנה הראשונית של מיקרוגרפים מתוקנים בתנועה בוצעה באופן ידני באמצעות תוכנת cisTEM14. בהתבסס על ההקרנה, רוב הנתונים נמצאו בטווח האותות של 3.7-5.2 Å (איור משלים S7A). הדבר מצביע על כך שאיסוף הנתונים האוטומטי באמצעות Latitude-S טוב, ורוב הנתונים מתאימים לשחזור תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה. בנוסף, תמונות נאספו בטווח defocus (-0.75--2.25 מיקרומטר), וטווחי נטרול שונים נבדקו באופן ידני על ידי cisTEM14. הנתונים שנרכשו היו קרובים מאוד לטווח הפירוק של ההתקנה ב- Latitude-S (איור משלים S7A, B).

עיבוד הנתונים בוצע באמצעות חבילת התוכנה RELION 3.011. חלקיקי ספייק נבחרו ידנית כדי לחשב את ממוצעי המחלקה הדו-חמצנית. פרטים מבניים שונים (סליל וגיליון β) נראים בממוצעי המחלקה הדו-פעמית (איור משלים S7C), מה שמצביע בחום על כך שאפיון מבני ברזולוציה גבוהה אפשרי באמצעות ערכת נתונים זו. עם זאת, סיווג תלת-ממד גם מציין כי חלבון ספייק יש 1-קולטן מחייב תחום (RBD) פתוח וכל RBD למטה קונפורמציה קרוב (איור משלים S8). הסיווג 3D מציין כי מחלקה-1 יש את המספר המרבי של חלקיקים, המופיעים כמו 1-RBD למעלה התאמה פתוחה. יתר על כן, בכיתה 3 וכיתה-4 יש מספר דומה של חלקיקים, ושני הדגמים נראה שיש כל RBD למטה קונפורמציה קרובה. עם זאת, מחלקה 5 מציגה התאמה ביניים, כאשר 1-RBD נמצא במצב ביניים. עם זאת, הקונפורמציות הפתוחות של חלבון הספייק 1-RBD שוחזרו באמצעות סימטריה C1, והרזולוציה הכוללת היא 4.4 Å (איור 6 ו-S10 איור משלים). באופן דומה, כל ה-RBD בהתאמה קרובה (מחלקה-3 ודרגה 4) שופרו יחד עם סימטריית C3, והרזולוציה הכוללת ב- 0.143 FSC היא ~ 3.9 Å (איור 7).

