Summary
단일 입자 냉동 전자 현미경 검사법은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지 및 사용자 친화적인 파이프라인을 요구합니다. 여기서는 완전 자동화된 이미지 수집 소프트웨어 패키지인 Latitude-S의 적용과 저용량 조건에서 유리화된 생체 분자의 데이터 수집을 위한 실용적인 파이프라인을 소개합니다.
Abstract
지난 몇 년 동안 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법 (cryo-EM)의 기술적 및 방법론적 발전은 생물학적 거대 분자의 고해상도 구조 측정을위한 새로운 길을 열었습니다. 저저온-EM의 놀라운 발전에도 불구하고 단일 입자 분석 워크플로우의 다양한 측면에서 여전히 개선범위가 남아 있습니다. 단일 입자 분석은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지를 요구합니다. 지난 8년 동안 단일 입자 저저온-EM용 자동 이미징을 위해 여러 개의 자동 데이터 수집 소프트웨어 패키지가 개발되었습니다. 이 논문은 저용량 조건하에서 생체 분자를 생체화하기 위한 완전 자동화된 이미지 수집 파이프라인의 적용을 제시합니다.
cryo-EM 데이터를 완전하고 자동으로 정확하게 수집할 수 있는 소프트웨어 패키지를 보여 줍니다. 또한 이 소프트웨어 패키지에 의해 다양한 미세 한 매개 변수를 쉽게 제어 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 직접 전자 검출기 (DED)가 장착 된 200 keV 극저온 전자 현미경을 갖춘 중증 급성 호흡기 증후군 -코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 자동화 된 이미징에서이 소프트웨어 패키지의 잠재력을 보여줍니다. 약 3,000개의 극저온-EM 영화 이미지가 단일 세션(48h)의 데이터 수집에서 획득되어 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 원자 분해능 구조를 산출했습니다. 더욱이, 이러한 구조 연구는 스파이크 단백질이 두 가지 주요 적합성, 1-RBD(수용체 결합 도메인)를 열어 놓고 모든 RBD를 폐쇄된 적합성을 채택한다는 것을 나타낸다.
Introduction
단일 입자 저온 -EM은 생물학적 거대 분자1의 고해상도 구조 측정을위한 주류 구조 생물학 기술이되었다. 단일 입자 재구성은 생물학적 거대 분자2,3의 3차원 (3D) 구조를 재구성하는 데 사용되는 2차원 (2D) 입자 이미지를 추출하기 위해 유리화 된 샘플의 광대 한 수의 현미경 그래프를 획득하는 데 달려 있습니다. DED를 개발하기 전에 단일 입자 재구성에서 달성된 해상도는 4에서 30 Å4,5 사이로 다양했습니다. 최근에는 단일 입자 저온-EM의 달성 가능한 해상도가 1.8 Å6을 넘어왔습니다. DED 및 자동화된 데이터 수집 소프트웨어는 데이터 수집에 대한 인간의 개입이 최소화된 이 해상도 revolution7에 주요 기여를 했습니다. 일반적으로, 저온-EM 이미징은 저전자 용량 율(20-100 e/Å2)에서 수행되어 생물학적 샘플의 전자 빔 유도 방사선 손상을 최소화하며, 이는 이미지내 낮은 신호 대 잡음 비(SNR)에 기여한다. 이 낮은 SNR은 단일 입자 분석을 사용하여 생물학적 거대 분자의 고해상도 구조의 특성화를 방해합니다.
차세대 전자 검출기는 CMOS(상보금속-산화물-반도체) 기반 검출기로, 이러한 낮은 SNR 관련 장애물을 극복할 수 있습니다. 이러한 직접 감지 CMOS 카메라는 카메라가 생물학적 거대 분자에 대한 더 나은 포인트 확산 기능, 적합한 SNR 및 우수한 탐정 양자 효율(DQE)에 기여하기 때문에 신호를 빠르게 판독할 수 있습니다. 직접 감지 카메라는 기록된 이미지에서 높은 SNR8 및 낮은 노이즈를 제공하므로 검출기가 이미지에 추가되는 소음의 양을 측정하는 DQE(형사 양자 효율)의 정량적 증가가 발생합니다. 이 카메라는 초당 수백 프레임의 속도로 영화를 기록하여 빠른 데이터 수집9,10을 가능하게 합니다. 이러한 모든 특성은 빠른 직접 감지 카메라를 저용량 응용 분야에 적합하게 만듭니다.
동작 보정 스택 이미지는 RELION11, FREALIGN12, 극저온SPARC13, 시스템14 및 EMAN215와 같은 다양한 소프트웨어 패키지를 사용하여 2D 분류를 계산하고 거대 분자의 3D 밀도 맵을 재구성하는 데 데이터 처리에 사용됩니다. 그러나 단일 입자 해석의 경우 고해상도 구조를 달성하기 위해서는 엄청난 데이터 집합이 필요합니다. 따라서 자동 데이터 수집 통행료는 데이터 수집에 매우 필수적입니다. 대규모 cryo-EM 데이터 세트를 기록하기 위해 지난 10년 동안 여러 소프트웨어 패키지가 사용되었습니다. AutoEM16, AutoEMation17, 레기논18, 시리얼EM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS 및 EPU와 같은 전용 소프트웨어 패키지가 자동화된 데이터 수집을 위해 개발되었습니다.
이 소프트웨어 패키지는 저배율 이미지를 고배율 이미지와 상호 연결하여 자동으로 구멍 위치를 찾기 위해 일상적인 작업을 사용하여 저용량 조건에서 이미지 수집을 위한 유리체 얼음 두께의 구멍을 식별하는 데 도움을 주습니다. 이러한 소프트웨어 패키지는 작업자의 중단 및 물리적 존재 없이 며칠 동안 엄청난 양의 양질의 데이터를 지속적으로 수집하여 반복적인 작업 수를 줄이고 cryo-EM 데이터 수집의 처리량을 증가시켰습니다. Latitude-S는 단일 입자 분석을 위해 자동 데이터 수집에 사용되는 유사한 소프트웨어 패키지입니다. 그러나 이 소프트웨어 패키지는 K2/K3 DED에만 적합하며 이러한 검출기와 함께 제공됩니다.
이 프로토콜은 200 keV 극저온-EM을 장착한 직접 전자 검출기로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 자동화된 이미지 획득에서 위도-S의 잠재력을 보여줍니다( 재료표 참조). 이 데이터 수집 도구를 사용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 3,000개의 영화 파일이 자동으로 획득되고, 추가 데이터 처리는 3.9-4.4 Å 해상도 스파이크 단백질 구조를 얻기 위해 수행됩니다.
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Protocol
참고: 저저온-EM 데이터 수집에는 3가지 중요한 단계가 필요합니다: 1. cryo-EM 그리드 준비, 현미경의 2. 교정 및 정렬, 3. 자동 데이터 수집(그림 1). 또한 자동화된 데이터 수집은 적절한 영역 선택, b. 위도-S 최적화, c. 자동 구멍 선택 시작 및 d. 자동 데이터 수집(그림 1)으로 세분화됩니다.
1. 자동 데이터 수집을 위한 Cryo-EM 그리드 준비 및 샘플 로딩
- 광선 방전기로 그리드를 청소하고 실험 요구 사항에 따라 광선 배출 매개 변수를 다릅니다 (여기, 20 mA에서 60 s).
- 새로 준비된 단백질 샘플(3μL)을 광발 배출 그리드에 넣고 10s의 배양합니다.
- 100% 습도에서 3-5s의 그리드를 블롯하고 저온 플런저를 사용하여 액체 에탄으로 빠르게 뛰어들수 있습니다.