עיבוד התמונה הכולל מציין שחלבון הספייק מאמץ את כל ה-RBD מקרוב ו-1-RBD למעלה. בנוסף, זוהה זיהוי של התאמה ביניים של חלבון הספייק. מבנה ה-Cryo-EM ברזולוציה גבוהה של תת-תחום S2 של חלבון הספייק מציין את שרשראות הצד של שאריות חומצות אמינו בודדות (איור 6B ואיור 7C). כל שחזורי 3D ותוצאות cryo-EM דומים מאוד לממצאים בספרות שפורסמה לאחרונה25. עם זאת, מבנה ה-cryo-EM ברזולוציה גבוהה של חלבון ספייק התאפיין בתוך 15 יום, וזה אפשרי רק בגלל פרוטוקולי רכישת נתונים cryo-EM אוטומטי ותוכנה אוטומטית לקטיף חלקיקים. לכן, חבילות תוכנה אוטומטיות לרכישת נתונים, כולל Latitude-S, יכולות לתרום באופן משמעותי לאפיון של מספר מבנים קריו-EM ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה של רכישת נתונים אוטומטית באמצעות Latitude-S: בצעו צעדים כלליים לפני איסוף הנתונים (הכנת רשת, טעינה לדוגמה וכוונון מיקרוסקופ). רכישת נתונים היא החלק העיקרי של כתב יד זה, ואת הצינור להיות אחריו במהלך רכישת נתונים מודגש. קיצורים: קריו-EM = מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התקנה של מצבים שונים לאיסוף נתונים של חלקיקים בודדים באמצעות חבילת התוכנה Latitude-S GUI. (A) Latitude-S לרכישת נתונים בחליפת התוכנה DM3. (ב) זרימת עבודה של הליך רכישת הנתונים. (ג) הרחבה של כל חלונית. קיצור: GUI = ממשק משתמש גרפי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: יישור עדין כדי להגדיר דיוק גבוה למיקוד ולרכישת תמונות. יישור עדין מבוצע בחמישה מצבים א. אטלס, ב. חור, ג. נתונים, ד. רשת, ה. פוקוס. מקד כל מצב על-ידי הצבת הסימן האדום על אותה תנוחה. מומלץ מאוד לבצע יישור עדין לפני תחילת כל הפעלה חדשה, אשר יסייע לבצע הדמיה במצב מסוים. רכישת תמונה במצב מסוים (ללא כל שינוי משמעותי) תלויה לחלוטין בדיוק של היישור העדין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: בחירת חור אוטומטית באמצעות Latitude-S. חיפוש אוטומטי של חורים לרכישת נתונים מתבצע באופן אוטומטי בהתבסס על גודל החור. (A) מציג את המיקום של וקטור מציאת החורים למציאת החורים באופן אוטומטי. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) מציג את סימון החורים באמצעות וקטור מציאת החור והתאמת העוצמה להסרת הסמן מאזור הגבול וזיהום הקרח. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר (משמאל) ו- 10 מיקרומטר (אמצע). (ג) מציג את ההוספה האוטומטית של החורים להדמיה (צהוב). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תצוגה חיה של רכישת נתונים. (א) הפוזיציות מסומנות בצהוב, ירוק, כחול ואדום בהתבסס על מצב רכישת הנתונים בכל עמדה. (ב) קוד צבע לניטור מצב רכישת הנתונים. ירוק: מתוכנן, צהוב: לא מתוכנן, כחול: לרכוש, אדום: נכשל. החלונית השמאלית מציגה מספר חורים בצבע ירוק (מתוכנן) וכמה חורים המסומנים בכחול (נרכש); סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. החלונית האמצעית מציגה הגדלה של פי 4,300 של חור בודד. בתמונה זו של חור (החלונית האמצעית), התיבה הריבועית הכחולה מציגה את אזור המוקד, והתיבה הריבועית הירוקה מציגה את אזור ההדמיה; סרגל קנה מידה = 1000 ננומטר. החלונית הימנית מציגה את התמונה שנרכשה. החלונית הימנית הקיצונית מציגה את מספרי התמונות המתוזמנים, את הזמן הכולל הנדרש להדמיה וכמה תמונות מתוזמנות להדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: מצב ספייק תלת-ממד עם 1RBD פתוח. (A) מפת חלבון ספייק מזוקקת אוטומטית ומשוכללת של 1-RBD למעלה פתוחה מיוצגת בתצוגות צד, עליון ותחתון. (B) מפה EM מצוידת במבנה קריסטל להדמיה טובה יותר של שרשראות הצד. באזורים המסוינים במפה יש צפיפות לשרשראות צדדיות. קיצורים: 3D = תלת מימדי; RBD = תחום איגוד קולטן; EM = מיקרוסקופיית אלקטרונים; NTD = N- תחום מסוף; S1 = subunit 1; S2 = subunit 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: כל ה-RBD מוריד את ההתאמה הקרובה של חלבון ספייק. (A) מפת חלבון ספייק מזוקקת אוטומטית ומשוכללת של כל ה-RBD כלפי מטה, המיוצגת בתצוגות צד ולמעלה. (B) מפה EM מצוידת במבנה קריסטל להדמיה טובה יותר של שרשראות הצד. החצים מראים כי באזורים במפה יש צפיפות עבור שרשראות צד (C). קיצורים: RBD = תחום איגוד קולטן; EM = מיקרוסקופיית אלקטרונים; NTD = N- תחום מסוף; S1 = subunit 1; S2 = subunit 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: GUI של רכישת תמונות Latitude-S: בקרי מיקרוסקופ שונים (למשל, שסתום עמודה פתוח/סגירה, הכנסת מסך /ביטול נשלטים על ידי Latitude-S GUI. שסתום עמודה, מצלמה, מצב מסך ומילוי חנקן נוזלי יכולים להיות נשלטים בלוח השמאלי. בתחתית פאנל זה, פרמטרי כיול שונים נראים ירוקים (למשל, הגדלה, הטיית קרן, מיקוד אובייקטיבי). אם פרמטר כלשהו מופיע שחור, הוא מציין שהפ parameter אינו ממוטב כראוי. לכן, יש למטב את כל הפרמטרים לפני תחילת הפעלה חדשה. קיצור: GUI = ממשק משתמש גרפי. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: ייצוג של מצב אטלס. מצבי אטלס שונים המציגים ריבועי רשת וסוג הקרח שנוצר. (א-ו) גדלי אטלס שונים מודגשים גם הם. (A, B, D, F) תבנית קרח עבה מודגשת. (ג, ד) ריבועים שבורים מסומנים. קרח סמיך ואזורים שבורים (המסומנים באיור) אינם מתאימים להדמיה. (ה, ו) ריבועי רשת טובים להדמיה; A, B, C, D ו- F מציגים את ריבועי הרשת המתאימים להדמיה ברזולוציה גבוהה. עם זאת, ריבועי רשת קרח עבים לריבועי רשת שבורים חייבים להיות מודרים. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A-C), 50 מיקרומטר (D, E) ו- 25 מיקרומטר (F). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: ייצוג של מצב רשת ומצב חור. מצב הרשת ומצב החור המתאים מוצגים בתמונה. (א, ה) חור ריק, (F, G) קרח עבה, (E) זיהום קרח, ו (A, B, C, D, E ו - G) עובי קרח מתאים מסומן בתמונה. חורי עובי קרח מתאימים נבחרים לרכישת התמונה (A, B, C, D, E ו- G). סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר (A, E, F, G), 2 מיקרומטר (B), 50 מיקרומטר (C), 5 מיקרומטר (D). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S4: התייחסות חור להדמיה אוטומטית. תמונת חור (quANTIFOIL-Holey רשת פחמן quANTIFOIL R 1.2/1.3) נלכדת ונשמרת לעיון עתידי. גודל ההפניה לחור יכול להיות מגוון בהתבסס על סוגים שונים של רשתות. מומלץ תמיד ללכוד את הפניית החור לפני תחילת כל הפעלה חדשה. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S5: החלונית לכידת תמונה בהגדלות שונות ובבחירת חורים שונים. (A) לוח הלכידה מציג את ההגדרות לרכישת נתונים. (B) חלון הניווט הראשי של Latitude-S מציג שלוש הגדלות רצופות. במצב אטלס (150x), ריבועי הרשת נבחרים לרכישת נתונים (פאנל שמאלי, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). בהגדלה גבוהה יותר (380x), ריבוע יחיד ממוקד (פאנל אמצעי, סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר). הגדלה גבוהה יותר (4,300x), חורים בתוך כל ריבוע ממוקדים (פאנל ימני, סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר). עם זאת, הגדלות אלה ישתנו בהתאם לגודל ולצורה של הרשתות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S6: יצירת תבנית לבחירת חורים והדמיה. יצירת תבנית מתבצעת על-ידי הוספת מיקום על החור עבור נתונים, והמיקוד ממוקם בסמוך לחור על משטח הפחמן. המוקד צריך למקם על אזור הפחמן, כך קוטר הקרן לא צריך לגעת כל חור סמוך. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר (פאנל שמאלי), 10 מיקרומטר (החלונית האמצעית), 1000 ננומטר (החלונית הימנית). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S7: הדמיית Cryo-EM של SARS-CoV2 באמצעות Latitude-S והקרנת תמונה. (A) הקרנה של מיקרוגרפים שנרכשו: התאמת CTF 1D, התאמת CTF 2D, ופרמטרים CTF; הערכת נתוני חלבון ספייק SARS-CoV2 באמצעות cisTEM. 1D CTF fit וטבעת תון מראה כי האות הכולל הוא 4.8 Å. (B) מיקרוגרפים בשני ערך נטרול שונה של חלבון ספייק נרכשים באמצעות Latitude-S. סרגלי קנה מידה = 50 ננומטר. (ג) ממוצע כיתה 2D סופי. ממוצע המחלקה הדו-יומית מציג תצוגות עליונות, תחתיות וצדדיות של חלבון הספייק. כל הפרטים ברזולוציה גבוהה גלויים בממוצעי המחלקות הדו-פעמיים. קיצורים: cryo-EM = מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית; 1D = חד ממדי; דו-ממדי = דו-ממדי; CTF = פונקציית העברת ניגודיות; SARS-CoV2 = תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S8: עיבוד נתונים של נתוני חלבון ספייק SARS-CoV2 שנרכשו באמצעות תוכנת Latitude-S. התמונה מציגה את זרימת העבודה ואחריה לעיבוד נתוני ה-cryo-EM של חלבון ספייק. סיווג תלת מימדי של חלבון ספייק מתבצע באמצעות Relion 3.0. מחלקה 1 מציגה את ההתאמה הפתוחה של 1-RBD. מחלקה 3 וכיתה-4 מראים את כל RBD למטה התאמה קרובה של חלבון ספייק. מחלקה 5 מראה את הקונפורמציה הבינוני של חלבון ספייק. קיצורים: cryo-EM = מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית; תלת-ממד = תלת מימדי; RBD = תחום איגוד קולטן; SARS-CoV2 = תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S9: תמונה מחולקת במינון שנלכדה כהפניה לרכישת תמונה סופית. תמונות של שבר מינון נלכדות עם חשיפה של 8.0 שניות וחשיפה של 0.2 שניות למסגרת. לחץ על לחצן שמירה אוטומטית ליד המצלמה כדי לשמור את קבצי הסרט באופן אוטומטי. לאחר רכישת התמונה, לחץ על התמונה ושמור את פרמטרי התמונה מחולקים במינון באמצעות לחצן התמונה שעודכנה במצב איסוף הנתונים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S10: התפלגות זוויתית ומתאם מעטפת פורייה של מפת חלבון ספייק הקונפורמציה של SARS-CoV-2 1 שנוצרה. (A) התפלגות זוויתית של הדגם התת-ממדי הסופי של 1-RBD למעלה התאמה פתוחה של חלבון ספייק. כחול מייצג ערכים נמוכים יותר, ואדום מייצג ערכים גבוהים יותר של התפלגות החלקיקים המנורמלת. (B) עקומת מתאם מעטפת פורייה המציגה רזולוציה של 4.4 Å של 1-RBD למעלה התאמה פתוחה של חלבון ספייק, המוערך בחיתוך. קיצורים: 3D = תלת מימדי; RBD = תחום איגוד קולטן; SARS-CoV2 = תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2; FSC = מתאם מעטפת פורייה. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

מצב תמונת אטלס אטלס 115
הגדלה 115, גודל פיקסל 34.7 ננומטר
נטרול מצוין 4.38 מ"מ
גודל ספוט 8
בהירות 934400
מצב הדמיהILM
binning 1
זמן חשיפה 1.0 s
מצב סקר רשת רשת 380
הגדלה 380, גודל פיקסל 11.2 ננומטר
נטרול מצוין 2.37 מ"מ
גודל ספוט 8
בהירות 626200
מצב הדמיהILM
binning 1
זמן חשיפה 1.0 s
מצב סקר חורים חור 3400
הגדלה 3,400, גודל פיקסל 1.20 ננומטר
נטרול מצוין -0.75 מיקרומטר
גודל ספוט 7
קוטר קרן 8.81 מיקרומטר
מצב הדמיהILM, SA, Mh
binning 1
זמן חשיפה 1.0 s
מצב מיקוד פוקוס 45k
הגדלה 45,000, גודל פיקסל 0.0924 ננומטר
נטרול מצוין 4.51 מיקרומטר
גודל ספוט 6
קוטר קרן 0.716 מיקרומטר
מצב הדמיהILM, SA, Mh
binning 1
זמן חשיפה 1.0 s
מצב אקזיזיציה נתונים 45k
הגדלה 45,000, גודל פיקסל 0.0924 ננומטר
כיוונון נטרול מינימום: -4,500 ננומטר, מקסימום: -1,500 ננומטר, שלבים: 250 ננומטר
גודל ספוט 6
קוטר קרן 0.752 מיקרומטר
מצב הדמיהILM,SA,Mh
binning 1
זמן חשיפה סה"כ חשיפה של 8 שניות ל-20 פריימים
הגדרת מצלמה נספר, קבל מנורמל, פגם תוקן
כיוונון שמירת נתונים MRC