- 그리드를 클립 링에 수동으로 고정하여 유연한 C-클립 링을 사용하여 카트리지를 형성합니다.
- 냉동 카트리지 장착 그리드를 오토로더 카세트에 로드하고 나노 캡으로 카세트를 데이터 수집을 위해 현미경의 미리 냉각된 오토로더로 전송합니다.
2. 자동 데이터 수집 전에 현미경 튜닝 및 기본 정렬
- 빔 시프트
- 직접 정렬 탭에서 빔 이동을 클릭합니다.
- 배율을 줄이고 다 기능 X 및 Y 노브를 사용하여 빔을 광학 축으로 중앙에 연결합니다.
- 피벗 점 정렬
- 직접 정렬 탭에서 직접 정렬 pp X에서 빔 기울기 옵션을 클릭합니다.
- 다 기능 X 및 Y 노브를 사용하여 빔을 한 자리에 응축하고 움직임을 최소화합니다.
- C2 조리개 중심
- 정렬 탭에서 응축기 조리개를 선택합니다.
- 빔을 스팟으로 응축한 다음 빔을 광학 축으로 중앙으로 한 다음 빔을 확장하여 원을 균일하게 덮습니다.
- 콘덴서 2 조리개가 조정될 때까지 다음 단계를 반복합니다.
- 혼수 없는 정렬
- 직접 정렬 탭에서 혼수 없는 정렬 X를 클릭하여 빔을 광학 축에 정렬합니다.
- 다기능 노브를 사용하여 FFT의 모양과 움직임을 최소화합니다(안정적).
- 코마에 대해 동일한 절차를 반복 하십시오 - 무료 정렬 Y.
- C 트윈 렌즈로 인해 극저온-EM에서 데이터 수집 전에 병렬 조명을 설정합니다.
- 회절 모드에서 목표 조리개(70 μm)를 삽입합니다.
- 디포커스 강도 노브(객관적인 렌즈 및 C2 렌즈 전류)를 제어하여 회절 렌즈의 전면 초점 평면에 목표 조리개를 집중시합니다.
- 적절한 디포커싱 후 목표 조리개가장자리가 선명한지 확인합니다.
- 빔 스토퍼를 삽입하고 금 분말 회절 링이 최소화 될 때까지 강도를 확산.
참고: 빔이 제대로 퍼지면 화면에 금 분말의 명확한 회절 링이 표시되어 빔이 평행하다는 것을 나타냅니다. - 평행 조명을 설정한 후 빔 스토퍼를 철회하고 현미경 모드를 나노 프로브로 변경합니다.
참고: 현미경의 최적의 성능을 보장하기 위해 데이터 수집을 시작하기 전에 현미경 튜닝을 확인하십시오. 이러한 모든 설정은 현미경 직접 정렬 GUI 탭에서 수행됩니다. 모든 현미경 튜닝은 데이터 수집 전에 테스트 그리드를 사용하여 수행됩니다.
3. 위도-S를 가진 데이터 수집
- Latitude-S 자동화된 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다.
참고: 위도-S 설치에는 데이터 수집 전에 수행될 현미경 보정이 필요하며 설정은 영구적으로 저장됩니다. 데이터 수집을 위한 5개의 다른 상태는 네 가지 배율로 보정됩니다(그림 1 및 그림 2). 아틀라스 상태 및 그리드 상태는 LM 모드(낮은 배율 범위)에서 두 가지 배율에 있습니다. 구멍 상태는 SA 모드(고배율 범위)에 있지만 적당한 배율입니다. 초점 및 데이터 상태는 높은 배율 SA 모드를 사용합니다.- 시작 메뉴에서 디지털 현미경을 클릭하거나 바탕 화면의 DigitalMicrograph 아이콘을 두 번 클릭합니다.
- DigitalMicrograph에서 기술 관리자 아이콘을 선택합니다.
참고: 이 시스템에는 TEM 및 위도-S 아이콘이 표시됩니다(그림 2 및 보충 그림 S1). - 단일 파티클 자동화 된 데이터 수집을 위해 위도-S 아이콘을 선택합니다.
참고: K2 카메라는 선형/통합, 카운트 및 슈퍼 해상도의 세 가지 모드로 작동합니다. 사용자는 DigitalMicrograph 인터페이스에서 모든 모드를 선택할 수 있습니다. 데이터 이미지는 용량 분별 이미지 스택 또는 MRC, TIF 또는 비트 깊이가 다른 .dm4 파일의 합산 이미지로 저장할 수 있습니다. 또한 데이터를 K3 카메라의 모션 보정 이미지로 저장할 수 있습니다. K2 카메라에서는 처리되지 않은 이미지 스택을 4비트 MRC, 8비트 TIF 또는 8비트 .dm4 파일로 저장할 수 있습니다.
- 이전 세션의 설정을 기반으로 새 세션을 만듭니다.
- 팔레트에서 이전 세션 확인란을 선택 합니다.
- 새 단추를 선택합니다.
- 새 세션의 설정이 기반이 되는 세션이 포함된 폴더를 선택합니다. 이전 세션 디렉터리로 이동하여 새 세션을 만듭니다. 새 세션 및 관련 데이터를 저장하려면 폴더를 선택합니다.
- 새 세션 및 관련 데이터가 저장되는 폴더를 선택하고 선택합니다.
참고: 각 상태 및 기본 설정(배율, 조명 조건, 이미지 또는 프로젝터) 및 빔 시프트 및 카메라 매개 변수(총 노출, 단일 프레임 노출 및 비닝)가 기존 세션에서 새 세션으로 내보됩니다. 폴더의 경로는 팔레트 하단의 텍스트 문자열로 표시됩니다. 각 상태 및 구성 팔레트에는 이미 설정되어 있고 사용할 준비가 되었음을 표시하기 위해 제목에 별표(*)가 추가되었습니다.
- 기존 세션을 계속합니다.
- 팔레트의 계속 버튼을 눌러 기존 세션을 계속합니다.
참고: 아틀라스 몽타주를 수정할 수 없습니다. - 계속해야 하는 세션이 포함된 폴더를 선택하고 탐색합니다.
- 팔레트의 계속 버튼을 눌러 기존 세션을 계속합니다.
- 완전히 새 세션을 시작합니다.
- 팔레트의 새 탭 을 클릭합니다. 계속할 세션이 포함된 폴더를 선택합니다. 데이터를 저장하려면 폴더를 선택합니다.
참고: 기본 폴더 이름은 날짜와 시간을 사용하여 빌드됩니다. - 설정 아이콘을 클릭합니다. 상태 관리 탐색 상자에서 나타나는 상태 탐색 상자에서 상태를 추가하고, TEM 상태, 카메라 상태 및 이미지/스택을 설정한 다음 상태를 지정합니다.
참고: 자동화된 데이터 수집 워크플로우는 자동화된 데이터 수집을 위해 5개의 다른 상태를 사용합니다. 이러한 상태는 각각의 상태 팔레트에 구성되고 저장됩니다. 상태 요약은 표 1에 제공됩니다.
- 팔레트의 새 탭 을 클릭합니다. 계속할 세션이 포함된 폴더를 선택합니다. 데이터를 저장하려면 폴더를 선택합니다.
- 아틀라스 상태를 구성합니다.
- 아틀라스 상태 팔레트를 클릭합니다.
- 나노 프로브의 배율 115x LM 모드, 조명 조건-스팟 크기 8 및 밝기 934400, 비닝: 1 및 카메라 노출 시간: 1.0s 낮은 배율에서 이미징을 위한 1.0s: 다음 매개 변수로 아틀라스 상태를 구성한다. 표 1에 제공된 상태 요약을 참조하십시오.