טבלה 1: סיכום הגדרת מצב Latitude-S.

מפרט בסיס K2 פסגת K2
מתח הפעלה TEM 200-400 קילו-בתים
אזור פעיל של חיישן 19.2 מ"מ × 18.6 מ"מ
גודל חיישן בפיקסלים 3838 × 3710 7676 × 7420 סופר-
רזולוציה
גודל פיקסל אל פיזי 5 מיקרומטר
binning 1-8x
קריאת חיישן כל אזור שרירותי
הגדלה ביחס לסרט 1.3–1.5x
מהירות קריאה של חיישן 50 fps מלא 400 fps מלא
מהירות העברה למחשב 8 fps מלא 40 fps מלא
תצוגת תמונה 8 fps מלא 10 fps מלא
ביצועי DQE (300 קילו-בתים) >0.30 (שיא) >0.25 ב 0.5 של Nyquist פיזי >0.7 (שיא) >0.50 ב 0.5 של Nyquist פיזי >0.06 ב 1.25 של Nyquist פיזי
תוכנה סוויטת גטן מיקרוסקופיה כוללת מיקרוגרף דיגיטלי

טבלה 2: מפרטי מצלמה.

אפשרות תצורה ערך
סוג מיקרוסקופ טאלוס ארקטיה G2
מתח גבוה 200 קילו-בתים
מקור XFEG
עדשה קריו טווין
מערכת ואקום טאלוס TMP IGP
מטעין לדוגמה טוען אוטומטי

טבלה 3: תצורת מיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Latitude-S הוא ממשק משתמש אינטואיטיבי, המספק סביבה להפעלה ואיסוף אוטומטי של אלפי מיקרוגרפים ברזולוציה גבוהה או קבצי סרטים ביומיים. הוא מספק ניווט קל על פני הרשתות ושומר על המיקום של שלב המיקרוסקופ בזמן שהוא עובר מהגדלה נמוכה להגדלה גבוהה. כל שלב של רכישת נתונים עם Latitude-S הוא חסכוני בזמן, עם תכונות כגון ממשק משתמש פשוט, הזרמה מהירה של נתונים במהירות של עד 4.5 GB/s, ותצוגה סימולטת של נתונים במהלך הרכישה. בנוסף, פרמטרים של פירוק מינון, קצב מינון, מיקוד והגדלה כיול מראש נטענו מחדש בקלות כדי להתחיל הפעלה חדשה של רכישת נתונים אוטומטית ולחסוך זמן.