- 다음 상태를 클릭합니다.
참고: 아틀라스 상태는 전체 그리드(보충 도서 S2)에 대한 조사를 제공하는 가장 낮은 배율 상태입니다. 일반적으로 이 상태는 전체 그리드를 낮은 배율로 시각화하고 그리드의 얼음 두께, 평탄도 및 깨진 사각형을 판단하는 데 도움이 됩니다. 그리드의 최적의 얼음 두께와 최적이 아닌 얼음 두께(보충 도도 S3)를 관찰하기 위해 그리드의 여러 영역에서 아틀라스를 생성하는 것이 좋습니다. 언급된 매개 변수는 사용자의 필요에 따라 달라질 수 있습니다.
- 그리드 상태를 구성합니다.
- 그리드 상태 팔레트를 클릭합니다.
- 다음 현미경 이미징 광학(나노 프로브의 배율 380x LM 모드), 조명 조건(스팟 크기: 8 및 밝기 626,200), 비닝: 1 및 카메라 노출 시간: 1.0s로 그리드 상태를 구성합니다.
- 표 1에 제공된 위도-S 상태 요약을 참조하십시오.
- 다음 상태를 클릭합니다.
참고: 그리드 상태는 아틀라스 상태보다 높은 배율로 설정되어 뷰 필드가 하나의 그리드 사각형(그림 2)입니다. 이 특정 배율에서 하나의 그리드 사각형이 관찰됩니다. 따라서 구멍은 이 배율에서 올바르게 관찰되며, 이는 구멍의 얼음 두께를 확인하는 데 도움이 됩니다(보충 도S4). 간단한 밴드패스 필터가 그리드 상태에서 특허 그리드의 구멍을 찾는 데 사용됩니다. 언급된 매개 변수는 사용자의 필요에 따라 달라질 수 있습니다.
- 구멍 상태를 구성합니다.
- 구멍 팔레트를 클릭합니다.
- 이미징 광학(나노 프로브의 배율 4500x SM 모드), 조명 조건(스팟 크기: 7 및 빔 직경 8.81 μm), 비닝: 1 및 카메라 노출 시간: 1.0s: 다음 현미경 설정으로 구멍 상태를 구성합니다.
- 그리드 유형에 따라 필요한 경우 매개 변수를 변경합니다. 표 1에 제공된 상태 요약을 참조하십시오.
- 다음 상태를 클릭합니다.
참고: SA 모드는 전자 현미경의 높은 배율 범위를 나타냅니다. 구멍 상태는 몇 마이크로미터(10-20 μm)의 시야를 가진 SA 배율 범위에 있다(도 2 및 보충 도서 S4). 이 배율 범위는 아틀라스 또는 그리드 상태보다 높지만 포커스/데이터 상태보다 훨씬 작습니다. 이 배율에서 개별 구멍이 표시됩니다. 구멍 크기는 높은 수준의 오염, 빈 구멍 및 구멍의 적절한 얼음 두께를 관찰하는 것이 적절합니다. 이미징을 위한 구멍은 이러한 가정에 따라 선택됩니다. 구멍 상태에서는 구멍 참조 이미지와 구멍 참조 이미지를 상호 연관시키는 필터와 스테이지 높이를 유중심 높이로 조정하는 두 개의 필터가 사용됩니다.
- 포커스 상태를 구성합니다.
- 포커스 팔레트를 클릭합니다.
- 이미징 광학(나노 프로브의 배율 45,000x SA 모드), 조명 조건(스팟 크기: 8 및 밝기 934400), 비닝: 1 및 카메라 노출 시간: 1.0s: 다음 현미경 설정으로 초점 상태를 구성합니다.
- 구멍 근처의 비정질 탄소 영역에 집중하십시오. 표 1에 제공된 위도-S 상태 요약을 참조하십시오.
- 다음 상태를 클릭합니다.
참고: SA 모드는 전자 현미경의 높은 배율 범위를 나타냅니다. 포커스 상태는 SA 범위 배율이 높습니다. 포커스 모드에서 빔은 대상 구멍의 인근 탄소 영역으로 이동하고 자동으로 포커스를 수행하여 데이터 상태의 데이터를 수집합니다. 해닝 또는 소프트 직사각형 필터와 결합된 밴드패스 필터는 포커스 상태에서 동일한 영역의 두 초점 상태 이미지 사이의 오프셋을 측정하는 데 사용됩니다(그림 2). 언급된 매개 변수는 사용자의 필요에 따라 달라질 수 있습니다.
- 데이터 상태를 구성합니다.
- 데이터 팔레트를 클릭합니다.
- 이미징 광학(예: 나노 프로브의 SA 모드에서 28,000배, 45,000배, 54,000배), 조명 조건(스팟 크기: 8 및 밝기 934400), 비닝: 1 및 카메라 노출 시간: 1.0s.
- 표 1에 제공된 위도-S 상태 요약을 참조하십시오.
- 다음 상태를 클릭합니다.
참고: 데이터 상태는 픽셀 크기 요구 사항 및 대상 해상도에 따라 가장 높은 배율입니다(그림 2). 일반적으로 초점을 맞춘 후 빔이 자동으로 대상 영역으로 이동하여 데이터를 수집합니다. 위에서 언급한 매개 변수는 사용자의 요구 사항에 따라 변경될 수 있습니다.
4. 포커스 구성
- 포커스 구성 팔레트를 클릭합니다. 지정된 탭의 디포커스 값 범위와 단계 크기를 지정합니다.
- 다음 버튼을 눌러 다음 단계로 이동합니다.
참고: 낮은 디포커스 값을 고해상도 데이터 수집에 사용할 수 있습니다. 일반적으로 -0.5 ~ -3.0 μm 디포커스 값은 0.25 또는 0.5 디포커스 단계 크기로 이미지 수집에 사용됩니다. 사용자는 샘플만 화면을 하려는 경우 포커스 설정 단계를 건너뛸 수 있습니다. 팔레트의 다음 버튼을 눌러 포커스 구성 단계를 건너뜁니다.
5. 미세 정렬
- 그리드의 일부 기능(예: 얼음 오염 육각형 얼음)에 집중하십시오. 그림 3을 참조하십시오.
참고: 기능이 너무 크거나 너무 작아서는 안 됩니다. 아틀라스 상태 배율 115배(LA 모드) 및 데이터 배율 모두에서 볼 수 있어야 합니다. - 캡처 버튼을 클릭합니다. 다른 상태의 각 이미지에 동일한 피쳐에 빨간색 크로스 마크를 배치합니다.
- 시야가 아틀라스 및 그리드 상태보다 훨씬 크기 때문에 초점, 데이터 및 구멍 상태로 시작합니다. 아틀라스 및 그리드 상태를 확대하여 아틀라스 및 그리드 상태의 동일한 피쳐에 빨간색 크로스 마크를 배치합니다.
- 계산 버튼을 클릭하여 각 상태 간의 간격띄우기를 계산하고 출력 창에 반영하는 5개의 서로 다른 상태의 위치를 계산합니다.
참고: 오프셋 값은 추가 사용을 위해 상태에 통합됩니다(그림 3). 미세 정렬은 각 상태의 위치의 높은 정확도를 제공하기 위해 수행된다 (도 3). 이 미세 정렬은 모든 5개 주에서 정확한 위치를 정확히 파악하는 데 도움이 됩니다. 미세 정렬 은 단일 파티클 데이터 수집에 매우 중요합니다. 따라서 이미징 전에 미세 정렬을 수행하는 것이 좋습니다.