רכישת נתונים באופן אוטומטי בהיעדר ניטור מתמיד ומבלי להתפשר על איכות ערכת הנתונים היא משימה מאתגרת וגוזלת זמן. איסוף נתונים אוטומטי באמצעות תוכנת Latitude-S נוח כאשר הזמן והמשאבים הם אילוצים עיקריים, במיוחד במהלך מגיפה זו. עם זאת, מספר מבנים cryo-EM של חלבונים שונים של SARS-CoV-2 נפתרו בחודשים האחרונים, אשר יסייעו לחברות תרופות לפתח חיסונים. מעבדות שונות משתמשות בסוגים שונים של חבילות תוכנה אוטומטיות לאיסוף נתונים כדי לאסוף נתונים. השתמשנו Latitude-S עם K2 פסגת DED עבור איסוף נתונים אוטומטי cryo-EM על רשתות פחמן חורי או רשתות מצופות GO תוצרת בית30.

מחקר זה בוצע באמצעות הפרמטרים הנ"ל בסעיף הפרוטוקול, המספק ראיות חזקות כי Latitude-S היא חבילת תוכנה מתאימה ואידיאלית לאיסוף נתונים אוטומטי עבור קריו-EM של חלקיק יחיד. עם זאת, מומלץ מאוד לעקוב אחר פרוטוקולים מסוימים לפני תחילת ההדמיה באמצעות מצלמת K2. מצלמת הזיהוי הישיר K2 דורשת שגרות תחזוקה בסיסיות כדי להשיג את הביצועים הגבוהים ביותר. חישול רגיל של המצלמה ל-50° למשך 24 שעות מסייע לחיישן לבצע בצורה אופטימלית על ידי הפחתת רעשי הרקע והזיהום בגובה פני השטח. עם זאת, לאחר חישול המצלמה, עדכון הרווח והפניות הכהות של המצלמה הוא צעד חובה (לוקח ~ 45 דקות) לפני ביצוע כל רכישת תמונה.

למרות ש-Latitude-S היא חבילת תוכנה יציבה וידידותית למשתמש לאיסוף נתונים אוטומטי של Cryo-EM, חיוני לייעל פרמטרים שונים (הגדלות, גודל ספוט, בהירות וקצב מינון) ב-5 מצבים שונים של Latitude-S בהתחלה. ההגדלה של חורים או מצבי רשת תלויה בגדלים החורים של הרשתות החוריות או סוגי הרשתות החוריות (למשל, R2/2 או R1.2/1.3 או R 0.6/1). לדוגמה, גודל חור הרשת מסוג R0.6/1 הוא 0.6 מיקרומטר, וגודל החור של רשת R2/2 הוא 2 מיקרומטר. לכן, שני סוגים שונים של הגדלה נדרשים לדמיין את החורים כראוי עבור סוגי רשת R0.6/1 ו- R2/2 במצבי הרשת והחור ב- Latitude-S.

לכן, הגדרות ההגדלה עבור סוגים שונים של רשתות ב- 5 מצבים שונים יהיו משתנות. גודל הספוט והבהירות תלויים מאוד בהגדלה. לפיכך, ערכים אלה עשויים להשתנות בערכי הגדלה שונים. לכן, מומלץ לייעל את הפרמטרים השונים של 5 המצבים השונים של Latitude-S באמצעות סוגים שונים של רשתות cryo-EM לפני תחילת רכישת נתונים אוטומטית. עם זאת, לאחר שכל הפרמטרים ממוטבים ונשמרים, קל לטעון מחדש את כל הפרמטרים בהתבסס על דרישת המשתמש ולהשתמש ב- Latitude-S בהגדלות שונות או בסוגי רשת שונים.

יתרון חשוב של שימוש K2 עם Latitude-S הוא כי משתמשים יכולים בקלות לווסת את שסתום הקרן פתוח / לסגור, להכניס / לסגת המצלמה, להכניס / לסגת מסך הזרחן של המיקרוסקופ, ולווסת מילוי חנקן נוזלי באמצעות GUI של Latitude-S. עם זאת, כל אפשרות אחרת (כגון הטיית אקדח, הזזת אקדח, הזזת קרן, נקודות ציר, ריכוז צמצם C2, מרכז סיבוב, יישור ללא תרדמת) אינה נגישה באמצעות לשונית K2 Latitude-S GUI (איור משלים S1 ואיור 2). במהלך השעות הארוכות של איסוף הנתונים, מיקום הקרן עשוי להשתנות.

Latitude-S יכול לבצע בדיקות ותיקונים תקופתיים אוטומטיים כדי לעקוב אחר יציבות המערכת לאורך כל תקופת רכישת הנתונים. יציבות המערכת נשמרת על ידי מיקוד הקרן ועדכון ההפניות הכהות. הבדיקה המתמדת מבטיחה את האיכות הגבוהה של הנתונים שנרכשו. ב- Latitude-S, הגובה האוצנטרי (גובה Z) מתוקן פעם אחת בלבד לפני איסוף הנתונים, והגובה האוצנטרי מחושב באופן אוטומטי על-ידי Latitude-S כאשר הוא משנה את ריבוע הרשת. המוקד נמדד ומותאם באופן אוטומטי בהתבסס על טווח המיקוד המוגדר על-ידי המשתמש. התוכנית תאפס את מיקום שלב Z אם היא חורגת מערך הסף הנתון. יציבות זו נשלטת באמצעות לוח יציבות המערכת. עם זאת, כמו חבילות רכישת נתונים אוטומטיות אחרות, ל- Latitude-S יש גם כמה מגבלות.

ל- Latitude-S אין אפשרות לחשב את הגובה האוצנטרי (גובה Z) אם הרשת אינה אחידה. בתרחיש זה, אין באפשרותו לאסוף נתונים כלשהם, או שערכי ההשבתה יהיו מחוץ לטווח לחלוטין. לכן, משתמשים צריכים להיות זהירים מאוד כדי להכין את הרשתות שלהם ללא כל כיפוף ותמונה רק רשתות משטח שטוח באמצעות Latitude-S. יתר על כן, שלא כמו Leginon, SerialEM ו- UCSF-Image, Latitude-S אינה חבילת תוכנה זמינה באופן חופשי. Latitude-S תואם למצלמות Gatan, כולל מצלמות זיהוי ישירות K2, K3 ו-K3 מבוססות או עצמאיות, כמו גם למצלמות ריו ו-OneView. חיסרון חשוב נוסף עבור משתמשים הוא שזה לא תואם עם DDs פופולריים אחרים כגון Falcon DED. עם זאת, זה נכון גם עבור EPU, עוד חבילת תוכנה אוטומטית לרכישת נתונים, אשר זמין עם מיקרוסקופים הקפאה תואם רק עם מצלמת פלקון. עם זאת, EPU מתפקד גם עם K2/K3 עם מסנן אנרגיה (מסנן הדמיה BioQuantum K3) אך לא עם מצלמת K2/K3 עצמאית.

Latitude-S דומה למדי ל- EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation ו- Leginon, שהן חבילות תוכנה המשמשות לרכישת נתונים אוטומטית עבור cryo-EM של חלקיק יחיד. עם זאת, Latitude-S תואם רק למסנן הדמיה K2 DED, K3 DED או BioQuantum K3. בנוסף, תמיכה טכנית רציפה מסופקת על ידי החברה עבור משתמשי Latitude-S. תמיכה טכנית זו מועילה לקבוצות משתמשים קטנות, שצריכות להשתמש בהתקני מסנן ההדמיה K2 DED, K3 DED או BioQuantum K3 לרכישת נתונים ואין להן ידע מוקדם כיצד להגדיר או להשתמש בחבילות תוכנה חופשית כגון SerialEM ו- Leginon.