6. 위도-S를 이용한 데이터 수집 절차
- 캡처 팔레트를 클릭합니다.
참고: 일반적으로 아틀라스 데이터는 대부분의 그리드 사각형을 시각화하기 위해 낮은 배율(115배)에서 수집됩니다. - 아틀라스의 크기를 선택하여 요구 사항(예: 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 6 x 6, 12 x 8 또는 8 x 12)에 따라 그리드의 전체 그리드 또는 일부를 덮습니다.
참고: 16 by 16 아틀라스 크기는 전체 그리드를 다룹니다. - 캡처 버튼을 클릭하여 아틀라스를 캡처합니다.
참고: 주요 위도-S 탐색 창이 열리고 DigitalMicrograph(추가 그림 S5)에서 사용 가능한 공간을 채웁니다. 메인 탐색 창에 있는 세 개의 그림 창은 세 가지 배율로 시스템 상태의 이미지를 표시합니다. 전체 아틀라스는 현재 현재 가장 왼쪽 창에 인수 상태에 표시됩니다. 각 캡처가 발생할 때 아틀라스의 타일이 채워집니다. - 아틀라스(보충 도면 S5)를 탐색하여 얼음 두께를 기준으로 그리드 사각형을 선택합니다. 원하는 그리드 사각형을 선택하면 일정 단추를 클릭하고 각 그리드 사각형이 캡처될 때 그리드 사각형 채우기의 타일을 관찰합니다.
- 그리드 사각형을 선택하면 일정 단추를 클릭합니다.
- 위치를 추가하여 그리드 사각형의 대표 구멍을 선택합니다. 구멍 이미지를 획득하면 데이터 및 포커스 위치를 정의하고 레이아웃을 템플릿(보충 그림 S6)으로 저장합니다.
- 자동 찾기를 클릭하고 구멍 크기(예: R1.2/1.3)를 주고 프로그램의 찾기 버튼을 클릭하면 찾기 프로그램이 구멍 직경에 따라 구멍을 자동으로 찾게 됩니다. 다음으로 마크 버튼을 클릭하여 템플릿(그림 4)을 추가하고 한 그리드 또는 부분 그리드 정사각형의 모든 구멍에 빨간색 원 마크를 추가합니다.
- 그리드 정사각형 및 얼음 오염에서 구멍을 제거하기 위해 강도를 설정합니다(그림 4).
참고: 마지막으로 선택한 구멍은 데이터 수집 일정을 잡기 위해 노란색으로 표시됩니다. - 자동 찾기를 통해 구멍을 추가한 후 위도 작업의 일정 버튼을 클릭합니다.
참고: 자동화된 데이터 수집을 예약하기 전에 액체 질소 탱크 레벨이 충분하고 오토로더 터보 펌프가 꺼져 있고 RAID 드라이브 공간이 없는지 확인합니다. Latitude-S 작업 관리자는 데이터 수집에 예약된 아틀라스, 그리드 사각형, 구멍 및 데이터 상태의 수를 표시합니다(그림 5). 위도-S GUI에서는 다양한 색 구성표가 표시되고 다른 색 구성표의 의미가 표시됩니다: 1. 노란색은 예정되지 않음을 나타냅니다. 2. 녹색은 예약된 것을 나타냅니다. 3. 파란색은 획득을 나타냅니다. 4. 빨간색은 실패했음을 나타냅니다.
7. Cryo-EM 데이터 처리
참고: 스파이크 단백질의 Cryo-EM 이미지 프로세싱은 최근 문헌25에서 자세히 설명된다.
- RELION 3.011을 사용하여 SARS-CoV2의 스파이크 단백질의 이미지 처리를 수행합니다.
- Latitude-S를 사용하여 수집된 동영상 이미지를 수동으로 상영하고 MotionCor2 소프트웨어를 사용하여 개별 영화의 빔 유도 모션 보정을 수행합니다9. cisTEM 소프트웨어 package14의 도움으로 모션 보정 된 현미경 그래프의 초기 검사를 수동으로 수행하십시오.
참고: 자동으로 획득한 현미경 사진의 거의 85%는 품질이 양호했으며, 데이터는 cisTEM software14 (보충 도면 S7A, B)를 사용하여 계산되는 3.7-5.2 Å 내에 신호가 있었습니다. - RELION 3.0 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터를 처리합니다11.
- 스파이크 입자를 수동으로 선택하고 2D 클래스 분류(추가 도면 S7C)로 분류합니다. 최고의 2D 클래스를 참조로 사용하여 RELION 자동 선택 도구를 사용하여 마이크로그래프에서 3,99,842개의 단일 스파이크 입자를 자동 선택합니다.
참고: 입자를 3D 분류(보충 도 S8)로 적용하기 전에 3개의 2D 분류가 수행되었다. 약 2,55,982개의 단일 입자가 3D 분류를 위해 선택되었고, 데이터 세트는 6개의 클래스로 분류되었다. 최종 3D 자동 정제는 최고의 클래스로 수행되었습니다. 85,227개의 스파이크 입자는 3D 분류로부터 수득되었다. - 자동 정제 후 분해능 개선을 위해 적절한 빔 기울기 매개변수로 파티클 디포커스 미세 조정을 수행합니다. 다음으로, 리온 3.0 소프트웨어 패키지를 사용하여 입자를 베이지안 연마에 적용한다11. 마지막으로, 리온 3.011을 사용하여 연마된 파티클 세트를 사용하여 3D 자동 정제의 또 다른 라운드에 사용하십시오.
- 스파이크 입자를 수동으로 선택하고 2D 클래스 분류(추가 도면 S7C)로 분류합니다. 최고의 2D 클래스를 참조로 사용하여 RELION 자동 선택 도구를 사용하여 마이크로그래프에서 3,99,842개의 단일 스파이크 입자를 자동 선택합니다.
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Representative Results
현재 전염병 상황에서, 극저온-EM은 SARS-CoV-226,27,28,29로부터 다양한 단백질의 구조를 특성화하는 데 중요한 역할을 하며, 이는 바이러스에 대한 백신 및 약물을 개발하는 데 도움이 될 수 있다. 2019년 코로나바이러스 질병에 대처하기 위해 제한된 인적 자원을 갖춘 신속한 연구 노력이 절실히 필요합니다. 단일 입자 저온-EM의 데이터 수집은 거대 분자의 구조 결정에 시간이 많이 걸리지만 중요한 단계입니다. Cryo-EM 자동 데이터 수집의 최근 개발은 데이터 수집에 제한된 인간의 간섭을 가능하게했다. Latitude-S 소프트웨어는 정제된 SARS-CoV2 스파이크 단백질의 자동화된 데이터 수집에 사용되는 중요한 자동 데이터 수집 소프트웨어 패키지입니다.
SarS-CoV-2 스파이크 단백질의 Cryo-EM 데이터 수집은 K2 서밋 DED를 탑재한 200keV 극저온-EM으로 수행되었다. 바람직한 얼음 두께와 입자 분포가 있는 그리드의 데이터 수집 위치는 수동으로 표시되었습니다. 백그라운드에서 발생하는 데이터 수집 중에 위치가 병렬로 표시되었습니다. 표시된 위치에서 Latitude-S 소프트웨어는 표본 수준에서 1.17 Å의 픽셀 크기로 42,200배의 명목 배율로 자동화된 데이터 수집을 수행했습니다. 42,200배율의 데이터 수집 구성은 이미 미리 설정되어 테스트되었습니다. 총 40 프레임은 프레임 당 2 e--/Å2 의 전자 용량으로 8 s에 대해 기록되었습니다. 따라서, 80 e--/Å2 의 총 용량은 데이터 수집에 사용되었다 (보충 그림 S9). 이 데이터는 -0.75 μm 및 -2.25 μm의 디포커스 범위에서 수집되었으며, 2일 동안 3,000개의 영화 파일이 수집되었습니다. 4시간마다 정기 점검과 조정을 통해 48h 이상 수집된 모든 동영상 파일이 품질이 좋고 빔 시프트 또는 정렬 변화가 없도록 했습니다. 데이터는 인간의 개입없이 독립적으로 수집되었습니다. 또한, 위도-S는 액체 질소 충전 시 이미징을 자동으로 중지하여 이미지에서 불필요한 진동이나 기계적 드리프트를 줄입니다.
프로토콜 섹션에서 언급했듯이, 모션 보정 된 현미경 사진의 초기 스크리닝은 cisTEM software14를 사용하여 수동으로 수행되었습니다. 스크리닝에 기초하여, 대부분의 데이터는 3.7-5.2Å(보충 도서 S7A)의 신호 범위 내에 있는 것으로 나타났다. 이는 Latitude-S를 사용하는 자동 데이터 수집이 양호하며 대부분의 데이터가 고해상도 3D 재구성에 적합하다는 것을 시사합니다. 또한, 이미지는 디포커스 범위(-0.75 ~ -2.25 μm)에서 수집되었으며, 다양한 디포커스 범위는 cisTEM14에 의해 수동으로 검사되었다. 획득된 데이터는 위도-S(보충 도면 S7A, B)의 설정 디포커스 범위에 매우 가까웠습니다.
RELION 3.0 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터 처리를 수행하였습니다11. 스파이크 입자는 2D 클래스 평균을 계산하기 위해 수동으로 선택되었습니다. 다양한 구조적 세부 사항(나선 및 β 시트)은 2D 클래스 평균(보충 도 S7C)에서 볼 수 있으며, 이는 이 데이터 세트를 사용하여 고해상도 구조 특성화가 가능하다는 것을 강력하게 시사합니다. 그러나, 3D 분류는 또한 스파이크 단백질이 1 수용체 결합 도메인 (RBD)을 가지고 있음을 나타내며 모든 RBD는 닫기 변형 (보충 도S8)을 아래로 합니다. 3D 분류는 클래스-1이 1-RBD 업 오픈 변형으로 나타나는 최대 파티클 수를 가지고 있음을 나타냅니다. 또한 클래스 3및 클래스-4는 비슷한 수의 입자를 가지며 두 모델 모두 모든 RBD를 가까운 변형으로 보였습니다. 그러나 클래스-5는 1-RBD가 중간 위치에 있는 중간 변형을 보여줍니다. 그러나, 스파이크 단백질의 1-RBD 오픈 적합성은 C1 대칭을 사용하여 재구성되었고, 전체 해상도는 4.4Å(도 6 및 보충 도 S10)이다. 마찬가지로, 모든 RBD 다운 클로즈 형태(클래스-3 및 클래스-4)는 C3 대칭과 함께 정제되었으며, 0.143 FSC의 전체 해상도는 ~3.9 Å(그림 7)이다.
전체 적인 이미지 처리는 스파이크 단백질이 모든 RBD를 닫고 1-RBD업 개방형 변형을 채택했음을 나타냅니다. 추가적으로, 스파이크 단백질의 중간 형성을 확인하였다. 스파이크 단백질의 S2 서브도메인의 고해상도 극저온-EM 구조는 개별 아미노산 잔류물의 측면 사슬을 나타낸다(도 6B 및 도 7C). 모든 3D 재구성 및 극저온-EM 결과는 최근에 발표된 문헌25의 결과와 매우 유사합니다. 그러나 스파이크 단백질의 고해상도 극저온-EM 구조는 15일 이내에 특징지어졌으며, 이는 자동 극저온-EM 데이터 획득 프로토콜 및 자동 입자 따기 소프트웨어로 인해 가능하다. 따라서 Latitude-S를 포함한 자동 데이터 수집 소프트웨어 패키지는 생물학적 거대 분자의 여러 고해상도 저온-EM 구조의 특성화에 크게 기여할 수 있습니다.
그림 1: Latitude-S를 사용하여 자동화된 데이터 수집 워크플로우: 데이터 수집 전에 따라야 할 일반적인 단계(그리드 준비, 샘플 로딩 및 현미경 튜닝). 데이터 수집은 이 원고의 주요 부분이며 데이터 수집 중에 따라야 할 파이프라인이 강조 표시됩니다. 약어 : 냉동 EM = 냉동 전자 현미경 검사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: DM3 소프트웨어 슈트에서 데이터 수집을 위한 Latitude-S GUI. (A) Latitude-S 소프트웨어 패키지를 사용하여 단일 파티클 데이터 수집을 위한 다양한 상태의 설정. (B) 데이터 수집 절차의 워크플로우입니다. (C) 각 패널의 확장. 약어: GUI = 그래픽 사용자 인터페이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미세 정렬을 사용하여 초점 및 이미지 수집을 위한 높은 정확도를 설정합니다. 미세 정렬은 아틀라스, b. 구멍, c. 데이터, d. 그리드, e. 포커스의 다섯 가지 주에서 수행됩니다. 빨간색 표시를 동일한 위치에 배치하여 각 상태에 초점을 맞춥니다. 특정 위치에서 이미징을 수행하는 데 도움이 되는 새 세션을 시작하기 전에 미세 정렬 을 수행하는 것이 좋습니다. 특정 위치에서 이미지 수집(주요 시프트 없이)은 미세 정렬의 정확도에 따라 완전히 달라집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 위도-S를 사용하여 자동 구멍 선택. 데이터 수집을 위한 구멍의 자동 찾기는 구멍 크기에 따라 자동으로 수행됩니다. (A) 구멍을 자동으로 찾기 위한 구멍 찾기 벡터의 위치를 표시합니다. 스케일 바 = 20 μm. (B)는 구멍을 사용하여 벡터를 찾고 강도를 조정하여 경계 영역 및 얼음 오염에서 마커를 제거하는 구멍을 표시합니다. 스케일 바 = 20 μm(왼쪽) 및 10 μm(가운데). (C) 이미징(노란색)을 위한 구멍의 자동 추가를 표시합니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 데이터 수집의 라이브 보기입니다. (A) 위치는 각 위치에서 데이터 수집 상태에 따라 노란색, 녹색, 파란색 및 빨간색으로 표시됩니다. (B) 데이터 수집 상태를 모니터링하기 위한 색상 코드입니다. 녹색: 예약된 노란색: 예약되지 않은 파란색: 획득, 빨간색: 실패. 왼쪽 패널에는 녹색(예정)으로 표시된 여러 구멍과 파란색(획득됨)으로 표시된 몇 개의 구멍이 표시됩니다. 스케일 바 = 10 μm. 중간 패널은 개별 구멍의 4,300배 배율을 보여줍니다. 구멍(가운데 패널)의 이 이미지에서, 파란색 사각형 상자는 초점 영역을 나타내고, 녹색 사각형 상자는 이미징 영역을 나타낸다; 스케일 바 = 1000 nm. 오른쪽 패널에는 획득한 이미지가 표시됩니다. 극단적 인 오른쪽 패널은 예약 된 이미지 번호, 이미징에 필요한 총 시간 및 이미징에 예약 된 이미지 수를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 1RBD가 열려 있는 스파이크 3D 모드입니다. (A) 1-RBD 업 오픈의 자동 정제 및 날카로운 스파이크 단백질 맵은 측면, 위쪽 및 하단 뷰로 표시됩니다. (B) EM 맵에는 측면 체인의 더 나은 시각화를 위한 결정 구조가 장착되어 있습니다. 맵의 강조 표시된 영역에는 측면 체인에 대한 밀도가 있습니다. 약어: 3D = 3차원; RBD = 수용체 결합 도메인; EM = 전자 현미경 검사법; NTD = N단 도메인; S1 = 하위 단위 1; S2 = 하위 단위 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 모든 RBD 는 스파이크 단백질의 근접 형성을 아래로. (A) 모든 RBD의 자동 정제 및 날카로운 스파이크 단백질 지도는 측면과 상단 보기로 표현 닫기 형성 아래로. (B) EM 맵에는 측면 체인의 더 나은 시각화를 위한 결정 구조가 장착되어 있습니다. 화살표는 맵의 영역에 측면 체인(C)에 대한 밀도가 있음을 보여 준다. 약어: RBD = 수용체 결합 도메인; EM = 전자 현미경 검사법; NTD = N단 도메인; S1 = 하위 단위 1; S2 = 하위 단위 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도면 S1: 위도-S 이미지 수집 GUI: 다양한 현미경 컨트롤러(예: 컬럼 밸브 열기/닫기, 화면 삽입/리트랙트)는 위도-S GUI에 의해 제어됩니다. 컬럼 밸브, 카메라, 화면 상태 및 액체 질소 충전은 왼쪽 패널에서 제어할 수 있습니다. 이 패널의 하단에는 다양한 교정 매개 변수가 녹색으로 나타납니다(예: 배율, 빔 기울기, 목표 초점). 매개 변수가 검은색으로 나타나면 매개 변수가 올바르게 최적화되지 않음을 나타냅니다. 따라서 새 세션을 시작하기 전에 모든 매개 변수를 최적화해야 합니다. 약어: GUI = 그래픽 사용자 인터페이스. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: 아틀라스 상태의 표현. 그리드 사각형과 형성 된 얼음의 유형을 보여주는 다른 아틀라스 상태. (A-F) 다양한 아틀라스 크기도 강조 표시됩니다. (A, B, D, F) 두꺼운 얼음 패턴이 강조 표시됩니다. (C, D) 깨진 사각형이 강조 표시됩니다. 두꺼운 얼음과 깨진 영역 (그림에 표시)은 이미징에 적합하지 않습니다. (E, F) 이미징을 위한 좋은 그리드 사각형; A, B, C, D 및 F는 고해상도 이미징에 적합한 그리드 사각형을 보여줍니다. 그러나 두꺼운 얼음 그리드 사각형과 깨진 그리드 사각형은 제외해야 합니다. 스케일 바 = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E), 25 μm (F). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 S3: 그리드 상태 및 구멍 상태를 표현합니다. 그리드 상태 및 해당 구멍 상태가 이미지에 표시됩니다. (A, E) 빈 구멍, (F, G) 두꺼운 얼음, (E) 얼음 오염, (A, B, C, D, E 및 G) 적합한 얼음 두께가 이미지에 표시되어 있습니다. 이미지 수집(A, B, C, D, E 및 G)에 적합한 얼음 두께 구멍이 선택됩니다. 스케일 바 = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 S4: 자동 이미징을 위한 구멍 참조. 구멍 이미지(콴티포일-홀리 카본 그리드 QUANTIFOIL R 1.2/1.3)가 캡처되어 향후 참조를 위해 저장됩니다. 구멍 참조의 크기는 다양한 유형의 그리드에 따라 달라질 수 있습니다. 새 세션을 시작하기 전에 항상 구멍 참조를 캡처하는 것이 좋습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 S5: 다양한 배율 및 구멍 선택에서 이미지 캡처 패널. (A) 캡처 패널에는 데이터 수집 설정이 표시됩니다. (B) 위도-S 주 내비게이션 창은 3회 연속 배율을 나타낸다. 아틀라스 상태(150x)에서 그리드 사각형은 데이터 수집을 위해 선택됩니다(좌측 패널, 스케일 바 = 50 μm). 배율(380x)에서 단일 사각형이 집중된다(중간 패널, 스케일 바 = 20 μm). 더 높은 배율(4,300x)은 각 사각형 내부의 구멍에 초점을 맞추고 있습니다(오른손 패널, 스케일 바 = 5 μm). 그러나 이러한 배율은 그리드의 크기와 모양에 따라 변경됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 S6: 구멍 선택 및 이미징을 위한 템플릿 만들기. 템플릿 생성은 데이터에 대한 구멍에 위치를 추가하여 수행되며, 초점은 탄소 표면의 구멍에 인접한 위치된다. 빔 직경이 인접한 구멍을 만지지 않도록 탄소 영역에 초점을 배치해야합니다. 스케일 바 = 20 μm(왼쪽 패널), 10 μm(중간 패널), 1000nm(오른쪽 패널). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 S7: 위도-S 및 이미지 스크리닝을 사용 하 여 SARS-CoV2의 Cryo-EM 이미징. (A) 획득 된 현미경 사진의 선별 : 1D CTF 적합, 2D CTF 적합 및 CTF 매개 변수; cisTEM을 이용한 SARS-CoV2 스파이크 단백질 데이터의 추정. 1D CTF 핏 및 Thon 링은 전체 신호가 4.8Å. (B) 현미경으로 스파이크 단백질의 두 가지 상이한 디포커스 값에서 위도-S를 사용하여 획득함을 나타낸다. 스케일 바 = 50 nm. (C) 최종 2D 클래스 평균. 2D 클래스 평균은 스파이크 단백질의 위쪽, 아래쪽 및 측면 보기를 보여줍니다. 모든 고해상도 세부 정보는 2D 클래스 평균으로 표시됩니다. 약어 : 냉동 EM = 냉동 전자 현미경 검사법; 1D = 1차원; 2D = 2차원; CTF = 콘트라스트 전송 기능; SARS-CoV2 = 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 도서 S8: Latitude-S 소프트웨어를 사용하여 획득한 SARS-CoV2 스파이크 단백질 데이터의 데이터 처리. 이미지는 스파이크 단백질의 cryo-EM 데이터를 처리하기 위해 다음 워크플로우를 보여줍니다. 스파이크 단백질의 3D 분류는 릴리온 3.0을 사용하여 수행됩니다. 클래스-1은 1-RBD 업 오픈 구성을 보여줍니다. 클래스-3 및 클래스-4 는 스파이크 단백질의 가까운 형성 아래로 모든 RBD를 보여줍니다. 클래스-5는 스파이크 단백질의 중간 형성을 나타낸다. 약어 : 냉동 EM = 냉동 전자 현미경 검사법; 3D = 3차원; RBD = 수용체 결합 도메인; SARS-CoV2 = 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 도면 S9: 최종 이미지 수집을 위한 참조로 캡처된 용량 분별 이미지. 용량 분별 이미지는 8.0s 노출 및 0.2 s/프레임 노출로 캡처됩니다. 카메라 근처의 자동 저장 버튼을 클릭하여 동영상 파일을 자동으로 저장합니다. 이미지 수집 후 이미지를 클릭하고 데이터 수집 상태에서 이미지 업데이트 버튼을 사용하여 용량 분별 된 이미지 매개 변수를 저장합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도서 S10: 생성된 SARS-CoV-2 1 RBD의 각 분포 및 푸리에 쉘 상관관계 오픈 형성 스파이크 단백질 맵. (A) 스파이크 단백질의 1-RBD 의 최종 3D 모델의 각도 분포. 파란색은 낮은 값을 나타내고 빨간색은 정규화된 파티클 분포의 더 높은 값을 나타냅니다. (B) 컷오프로 추정되는 스파이크 단백질의 1-RBD 업 오픈 형태의 4.4 Å 분해능을 보여주는 Fourier 쉘 상관 곡선. 약어: 3D = 3차원; RBD = 수용체 결합 도메인; SARS-CoV2 = 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2; FSC = 푸리에 쉘 상관 관계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 아틀라스 이미지 상태 | 아틀라스 115 |
| 확대 | 115, 픽셀 크기 34.7 nm |
| 표시된 디포커스 | 4.38 mm |
| 스팟 크기 | 8 |
| 밝기 | 934400 |
| 모드 | 이미징실M |
| 비닝 (버닝) | 1 |
| 노출 시간 | 1.0 s |
| 그리드 측량 상태 | 그리드 380 |
| 확대 | 380, 픽셀 크기 11.2 nm |
| 표시된 디포커스 | 2.37 mm |
| 스팟 크기 | 8 |
| 밝기 | 626200 |
| 모드 | 이미징실M |
| 비닝 (버닝) | 1 |
| 노출 시간 | 1.0 s |
| 홀 측량 상태 | 3400번 홀 |
| 확대 | 3,400, 픽셀 크기 1.20 nm |
| 표시된 디포커스 | -0.75 μm |
| 스팟 크기 | 7 |
| 빔 직경 | 8.81 μm |
| 모드 | 이미징실M, SA, Mh |
| 비닝 (버닝) | 1 |
| 노출 시간 | 1.0 s |
| 초점 상태 | 포커스 45k |
| 확대 | 45,000, 픽셀 크기 0.0924 nm |
| 표시된 디포커스 | 4.51 μm |
| 스팟 크기 | 6 |
| 빔 직경 | 0.716 μm |
| 모드 | 이미징실M, SA, Mh |
| 비닝 (버닝) | 1 |
| 노출 시간 | 1.0 s |
| 아키시시온 주 | 데이터 45k |
| 확대 | 45,000, 픽셀 크기 0.0924 nm |
| 디포커스 설정 | 최소: -4,500 nm, 최대: -1,500 nm, 단계: 250 nm |
| 스팟 크기 | 6 |
| 빔 직경 | 0.752 μm |
| 모드 | 이미징실M, SA, Mh |
| 비닝 (버닝) | 1 |
| 노출 시간 | 20프레임에 대한 총 8s 노출 |
| 카메라 설정 | 계산, 게인 정규화, 결함 수정 |
| 데이터 저장 설정 | MRC |
표 1: 위도-S 상태 설정 요약입니다.
| 사양 | K2 베이스 | K2 서밋 |
| TEM 작동 전압 | 200-400 kV | |
| 센서 활성 영역 | 19.2 mm × 18.6 mm | |
| 픽셀의 센서 크기 | 3838 × 3710 | 7676 × 7420 슈퍼- 해상도 |
| 물리 알 픽셀 크기 | 5 μm | |
| 비닝 (버닝) | 1-8배 | |
| 센서 판독 | 임의 영역 | |
| 필름에 비해 배율 | 1.3-1.5배 | |
| 센서 판독 속도 | 50 전체 fps | 400 전체 fps |
| 컴퓨터로 속도 전송 | 8 전체 fps | 40 전체 fps |
| 이미지 디스플레이 | 8 전체 fps | 10 전체 fps |
| DQE 성능 (300 kV) | >0.30(피크) >0.25 에서 0.5 물리적 나이퀴스트 | >0.7 (피크) >0.50 에서 0.5 0 0.5 물리적 나이퀴스트 의 0.5 >0.06 에서 1.25 물리적 나이퀴스트 |
| 소프트웨어 | 디지털 현미경 그래프를 포함한 가탄 현미경 스위트 룸 |
표 2: 카메라 사양.
| 구성 옵션 | 값 |
| 현미경 유형 | 타를로스 북극 G2 |
| 높은 장력 | 200 kV |
| 근원 | XFEG |
| 렌즈 | 크라이오 트윈 |
| 진공 시스템 | 탈로스 TMP IGP |
| 샘플 로더 | 오토로더 |
표 3: 현미경 구성.
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Discussion
Latitude-S는 직관적인 사용자 인터페이스로, 이틀 만에 수천 개의 고해상도 현미경 또는 영화 파일을 자동으로 설정하고 수집할 수 있는 환경을 제공합니다. 그리드 를 가로 질러 쉽게 탐색할 수 있으며 낮은 배율에서 높은 배율로 이동하는 동안 현미경 단계의 위치를 유지합니다. Latitude-S를 사용하여 데이터 수집의 각 단계는 시간 효율적이며 간단한 사용자 인터페이스, 최대 4.5GB/s 속도로 데이터의 빠른 스트리밍, 수집 하는 동안 데이터의 동시 표시와 같은 기능을 제공합니다. 또한, 미리 보정된 용량 분획, 용량 속도, 포커스 및 배율 매개 변수는 자동 데이터 수집의 새로운 세션을 시작하고 시간을 절약하기 위해 쉽게 재장전되었습니다.
지속적인 모니터링이 없고 데이터 세트의 품질을 손상시키지 않으면서 데이터를 자동으로 수집하는 것은 어렵고 시간이 많이 소요되는 작업입니다. 특히 이 전염병 동안 시간과 리소스가 주요 제약 조건이 될 때 Latitude-S 소프트웨어를 사용한 자동화된 데이터 수집이 편리합니다. 그러나 SARS-CoV-2의 다양한 단백질의 여러 극저온-EM 구조는 지난 몇 개월 동안 해결되었으며, 이는 제약 회사가 백신을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 다양한 실험실에서 다양한 유형의 자동 데이터 수집 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터를 수집합니다. 우리는 구멍이 있는 탄소 그리드 또는 홈메이드 GO 코팅 그리드30에서 극저온-EM 자동 데이터 수집을 위해 K2 서밋 DED를 사용하여 Latitude-S를 사용했습니다.
이 연구는 위력 절개 섹션에서 위에서 언급한 매개 변수를 사용하여 수행되었으며, 이는 Latitude-S가 단일 입자 저온-EM을 위한 자동 데이터 수집을 위한 적합하고 이상적인 소프트웨어 패키지라는 강력한 증거를 제공합니다. 그러나 K2 카메라를 사용하여 이미징을 시작하기 전에 특정 프로토콜을 따르는 것이 좋습니다. K2 직접 감지 카메라는 최고 성능을 달성하기 위해 기본적인 유지 보수 루틴이 필요합니다. 24시간 동안 카메라를 50°로 규칙적으로 어닐링하면 표면 수준에서 배경 소음과 오염을 줄임으로써 센서가 최적의 성능을 발휘할 수 있습니다. 그러나 카메라 어닐링 후 카메라의 게인 및 어두운 참조를 업데이트하는 것은 이미지 수집을 수행하기 전에 필수 단계(~45분 소요)입니다.
Latitude-S는 극저온-EM 자동 데이터 수집을 위한 안정적이고 사용자 친화적인 소프트웨어 패키지이지만, 래티튜드-S의 5개 주에서 다양한 매개변수(배율, 스팟 크기, 밝기 및 용량 율)를 최적화하는 것이 필수적입니다. 구멍 또는 그리드 상태의 배율은 구멍 이 그리드 또는 구멍 이 그리드 유형(예: R2/2 또는 R1.2/1.3 또는 R 0.6/1)의 구멍 크기에 따라 달라집니다. 예를 들어 R0.6/1 형 그리드 구멍 크기는 0.6 μm이고 R2/2 그리드의 구멍 크기는 2 μm입니다. 따라서, 위도-S의 그리드 및 구멍 상태에서 그리드 유형 R0.6/1 및 R2/2에 대해 구멍을 적절히 시각화하기 위해서는 두 가지 유형의 배율이 필요합니다.
따라서 5개 주에서 다양한 유형의 그리드에 대한 배율 설정이 가변적입니다. 스팟 크기와 밝기는 배율에 따라 크게 달라집니다. 따라서 이러한 값은 다른 배율 값에서 변경될 수 있습니다. 따라서 자동 데이터 수집을 시작하기 전에 다양한 유형의 cryo-EM 그리드를 사용하여 5가지 Latitude-S 상태의 다양한 매개 변수를 최적화하는 것이 좋습니다. 그러나 모든 매개 변수가 최적화되고 저장되면 사용자의 요구 사항에 따라 모든 매개 변수를 다시 로드하고 다른 배율 또는 그리드 유형에서 위도-S를 사용하기 쉽습니다.
Latitude-S와 K2를 사용하는 중요한 이점은 사용자가 빔 밸브를 열거나 닫고, 카메라를 삽입/철회하고, 현미경의 인광선 화면을 삽입/철회하고, 위도-S의 GUI를 사용하여 액체 질소 충진을 조절할 수 있다는 것입니다. 그러나 K2 위도-S GUI 탭(보조 도면 S1 및 도 2)을 통해 는 기타 옵션(총 기울기, 건 시프트, 빔 시프트, 피벗 포인트, C2 조리개 중심, 회전 센터, 혼수 상태에 없는 정렬)을 통해 접근할 수 없습니다. 오랜 시간 동안 데이터 수집이 있을 때 빔의 위치가 바뀔 수 있습니다.
Latitude-S는 데이터 수집 기간 동안 시스템의 안정성을 추적하기 위해 자동화된 정기적인 검사 및 수정을 실행할 수 있습니다. 시스템의 안정성은 빔을 중심으로 어두운 참조를 업데이트하여 유지됩니다. 상수 검사는 획득한 데이터의 높은 품질을 보장합니다. Latitude-S에서 유중심 높이(Z 높이)는 데이터 수집 전에 한 번만 수정되며 그리드 사각형을 변경할 때 Latitude-S에 의해 유중심 높이가 자동으로 계산됩니다. 포커스는 사용자가 정의한 포커스 범위에 따라 자동으로 측정되고 조정됩니다. 지정된 임계값을 초과하면 프로그램이 스테이지 Z 위치를 재설정합니다. 이러한 안정성은 시스템 안정성 팔레트를 통해 제어됩니다. 그러나 다른 자동 데이터 수집 패키지와 마찬가지로 Latitude-S에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다.
격자가 고르지 않은 경우 위도-S는 연동 높이(Z 높이)를 계산할 수 없습니다. 이 시나리오에서는 데이터를 수집할 수 없거나 디포커스 값이 완전히 범위를 벗어났습니다. 따라서 사용자는 Latitude-S를 사용하여 평평한 표면 그리드만 구부리고 이미지만 하지 않고 그리드를 준비하는 데 매우 신중해야 합니다. 또한 레기논, 시리얼EM 및 UCSF-이미지와 달리 Latitude-S는 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어 패키지가 아닙니다. Latitude-S는 필터링또는 독립형 K2, K3, K3 베이스 직판 카메라, 리오 및 원뷰 카메라 등 가탄 카메라와 호환됩니다. 사용자에게 또 다른 중요한 단점은 팔콘 DED와 같은 다른 인기있는 DED와 호환되지 않는다는 것입니다. 그러나, 이것은 또한 EPU에 대 한 사실이다, 또 다른 자동 데이터 수집 소프트웨어 패키지, 냉동 현미경으로 사용할 수 있는 만 팔콘 카메라와 호환. 그러나 EPU는 에너지 필터(BioQuantum K3 이미징 필터)를 탑재한 K2/K3에도 사용되지만 독립형 K2/K3 카메라는 사용하지 않습니다.
Latitude-S는 단일 입자 저온-EM을 위한 자동 데이터 수집에 사용되는 소프트웨어 패키지인 EPU, 시리얼EM, AutoEM, AutoEMation 및 Leginon과 매우 유사합니다. 그러나 위도-S는 K2 DED, K3 DED 또는 BioQuantum K3 이미징 필터와만 호환됩니다. 또한 Latitude-S 사용자를 위해 회사에서 지속적인 기술 지원을 제공합니다. 이러한 기술 지원은 데이터 수집을 위해 K2 DED, K3 DED 또는 BioQuantum K3 이미징 필터 장치를 사용해야 하며 시리얼EM 및 레기논과 같은 무료 소프트웨어 패키지를 설정하거나 사용하는 방법에 대한 사전 지식이 없는 소규모 사용자 그룹에 유용합니다.
마이크로 결정 전자 회절 (마이크로 ED), 단층 촬영 및 에너지 분산 X 선 분광법 (EDS)과 같은 다른 많은 기능이 있으며, 이는 다양한 다른 버전의 위도에서 사용할 수 있습니다. 따라서 사용자는 다른 모드에서 데이터 수집에 동일한 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다. 당사의 지식에 따르면, 마이크로ED, 단층 촬영 및 EDS에 대한 데이터 수집은 EPU 또는 기타 소프트웨어 패키지에서 사용할 수 없습니다. 따라서 이 위도 소프트웨어 패키지는 단일 입자 극저온에서자동 데이터 수집 외에도 다양한 용도로 유용할 수 있습니다. 그러나 무료 소프트웨어 패키지인 시리얼EM과 레기논은 팔콘 또는 K2/K3 카메라에 적합하며 신규 사용자에게 매우 유용합니다. 그러나 Latitude-S를 자유롭게 사용할 수 없으며 이 소프트웨어 패키지의 단점이 있을 수 있습니다.
요약하면, Latitude-S 자동 데이터 수집 도구는 다른 자동 데이터 수집 소프트웨어 패키지(예: EPU, 레기논, 시리얼EM, UCSF-Image)와 매우 우수합니다. Latitude-S는 매우 안정적이고 사용자 친화적인 데이터 수집 소프트웨어 패키지로 필터링또는 독립형 K2, K3, K3 베이스 직판 카메라, 리오 및 OneView 카메라와 함께 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 경쟁또는 재정적 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 생명공학부, 과학기술부(DST) 및 과학기술부, 인도 인사개발부(MHRD) 및 IISc-방갈로르의 냉동 EM 시설에 대한 지원을 인정합니다. 우리는 DBT 빌더 프로그램 (BT / INF / 22 / SP22844/2017) 및 DST-FIST (SR / FST / LSII-039/2015) IISc, 방갈로르에있는 국립 Cryo-EM 시설에 대한 인정. 우리는 과학 공학 연구 위원회 (SERB)(보조금 No.SB / S2 / RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 및 SERB-IPA/2020/000094), DBT (그랜트 번호)의 재정 지원을 인정합니다. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). 극저온-EM 그리드를 준비하고, 냉동 EM 데이터 수집을 준비하고, 재료 테이블을 준비해 주신 이시카 프라마닉 씨께 감사드립니다. 또한, 스만 미쉬라 씨가 저온-EM 이미지 처리와 수치를 준비할 수 있도록 도와준 것에 대해 서도 감사드립니다. 우리는 이 연구를 위한 정제된 스파이크 단백질 견본을 얻기 위하여 저희를 돕는 라가반 바라다얀 교수에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
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