ישנן תכונות רבות אחרות, כגון עקיפה אלקטרונית מיקרוקריסטלית (microED), טומוגרפיה, ספקטרומטריית רנטגן מפוזרת אנרגיה (EDS), אשר זמינים בגרסאות שונות אחרות של Latitude. לכן, משתמשים יכולים להשתמש באותה חבילת תוכנה לאיסוף נתונים במצבים אחרים. למיטב ידיעתנו, איסוף נתונים עבור microED, טומוגרפיה ו- EDS אינו זמין ב- EPU או בחבילות תוכנה אחרות. לכן, חבילת תוכנה זו Latitude יכול להיות שימושי למטרות שונות בנוסף לרכישת נתונים אוטומטית cryoEM חלקיק יחיד. עם זאת, SerialEM ו Leginon, שניהם חבילות תוכנה חופשית, מתאימים למצלמות פלקון או K2 / K3 והם שימושיים מאוד עבור משתמשים חדשים. עם זאת, Latitude-S אינו זמין באופן חופשי, מה שעשוי להיות חיסרון של חבילת תוכנה זו.

לסיכום, הכלי לרכישת נתונים אוטומטית של Latitude-S טוב כמו חבילות תוכנה אחרות לרכישת נתונים אוטומטיות (למשל, EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image). Latitude-S היא חבילת תוכנה יציבה וידידותית מאוד לרכישת נתונים, הזמינה עם מצלמות זיהוי ישירות K2, K3 ו- K3 מבוססות או עצמאיות, כמו גם מצלמות זיהוי ישיר של Rio ו- OneView.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים מתחרים או פיננסיים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

אנו מכירים במחלקה לביוטכנולוגיה, המחלקה למדע וטכנולוגיה (DST) ומדע, והמשרד לפיתוח משאבי אנוש (MHRD), הודו, למימון ומתקן ה- cryo-EM ב- IISc-Bangalore. אנו מכירים בתוכנית בונה DBT (BT/INF/22/SP22844/2017) ו-DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) עבור מתקן הקריו-EM הלאומי ב- IISc, בנגלור. אנו מכירים בתמיכה כספית של המועצה לחקר המדע וההנדסה (SERB) (מענק מס'-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 ו-SERB-IPA/2020/000094), DBT (מענק מס'. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). אנו מודים לגברת אישיקה פרמניק על הכנת רשתות קריו-EM, איסוף נתונים של cryo-EM והכנת טבלת החומרים. אנו מודים גם למר סומאן מישרה על עיבוד התמונה cryo-EM ועל שעזר לנו להכין את הדמויות. אנו מודים לפרופ' רגהאבן ורדרג'אן על שעזר לנו להשיג את דגימת חלבון הספייק המטוהרת עבור מחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blotting paper Ted Pella, INC. 47000-100 EM specimen preparation item
Capsule Thermo Fisher Scientific 9432 909 97591 EM specimen preparation unit
Cassette Thermo Fisher Scientific 1020863 EM specimen preparation unit
C-Clip Thermo Fisher Scientific 1036171 EM specimen preparation item
C-Clip Insertion Tool Thermo Fisher Scientific 9432 909 97571 EM specimen preparation tool
C-Clip Ring Thermo Fisher Scientific 1036173 EM specimen preparation item
EM grid (Quantifoil) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge Machine Quorum N/A Quorum GlowQube glow discharge machine
K2 DED Gatan Inc. N/A Cryo-EM data collection device (Camera)
Latitude S Software Gatan Inc. Imaging software
Loading station Thermo Fisher Scientific 1130698 EM specimen preparation unit
Talos 200 kV Arctica Thermo Scientific™ N/A Cryo-Electron Microscope
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A EM specimen preparation unit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 173 קריו-EM קו רוחב-S ניתוח חלקיקים יחיד SARS-CoV-2 חלבון ספייק טאלוס ארקטיה
ידידותית למשתמש, תפוקה גבוהה ותוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, A., P., S., Gulati, S.,… More

Kumar, A., P., S., Gulati, S., Dutta, S. User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62832, doi:10.3791/62832 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter