Summary
La microscopía crioelectrónica de una sola partícula exige un paquete de software adecuado y una canalización fácil de usar para la adquisición automática de datos de alto rendimiento. Aquí, presentamos la aplicación de un paquete de software de adquisición de imágenes totalmente automatizado, Latitude-S, y una tubería práctica para la recopilación de datos de biomoléculas vitrificadas en condiciones de dosis bajas.
Abstract
En los últimos años, los avances tecnológicos y metodológicos en la microscopía crioelectrónica de una sola partícula (cryo-EM) han allanado una nueva vía para la determinación de la estructura de alta resolución de macromoléculas biológicas. A pesar de los notables avances en crio-EM, todavía hay margen de mejora en varios aspectos del flujo de trabajo de análisis de partículas individuales. El análisis de una sola partícula exige un paquete de software adecuado para la adquisición automática de datos de alto rendimiento. En los últimos ocho años se desarrollaron varios paquetes de software de adquisición automática de datos para imágenes automáticas para cryo-EM de una sola partícula. Este artículo presenta una aplicación de una tubería de adquisición de imágenes totalmente automatizada para biomoléculas vitrificadas en condiciones de dosis bajas.
Demuestra un paquete de software, que puede recopilar datos crio-EM de forma completa, automática y precisa. Además, varios parámetros microscópicos son fácilmente controlados por este paquete de software. Este protocolo demuestra el potencial de este paquete de software en imágenes automatizadas de la proteína espiga del síndrome respiratorio agudo severo-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) con un microscopio crioelectrónico de 200 keV equipado con un detector de electrones directo (DED). Se adquirieron alrededor de 3.000 imágenes de películas crio-EM en una sola sesión (48 h) de recopilación de datos, lo que produjo una estructura de resolución atómica de la proteína espiga del SARS-CoV-2. Además, este estudio estructural indica que la proteína espiga adopta dos conformaciones principales, 1-RBD (dominio de unión al receptor) abierta hacia arriba y todas las conformaciones RBD hacia abajo cerradas.
Introduction
La crio-EM de una sola partícula se ha convertido en una técnica de biología estructural convencional para la determinación de la estructura de alta resolución de macromoléculas biológicas1. La reconstrucción de una sola partícula depende de la adquisición de un gran número de micrografías de muestras vitrificadas para extraer imágenes de partículas bidimensionales (2D), que luego se utilizan para reconstruir una estructura tridimensional (3D) de una macromolécula biológica2,3. Antes del desarrollo de los DED, la resolución lograda a partir de la reconstrucción de una sola partícula oscilaba entre 4 y 30 Å4,5. Recientemente, la resolución alcanzable de la crio-EM de una sola partícula ha alcanzado más allá de 1,8 Å6. El DED y el software automatizado de adquisición de datos han sido los principales contribuyentes a esta revolución de la resolución7, donde la intervención humana para la recopilación de datos es mínima. En general, las imágenes crio-EM se realizan a bajas tasas de dosis de electrones (20-100 e / Å2) para minimizar el daño por radiación inducido por el haz de electrones de las muestras biológicas, lo que contribuye a la baja relación señal-ruido (SNR) en la imagen. Este bajo SNR impide la caracterización de las estructuras de alta resolución de macromoléculas biológicas mediante análisis de partículas individuales.
Los detectores de electrones de nueva generación son detectores basados en CMOS (semiconductores complementarios de óxido de metal), que pueden superar estos obstáculos relacionados con el bajo SNR. Estas cámaras CMOS de detección directa permiten una lectura rápida de la señal, debido a que la cámara contribuye con una mejor función de propagación de puntos, SNR adecuado y una excelente eficiencia cuántica de detección (DQE) para macromoléculas biológicas. Las cámaras de detección directa ofrecen un alto SNR8 y bajo ruido en las imágenes grabadas, lo que resulta en un aumento cuantitativo en la eficiencia cuántica del detective (DQE), una medida de la cantidad de ruido que un detector agrega a una imagen. Estas cámaras también graban películas a la velocidad de cientos de fotogramas por segundo, lo que permite una rápida adquisición de datos9,10. Todas estas características hacen que las cámaras de detección directa rápida sean adecuadas para aplicaciones de dosis bajas.
Las imágenes de pila corregidas por movimiento se utilizan para el procesamiento de datos para calcular la clasificación 2D y reconstruir un mapa de densidad 3D de macromoléculas mediante el uso de varios paquetes de software como RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 y EMAN215. Sin embargo, para el análisis de una sola partícula, se requiere un enorme conjunto de datos para lograr una estructura de alta resolución. Por lo tanto, los peajes automáticos de adquisición de datos son muy esenciales para la recopilación de datos. Para registrar grandes conjuntos de datos crio-EM, se han utilizado varios paquetes de software en la última década. Se han desarrollado paquetes de software dedicados, como AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS y EPU, para la adquisición automatizada de datos.
Estos paquetes de software utilizan tareas rutinarias para encontrar posiciones de agujeros automáticamente correlacionando las imágenes de bajo aumento con imágenes de alto aumento, lo que ayuda a identificar agujeros con hielo vítreo de espesor de hielo apropiado para la adquisición de imágenes en condiciones de dosis bajas. Estos paquetes de software han reducido el número de tareas repetitivas y han aumentado el rendimiento de la recopilación de datos crio-EM al adquirir una gran cantidad de datos de buena calidad durante varios días continuamente, sin ninguna interrupción y la presencia física del operador. Latitude-S es un paquete de software similar, que se utiliza para la adquisición automática de datos para el análisis de partículas individuales. Sin embargo, este paquete de software solo es adecuado para DED K2 / K3 y se proporciona con estos detectores.
Este protocolo demuestra el potencial de Latitude-S en la adquisición automatizada de imágenes de la proteína espiga del SARS-CoV-2 con un detector de electrones directo equipado con un crio-EM de 200 keV (ver la Tabla de Materiales). Utilizando esta herramienta de recopilación de datos, se adquieren automáticamente 3.000 archivos de película de la proteína espiga del SARS-CoV-2, y se lleva a cabo un procesamiento adicional de datos para obtener una estructura de proteína espiga de resolución 3.9-4.4 Å.
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Protocol
NOTA: Se requieren tres pasos importantes para la recopilación de datos de crio-EM: 1. preparación de la rejilla crio-EM, 2. calibración y alineación del microscopio, 3. recopilación automática de datos (Figura 1). Además, la recopilación automatizada de datos se subdivide en a. selección de área adecuada, b. optimización de Latitude-S, c. selección automática de orificios de inicio y d. inicio de adquisición automática de datos (Figura 1).
1. Preparación de la rejilla Cryo-EM y carga de muestras para la adquisición automática de datos
- Limpie las rejillas con un descargador de resplandor y varíe los parámetros de descarga de resplandor según los requisitos experimentales (aquí, 60 s a 20 mA).
- Agregue una muestra de proteína recién preparada (3 μL) a la rejilla descargada por resplandor e incube durante 10 s.
- Seque las rejillas durante 3-5 s al 100% de humedad y sumérjalas rápidamente en etano líquido con un crioémbolo.
- Sujete las rejillas manualmente en un anillo de clip para formar el cartucho utilizando un anillo de clip C flexible.
- Cargue las rejillas montadas en cartuchos congelados en el cassette del cargador automático y transfiera el cassette por la tapa nano al cargador automático preenfriado del microscopio para la recopilación de datos.
2. Ajuste del microscopio y alineación básica antes de la adquisición automática de datos
- Desplazamiento de haz
- Haga clic en Desplazamiento de haz en la pestaña Alineación directa .
- Reduzca la ampliación y centre el haz en el eje óptico mediante la perilla Multifunción X e Y .
- Alineación del punto de pivote
- Haga clic en la opción Inclinación del haz en Alineación directa pp X de la pestaña Alineación directa .
- Condense el haz en un punto y minimice el movimiento utilizando la perilla Multifunción X e Y .
- Centrado de apertura C2
- Seleccione la apertura del condensador en la pestaña Alineación .
- Condense el haz en un punto, centre el haz en el eje óptico y luego expanda el haz para cubrir el círculo de manera uniforme.
- Repita estos pasos hasta que se ajuste la apertura del condensador 2.
- Alineación libre de coma
- Haga clic en Alineación X sin coma en la pestaña Alineación directa para alinear el haz con el eje óptico.
- Utilice la perilla multifunción para minimizar la forma y el movimiento de la FFT (asegúrese de que sea estable).
- Repita el mismo procedimiento para Coma - alineación libre Y.
- Establezca la iluminación paralela antes de la recopilación de datos en el crio-EM debido a la lente doble C.
- Inserte la apertura del objetivo (70 μm) en modo de difracción.
- Enfoca la apertura del objetivo en el plano focal frontal de la lente de difracción controlando la perilla de desenfoque-intensidad (lente objetivo y corriente de lente C2).
- Asegúrese de que el borde nítido de la apertura del objetivo se vea después de un desenfoque adecuado.
- Inserte el tapón del haz y extienda la intensidad hasta que los anillos de difracción de polvo de oro se minimicen.
NOTA: Si el haz se extiende correctamente, un anillo de difracción transparente del polvo de oro es visible en la pantalla, lo que indica que el haz es paralelo. - Retraiga el tapón del haz después de configurar la iluminación paralela y cambie el modo de microscopio a nano sonda.
NOTA: Compruebe el ajuste del microscopio antes de iniciar la recopilación de datos para garantizar el rendimiento óptimo del microscopio. Todos estos ajustes se realizarían en la pestaña GUI de alineación directa del microscopio. Todo el ajuste del microscopio se realiza utilizando una cuadrícula de prueba antes de la recopilación de datos.
3. Adquisición de datos con Latitude-S
- Inicie el software automatizado de adquisición de datos Latitude-S.
NOTA: La instalación de Latitude-S también requiere la calibración del microscopio, que se realizará antes de la recopilación de datos, y la configuración se almacenará de forma permanente. Cinco estados diferentes para la recopilación de datos se calibran con cuatro aumentos diferentes (Figura 1 y Figura 2). El estado Atlas y el estado de cuadrícula están en dos aumentos diferentes en modo LM (rangos de bajo aumento). El estado del taladro está en modo SA (rangos de aumento alto) pero con un aumento moderado. El enfoque y el estado de los datos utilizan el modo SA de gran aumento.- Haga clic en DigitalMicrograph en el menú Inicio o haga doble clic en el icono DigitalMicrograph en el escritorio.
- Seleccione el icono Administrador de técnicas de DigitalMicrograph.
NOTA: Este sistema mostrará los iconos TEM y Latitude-S (Figura 2 y Figura suplementaria S1). - Seleccione el icono Latitude-S para la recopilación automatizada de datos de una sola partícula.
NOTA: La cámara K2 funciona en tres modos: lineal/integrado, contado y superresolución. El usuario puede seleccionar cualquier modo en la interfaz de DigitalMicrograph. Las imágenes de datos se pueden guardar como pilas de imágenes fraccionadas por dosis o como imágenes sumadas en archivos MRC, TIF o .dm4 con diferentes profundidades de bits. Además, los datos podrían guardarse como imágenes corregidas de movimiento para la cámara K3. En una cámara K2, una pila de imágenes sin procesar podría guardarse como archivos MRC de 4 bits, TIF de 8 bits o .dm4 de 8 bits.
- Cree una nueva sesión basada en la configuración de una sesión anterior.
- Marque la casilla de verificación Basado en sesión anterior en la paleta.
- Seleccione el botón Nuevo .
- Elija la carpeta que contiene la sesión en la que se basa la configuración de la nueva sesión. Vaya al directorio de la sesión anterior para crear la nueva sesión. Elija la carpeta para guardar la nueva sesión y los datos asociados.
- Seleccione y elija la carpeta donde se guardará la nueva sesión y los datos asociados.
NOTA: Cada estado y sus ajustes subyacentes (ampliación, condiciones de iluminación, imagen o proyector) y el desplazamiento del haz y los parámetros de la cámara (exposición total, exposición de fotograma único y binning) se exportarán de la sesión existente a la nueva sesión. La ruta de la carpeta se muestra como una cadena de texto en la parte inferior de la paleta. Cada uno de los estados y paletas de configuración tiene un asterisco (*) adjunto al título para mostrar que ya se ha configurado y está listo para usar.
- Continúe con una sesión existente.
- Pulse el botón Continuar de la paleta para continuar con una sesión existente.
NOTA: El montaje del atlas no se puede modificar. - Elija y navegue hasta la carpeta que contiene la sesión que debe continuarse.
- Pulse el botón Continuar de la paleta para continuar con una sesión existente.
- Inicie una sesión completamente nueva.
- Haga clic en la pestaña Nuevo en la paleta. Elija la carpeta que contiene la sesión que se va a continuar. Seleccione una carpeta para guardar los datos.
Nota : el nombre de carpeta predeterminado se genera mediante la fecha y la hora. - Haga clic en el icono Configuración . En el cuadro De exploración de estado que aparece, agregue estado, establezca la condición TEM, la condición de la cámara y la imagen/pila y, a continuación, asigne un nombre al estado.
NOTA: El flujo de trabajo automatizado de adquisición de datos utiliza 5 estados diferentes para la recopilación automatizada de datos. Estos estados se configuran y almacenan en sus respectivas paletas de estados. El resumen del estado se da en la Tabla 1.
- Haga clic en la pestaña Nuevo en la paleta. Elija la carpeta que contiene la sesión que se va a continuar. Seleccione una carpeta para guardar los datos.
- Configure el estado del atlas.
- Haga clic en la paleta de estados Atlas.
- Configure el estado del atlas con los siguientes parámetros: aumento del modo LM 115x en nano sonda, condiciones de iluminación-tamaño de punto 8 y brillo 934400, binning: 1 y tiempo de exposición de la cámara: 1.0 s para imágenes a bajo aumento. Consulte el resumen del estado que figura en la Tabla 1.
- Haga clic en Siguiente para pasar al siguiente estado.
NOTA: El estado Atlas es el estado de aumento más bajo, que proporciona el estudio de toda la cuadrícula (Figura suplementaria S2). En general, este estado nos ayuda a visualizar todas las rejillas a bajo aumento y juzgar el espesor del hielo, la planitud y el cuadrado roto de las rejillas. Se recomienda generar el atlas en diferentes áreas de la cuadrícula para observar el espesor óptimo del hielo y el espesor de hielo subóptimo de las rejillas (Figura suplementaria S3). Los parámetros mencionados podrían variar según las necesidades del usuario.
- Configure el estado de la cuadrícula.
- Haga clic en la paleta de estados de cuadrícula.
- Configure el estado Grid con la siguiente óptica de imagen de microscopio (aumento del modo LM de 380x en la sonda Nano), condiciones de iluminación (tamaño del punto: 8 y brillo 626,200), binning: 1 y tiempo de exposición de la cámara: 1.0 s.
- Consulte el resumen del estado de Latitude-S proporcionado en la Tabla 1.
- Haga clic en Siguiente para pasar al siguiente estado.
NOTA: El estado de la cuadrícula se establece en un aumento superior al estado del atlas, de modo que el campo de visión es un cuadrado de cuadrícula (Figura 2). En este aumento particular, se observa un cuadrado de cuadrícula. Por lo tanto, los agujeros se observan correctamente en este aumento, lo que ayuda a verificar el espesor del hielo de los orificios (Figura suplementaria S4). Se utiliza un filtro de paso de banda simple en el estado de la cuadrícula para localizar los orificios en la rejilla de patente. Los parámetros mencionados podrían variar según las necesidades del usuario.
- Configure el estado del taladro.
- Haga clic en la paleta de agujeros.
- Configure el estado del orificio con los siguientes ajustes del microscopio: óptica de imagen (modo SM de aumento 4500x en sonda Nano), condiciones de iluminación (tamaño del punto: 7 y diámetro del haz 8,81 μm), binning: 1 y tiempo de exposición de la cámara: 1,0 s.
- Cambie los parámetros si es necesario en función del tipo de cuadrícula. Véase el resumen del estado que figura en la Tabla 1.
- Haga clic en Siguiente para pasar al siguiente estado.
NOTA: El modo SA indica un rango de aumento alto en el microscopio electrónico. El estado del orificio está en el rango de aumento SA con un campo de visión de unos pocos micrómetros (10-20 μm) (Figura 2 y Figura suplementaria S4). Este rango de aumento es más alto que el estado Atlas o Grid, pero mucho más pequeño que el estado Focus/Data. En este aumento, los agujeros individuales serán visibles. El tamaño del agujero es apropiado para observar altos grados de contaminación, agujeros vacíos y el espesor de hielo adecuado de los agujeros. Los orificios para la obtención de imágenes se seleccionan en función de estas suposiciones. Se utilizan dos filtros en el estado de taladro: uno para correlacionar una imagen de referencia de taladro con una nueva imagen de taladro y otro para ajustar la altura del escenario a la altura eucéntrica.
- Configure el estado de enfoque.
- Haga clic en Paleta de enfoque.
- Configure el estado de enfoque con los siguientes ajustes del microscopio: óptica de imagen (aumento del modo SA de 45.000x en nano sonda), condiciones de iluminación (tamaño del punto: 8 y brillo 934400), binning: 1 y tiempo de exposición de la cámara: 1,0 s.
- Concéntrese en el área de carbono amorfo cerca del agujero. Consulte el resumen del estado de Latitude-S que se proporciona en la Tabla 1.
- Haga clic en Siguiente para pasar al siguiente estado.
NOTA: El modo SA indica un rango de aumento alto en el microscopio electrónico. El estado Focus es el aumento de rango SA más alto. En el modo de enfoque, el haz se desplaza a un área de carbono cercana del orificio objetivo y realiza el enfoque automáticamente para recopilar los datos en el estado de datos. Un filtro de paso de banda combinado con un filtro rectangular suave o de suspensión se utiliza en el estado de enfoque para medir el desplazamiento entre dos imágenes de estado de enfoque de la misma área (Figura 2). Los parámetros mencionados podrían variar según las necesidades del usuario.
- Configure el estado de los datos.
- Haga clic en Paleta de datos.
- Configure el estado de los datos con los siguientes ajustes del microscopio: óptica de imagen (por ejemplo, aumento 28.000x, 45.000x, 54.000x en modo SA en nano sonda), condiciones de iluminación (tamaño del punto: 8 y brillo 934400), binning: 1 y tiempo de exposición de la cámara: 1,0 s.
- Consulte el resumen del estado de Latitude-S que figura en la Tabla 1.
- Haga clic en Siguiente para pasar al siguiente estado.
NOTA: El estado de datos es la mayor ampliación seleccionada en función de los requisitos de tamaño de píxel y la resolución de destino (Figura 2). Generalmente, después de enfocar, el haz se desplaza automáticamente al área objetivo para recopilar los datos. Los parámetros mencionados anteriormente podrían cambiarse en función de los requisitos del usuario.
4. Configuración del enfoque
- Haga clic en Paleta de configuración de enfoque. Especifique el rango de valores de desenfoque y el tamaño del paso en la pestaña dada.
- Presione el botón Siguiente para pasar al siguiente paso.
NOTA: Se pueden utilizar valores de desenfoque más bajos para la adquisición de datos de alta resolución. Generalmente, se utilizan valores de desenfoque de -0,5 a -3,0 μm con tamaños de paso de desenfoque de 0,25 o 0,5 para la adquisición de imágenes. Los usuarios pueden omitir el paso de configuración de enfoque si solo desean examinar el ejemplo. Simplemente presione el botón Siguiente en la paleta para omitir el paso de configuración de enfoque.
5. Alineación fina
- Concéntrese en algunas características de la cuadrícula (por ejemplo, hielo hexagonal de contaminación por hielo); ver Figura 3.
NOTA: Las características no deben ser demasiado grandes o demasiado pequeñas. Deben ser visibles tanto en la ampliación de estado Atlas 115x (modo LA) como en la ampliación de datos. - Haga clic en el botón Capturar . Coloque la marca de la cruz roja en la misma función en cada imagen de diferentes estados.
- Comience con el enfoque, los datos y los estados de agujero porque su campo de visión es mucho mayor que los estados del atlas y la cuadrícula. Amplíe los estados atlas y cuadrícula para colocar la marca de la cruz roja en la misma función en los estados atlas y cuadrícula.
- Haga clic en el botón Calcular para calcular las posiciones de cinco estados diferentes, que calcularán los desplazamientos entre cada uno de los estados y los reflejarán en la ventana de salida.
NOTA: Los valores de desvío se integran en los estados para su uso posterior (Figura 3). La alineación fina se realiza para proporcionar una alta precisión de la posición de cada estado (Figura 3). Esta fina alineación ayuda a identificar la posición exacta en los cinco estados. La alineación fina es fundamental para la adquisición de datos de una sola partícula. Por lo tanto, es muy recomendable realizar la alineación fina antes de la toma de imágenes.
6. Procedimiento de adquisición de datos utilizando Latitude-S
- Haga clic en la paleta Capturar.
NOTA: Generalmente, los datos del atlas se recopilan con un aumento bajo (115x) para visualizar la mayoría de los cuadrados de la cuadrícula. - Elija el tamaño del atlas para cubrir toda la cuadrícula o parte de la cuadrícula según el requisito (por ejemplo, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 u 8 x 12).
NOTA: El tamaño del atlas de 16 por 16 cubre toda la cuadrícula. - Haga clic en el botón Capturar para capturar el atlas.
NOTA: La ventana de navegación principal de Latitude-S se abre y llena el espacio disponible en DigitalMicrograph (Figura suplementaria S5). Tres paneles de imágenes en la ventana de navegación principal muestran imágenes de los estados del sistema con tres aumentos diferentes. El atlas general se muestra actualmente en su estado actual de adquisición en el panel más a la izquierda. Los mosaicos en el atlas se llenarán a medida que ocurra cada captura. - Seleccione el cuadrado de la cuadrícula en función del espesor del hielo navegando en el atlas (Figura suplementaria S5). Una vez que se seleccionan los cuadrados de cuadrícula deseados, haga clic en el botón Programar y observe cómo se llenan los mosaicos en el cuadrado de cuadrícula a medida que se captura cada cuadrado de cuadrícula.
- Haga clic en el botón Programar una vez que se seleccionen los cuadrados de cuadrícula.
- Seleccione un taladro representativo en el cuadrado de la cuadrícula añadiendo su posición. Una vez que se adquiere una imagen de agujero, defina los datos y las posiciones de enfoque y guarde el diseño como una plantilla (Figura suplementaria S6).
- Haga clic en Búsqueda automática, asigne el tamaño del taladro (por ejemplo, R1.2/1.3) y haga clic en el botón Buscar del programa, lo que hará que el programa Buscar encuentre automáticamente los orificios en función del diámetro del taladro. A continuación, haga clic en el botón Marcar para agregar la plantilla (Figura 4) y agregue marcas de círculo rojo en todos los agujeros de una cuadrícula o cuadrado de cuadrícula parcial.
- Configure la intensidad para eliminar los orificios del cuadrado de la cuadrícula y la contaminación por hielo (Figura 4).
NOTA: Finalmente, los taladros seleccionados se marcarán en amarillo para programar la recopilación de datos. - Haga clic en el botón Programar en las tareas de Latitude después de agregar los orificios a través de la búsqueda automática.
NOTA: Antes de programar la recopilación automatizada de datos, asegúrese de que el nivel del tanque de nitrógeno líquido sea suficiente, que la turbobomba del cargador automático esté apagada y que el espacio de la unidad RAID esté libre. El administrador de tareas latitude-S muestra el número de estados de atlas, cuadrado de cuadrícula, taladro y datos programados para la recopilación de datos (Figura 5). En la GUI de Latitude-S, se verán varios esquemas de color y se mostrará el significado de los diferentes esquemas de color: 1. Amarillo indica no programado; 2. Verde indica programado; 3. Azul indica Adquirido; 4. Rojo indica fallido.
7. Procesamiento de datos Cryo-EM
NOTA: El procesamiento de imágenes crio-EM de la proteína espiga se describe en detalle en la literatura reciente25.
- Realizar el procesamiento de imágenes de la proteína espiga del SARS-CoV2 utilizando RELION 3.011.
- Muestre las imágenes de película recopiladas con Latitude-S manualmente y realice la corrección de movimiento inducida por haz de las películas individuales utilizando el software MotionCor29. Realice el cribado inicial de las micrografías corregidas por movimiento manualmente con la ayuda del paquete de software cisTEM14.
NOTA: Casi el 85% de las micrografías adquiridas automáticamente eran de buena calidad, y los datos tenían señal dentro de 3.7-5.2 Å, que se calcula utilizando el software cisTEM14 (Figura suplementaria S7A, B). - Procesar los datos utilizando el paquete de software RELION 3.011.
- Elija las partículas de espiga manualmente y sumérjalas a la clasificación de clase 2D (Figura suplementaria S7C). Utilice la mejor clase 2D como referencia para seleccionar automáticamente 3,99,842 partículas de un solo pico de las micrografías utilizando la herramienta de selección automática RELION11.
NOTA: Se llevaron a cabo tres rondas de clasificación 2D antes de someter las partículas a la clasificación 3D (Figura suplementaria S8). Se seleccionaron aproximadamente 2,55,982 partículas individuales para la clasificación 3D, y el conjunto de datos se clasificó en seis clases. El refinamiento automático 3D final se realizó con la mejor clase; Se obtuvieron 85.227 partículas de espiga de la clasificación 3D. - Después del refinamiento automático, realice el refinamiento de desenfoque por partícula con los parámetros de inclinación del haz adecuados para mejorar la resolución. A continuación, someta las partículas al pulido bayesiano utilizando el paquete de software RELION 3.011. Finalmente, use el conjunto de partículas pulidas para otra ronda de refinamiento automático 3D usando RELION 3.011.
- Elija las partículas de espiga manualmente y sumérjalas a la clasificación de clase 2D (Figura suplementaria S7C). Utilice la mejor clase 2D como referencia para seleccionar automáticamente 3,99,842 partículas de un solo pico de las micrografías utilizando la herramienta de selección automática RELION11.
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Representative Results
En la situación actual de pandemia, la crio-EM juega un papel clave en la caracterización de las estructuras de varias proteínas del SARS-CoV-226,27,28,29, que pueden ayudar a desarrollar vacunas y fármacos contra el virus. Existe una necesidad urgente de esfuerzos de investigación acelerados con recursos humanos limitados para combatir la enfermedad por coronavirus de 2019. La adquisición de datos en crio-EM de una sola partícula es un paso lento pero crucial en la determinación de la estructura de las macromoléculas. Los desarrollos recientes en la adquisición automática de datos crio-EM han permitido una interferencia humana limitada en la recopilación de datos. El software Latitude-S es un importante paquete de software de adquisición automática de datos utilizado aquí para la recopilación automatizada de datos de la proteína espiga purificada del SARS-CoV2.
La adquisición de datos cryo-EM de la proteína espiga del SARS-CoV-2 se realizó con un cryo-EM de 200 keV equipado con un DED K2 Summit. Las ubicaciones para la adquisición de datos en la cuadrícula con espesor de hielo deseable y distribución de partículas se marcaron manualmente. Las posiciones se marcaron en paralelo durante la adquisición de datos que se produjo en segundo plano. En las posiciones marcadas, el software Latitude-S llevó a cabo la adquisición automatizada de datos a un aumento nominal de 42.200x al tamaño de píxel de 1,17 Å a nivel de muestra. La configuración para la recopilación de datos con un aumento de 42.200x ya estaba preestablecida y probada. Se registraron un total de 40 fotogramas durante 8 s con la dosis de electrones de 2 e−/Å2 por fotograma; por lo tanto, se utilizó una dosis total de 80 e−/Å2 para la recolección de datos (Figura suplementaria S9). Los datos se adquirieron en un rango de desenfoque de -0,75 μm y -2,25 μm, con 3.000 archivos de película recopilados en dos días. Cada 4 h, el software realizaba comprobaciones y ajustes periódicos para garantizar que todos los archivos de película recopilados durante 48 h fueran de buena calidad y que no hubiera cambio de haz o cambio de alineación. Los datos se recopilaron de forma independiente sin ninguna intervención humana. Además, Latitude-S detiene automáticamente las imágenes en el momento del llenado de nitrógeno líquido, lo que reduce la vibración innecesaria o la deriva mecánica en las imágenes.
Como se mencionó en la sección de protocolo, el cribado inicial de micrografías corregidas por movimiento se realizó manualmente utilizando el software cisTEM14. Sobre la base del cribado, se encontró que la mayoría de los datos estaban dentro del rango de señal de 3.7-5.2 Å (Figura suplementaria S7A). Esto sugiere que la recopilación automática de datos utilizando Latitude-S es buena, y la mayoría de los datos son adecuados para la reconstrucción 3D de alta resolución. Además, las imágenes se recogieron en el rango de desenfoque (-0,75 a -2,25 μm), y varios rangos de desenfoque fueron verificados manualmente por cisTEM14. Los datos adquiridos estaban muy cerca del rango de desenfoque de configuración en Latitude-S (Figura suplementaria S7A, B).
El procesamiento de datos se realizó utilizando el paquete de software RELION 3.011. Las partículas de espiga se seleccionaron manualmente para calcular los promedios de clase 2D. Varios detalles estructurales (hélice y hoja de β) son visibles en los promedios de clase 2D (Figura suplementaria S7C), lo que sugiere fuertemente que la caracterización estructural de alta resolución es posible utilizando este conjunto de datos. Sin embargo, la clasificación 3D también indica que la proteína espiga tiene un dominio de unión al receptor 1 (RBD) abierto hacia arriba y toda la conformación cerrada de RBD hacia abajo (Figura suplementaria S8). La clasificación 3D indica que la clase-1 tiene el número máximo de partículas, que aparecen como una conformación abierta 1-RBD. Además, la clase-3 y la clase-4 tienen un número similar de partículas, y ambos modelos parecían tener toda la conformación cercana a RBD. Sin embargo, la clase-5 muestra una conformación intermedia, donde 1-RBD está en una posición intermedia. Sin embargo, las conformaciones abiertas 1-RBD de la proteína espiga se reconstruyeron utilizando la simetría C1, y la resolución general es de 4.4 Å (Figura 6 y Figura suplementaria S10). Del mismo modo, toda la conformación cercana de RBD (clase-3 y clase-4) se refinaron junto con la simetría C3, y la resolución general a 0.143 FSC es ~ 3.9 Å (Figura 7).
El procesamiento general de la imagen indica que la proteína espiga adopta todos los RBD hacia abajo y 1-RBD hacia arriba conformación abierta. Además, se identificó una conformación intermedia de la proteína espiga. La estructura crio-EM de alta resolución del subdominio S2 de la proteína espiga indica las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos individuales (Figura 6B y Figura 7C). Todas las reconstrucciones 3D y los resultados de la crio-EM son muy similares a los hallazgos de la literatura publicada recientemente25. Sin embargo, la estructura crio-EM de alta resolución de la proteína espiga se caracterizó en 15 días, lo que solo es posible gracias a los protocolos automáticos de adquisición de datos crio-EM y al software automático de selección de partículas. Por lo tanto, los paquetes de software de adquisición automática de datos, incluido Latitude-S, pueden contribuir significativamente a la caracterización de varias estructuras crio-EM de alta resolución de macromoléculas biológicas.
Figura 1: Flujo de trabajo de adquisición automatizada de datos mediante Latitude-S: Pasos generales a seguir antes de la recolección de datos (preparación de la cuadrícula, carga de muestras y ajuste del microscopio). La adquisición de datos es la parte principal de este manuscrito, y se destaca la tubería a seguir durante la adquisición de datos. Abreviaturas: crio-EM = crio-microscopía electrónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración de diferentes estados para la recopilación de datos de una sola partícula utilizando la GUI de Latitude-S. (A) Paquete de software Latitude-S para la adquisición de datos en el traje de software DM3. B) Flujo de trabajo del procedimiento de adquisición de datos. C) Ampliación de cada grupo. Abreviatura: GUI = interfaz gráfica de usuario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Alineación fina para configurar una alta precisión para el enfoque y la adquisición de imágenes. La alineación fina se realiza en cinco estados a. Atlas, b. Hole, c. Data, d. Grid, e. Focus. Enfoca cada estado colocando la marca roja en la misma posición. Es muy recomendable realizar la alineación fina antes de comenzar cualquier nueva sesión, lo que ayudará a realizar imágenes en una posición particular. La adquisición de imágenes en una posición particular (sin ningún cambio importante) depende completamente de la precisión de la alineación fina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Selección automática de taladros mediante Latitude-S. La búsqueda automática de agujeros para la adquisición de datos se lleva a cabo automáticamente en función del tamaño del agujero. (A) Muestra la posición del vector de búsqueda de agujeros para la búsqueda automática de los agujeros. Barra de escala = 20 μm. (B) Muestra el marcado de agujeros utilizando el vector de búsqueda de agujeros y ajustando la intensidad para eliminar el marcador del área fronteriza y la contaminación por hielo. Barras de escala = 20 μm (izquierda) y 10 μm (centro). (C) Muestra la adición automática de los orificios para la obtención de imágenes (amarillo). Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Vista en vivo de la adquisición de datos. (A) Las posiciones se marcan en amarillo, verde, azul y rojo en función del estado de la adquisición de datos en cada posición. (B) Código de color para monitorear el estado de la adquisición de datos. Verde: Programado, Amarillo: No programado, Azul: Adquirir, Rojo: Fallido. El panel izquierdo muestra varios agujeros de color verde (programado) y algunos agujeros marcados de azul (adquiridos); barra de escala = 10 μm. El panel central muestra un aumento de 4.300x de un agujero individual. En esta imagen de un agujero (panel central), el cuadro cuadrado azul muestra el área de enfoque y el cuadro cuadrado verde muestra la región de imagen; barra de escala = 1000 nm. El panel derecho muestra la imagen adquirida. El panel del extremo derecho muestra los números de imagen programados, el tiempo total requerido para la obtención de imágenes y cuántas imágenes están programadas para la obtención de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Modo Spike 3D con 1RBD abierto. (A) El mapa de proteínas de espiga autofinado y afilado de 1-RBD abierto se representa en las vistas lateral, superior e inferior. (B) El mapa EM está equipado con una estructura cristalina para una mejor visualización de las cadenas laterales. Las regiones resaltadas en el mapa tienen densidades para cadenas laterales. Abreviaturas: 3D = tridimensional; RBD = dominio de unión al receptor; EM = microscopía electrónica; NTD = N- dominio terminal; S1 = subunidad 1; S2 = subunidad 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Toda la conformación de cierre hacia abajo de RBD de la proteína espiga. (A) Mapa de proteína de espiga autodefinida y afilada de toda la conformación de cierre hacia abajo de RBD representada en vistas laterales y superiores. (B) El mapa EM está equipado con una estructura cristalina para una mejor visualización de las cadenas laterales. Las flechas muestran que las regiones del mapa tienen densidades para cadenas laterales (C). Abreviaturas: RBD = dominio de unión al receptor; EM = microscopía electrónica; NTD = N- dominio terminal; S1 = subunidad 1; S2 = subunidad 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: GUI de adquisición de imágenes Latitude-S: Varios controladores de microscopio (por ejemplo, válvula de columna abierta/cerrada, inserción/retracción de pantalla son controlados por la GUI Latitude-S. La válvula de columna, la cámara, el estado de la pantalla y el llenado de nitrógeno líquido se podían controlar en el panel izquierdo. En la parte inferior de este panel, varios parámetros de calibración aparecen en verde (por ejemplo, ampliación, inclinación del haz, enfoque objetivo). Si algún parámetro aparece en negro, indica que el parámetro no está optimizado correctamente. Por lo tanto, todos los parámetros deben optimizarse antes de comenzar cualquier nueva sesión. Abreviatura: GUI = interfaz gráfica de usuario. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Representación del estado Atlas. Diferentes estados del Atlas que muestran los cuadrados de cuadrícula y el tipo de hielo formado. (A-F) También se destacan varios tamaños de Atlas. (A, B, D, F) Se resalta un patrón de hielo grueso. (C, D) Se resaltan los cuadrados rotos. El hielo grueso y las regiones rotas (marcadas en la figura) no son adecuadas para la obtención de imágenes. (E, F) Buenos cuadrados de cuadrícula para imágenes; A, B, C, D y F muestran los cuadrados de cuadrícula adecuados para imágenes de alta resolución. Sin embargo, los cuadrados de rejilla de hielo grueso y los cuadrados de cuadrícula rotos deben excluirse. Barras de escala = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E) y 25 μm (F). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Representación del estado de la cuadrícula y el estado del agujero. El estado de cuadrícula y el estado de taladro correspondiente se muestran en la imagen. (A, E) El agujero vacío, (F, G) hielo grueso, (E) contaminación por hielo y (A, B, C, D, E y G) el espesor de hielo adecuado está marcado en la imagen. Se seleccionan orificios de espesor de hielo adecuados para la adquisición de imágenes (A, B, C, D, E y G). Barras de escala = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S4: Referencia de orificio para imágenes automáticas. La imagen del agujero (QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) se captura y se guarda para futuras referencias. El tamaño de la referencia del orificio podría variar en función de los diferentes tipos de rejillas. Se recomienda capturar siempre la referencia del taladro antes de comenzar cualquier nueva sesión. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S5: Panel de captura de imágenes con varios aumentos y selección de taladros. (A) El panel de captura muestra la configuración para la adquisición de datos. (B) La ventana de navegación principal de Latitude-S muestra tres aumentos consecutivos. En el estado Atlas (150x), los cuadrados de cuadrícula se seleccionan para la adquisición de datos (panel izquierdo, barra de escala = 50 μm). En aumentos más altos (380x), se enfoca un solo cuadrado (panel central, barra de escala = 20 μm). Con un aumento más alto (4.300x), se enfocan los orificios dentro de cada cuadrado (panel derecho, barra de escala = 5 μm). Sin embargo, estos aumentos cambiarían de acuerdo con el tamaño y la forma de las rejillas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S6: Creación de una plantilla para la selección de taladros y la creación de imágenes. La generación de plantillas se realiza agregando una posición en el orificio para los datos, y el foco se coloca adyacente al orificio en la superficie de carbono. El foco debe colocarse en el área de carbono para que el diámetro del haz no toque ningún orificio adyacente. Barras de escala = 20 μm (panel izquierdo), 10 μm (panel central), 1000 nm (panel derecho). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S7: Imágenes crio-EM del SARS-CoV2 utilizando Latitude-S y detección de imágenes. (A) Selección de micrografías adquiridas: ajuste 1D CTF, ajuste CTF 2D y parámetros CTF; estimación de los datos de la proteína espiga del SARS-CoV2 utilizando cisTEM. El ajuste 1D CTF y el anillo Thon muestran que la señal general es 4.8 Å. (B) Las micrografías a dos valores de desenfoque diferentes de la proteína espiga se adquieren utilizando Latitude-S. Barras de escala = 50 nm. (C) Promedio final de la clase 2D. El promedio de la clase 2D muestra las vistas superior, inferior y lateral de la proteína espiga. Todos los detalles de alta resolución son visibles en promedios de clase 2D. Abreviaturas: crio-EM = crio-microscopía electrónica; 1D = unidimensional; 2D = bidimensional; CTF = función de transferencia de contraste; SARS-CoV2 = coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S8: Procesamiento de datos de datos de datos de proteína espiga del SARS-CoV2 adquiridos utilizando el software Latitude-S. La imagen muestra el flujo de trabajo seguido para procesar los datos crio-EM de la proteína espiga. La clasificación 3D de la proteína espiga se realiza utilizando Relion 3.0. La clase-1 muestra la conformación abierta 1-RBD. Clase-3 y Clase-4 muestran todos los RBD hacia abajo de la conformación cercana de la proteína espiga. La clase 5 muestra la conformación intermedia de la proteína espiga. Abreviaturas: crio-EM = crio-microscopía electrónica; 3D = tridimensional; RBD = dominio de unión al receptor; SARS-CoV2 = coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S9: Imagen fraccionada por dosis capturada como referencia para la adquisición final de la imagen. Las imágenes de fraccionamiento de dosis se capturan con una exposición de 8.0 s y una exposición de 0.2 s / cuadro. Haga clic en el botón Guardar automáticamente cerca de la cámara para guardar los archivos de película automáticamente. Después de la adquisición de la imagen, haga clic en la imagen y guarde los parámetros de la imagen fraccionada por dosis utilizando el botón actualizado de la imagen en el estado de recopilación de datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S10: Distribución angular y correlación de la capa de Fourier del mapa de proteínas de espiga de conformación abierta del SARS-CoV-2 1 generado. (A) Distribución angular del modelo 3D final de 1-RBD hasta la conformación abierta de la proteína espiga. El azul representa valores más bajos y el rojo representa valores más altos de la distribución de partículas normalizadas. (B) Curva de correlación de la concha de Fourier que muestra una resolución de 4,4 Å de la conformación abierta 1-RBD de la proteína espiga, estimada en el punto de corte. Abreviaturas: 3D = tridimensional; RBD = dominio de unión al receptor; SARS-CoV2 = coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave; FSC = Correlación de la cáscara de Fourier. Haga clic aquí para descargar este archivo.
| Estado de la imagen del atlas | Atlas 115 |
| Magnificación | 115, Tamaño de píxel 34.7 nm |
| Desenfoque indicado | 4,38 mm |
| Tamaño del punto | 8 |
| Brillo | 934400 |
| Modo | IMAGINGILM |
| Binning | 1 |
| Tiempo de exposición | 1,0 años |
| Estado de la encuesta de cuadrícula | Cuadrícula 380 |
| Magnificación | 380, Tamaño de píxel 11.2 nm |
| Desenfoque indicado | 2,37 mm |
| Tamaño del punto | 8 |
| Brillo | 626200 |
| Modo | IMAGINGILM |
| Binning | 1 |
| Tiempo de exposición | 1,0 años |
| Estado de hole Survey | Hoyo 3400 |
| Magnificación | 3,400, Tamaño de píxel 1.20 nm |
| Desenfoque indicado | -0,75 μm |
| Tamaño del punto | 7 |
| Diámetro del haz | 8,81 μm |
| Modo | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Tiempo de exposición | 1,0 años |
| Estado de enfoque | Enfoque 45k |
| Magnificación | 45,000, Tamaño de píxel 0.0924 nm |
| Desenfoque indicado | 4,51 μm |
| Tamaño del punto | 6 |
| Diámetro del haz | 0,716 μm |
| Modo | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Tiempo de exposición | 1,0 años |
| Estado de Acqisition | Datos 45k |
| Magnificación | 45,000, Tamaño de píxel 0.0924 nm |
| Configuración de desenfoque | Mín.: -4.500 nm, Máx.: -1.500 nm, Pasos: 250 nm |
| Tamaño del punto | 6 |
| Diámetro del haz | 0,752 μm |
| Modo | IMAGINGILM,SA,Mh |
| Binning | 1 |
| Tiempo de exposición | Exposición total de 8 s para 20 fotogramas |
| Configuración de la cámara | Contado, Ganancia normalizada, Defecto corregido |
| Configuración de guardado de datos | MRC |
Tabla 1: Resumen de la configuración del estado de Latitude-S.
| Especificación | K2 Base | Cumbre K2 |
| Voltaje de funcionamiento TEM | 200-400 kV | |
| Área activa del sensor | 19,2 mm × 18,6 mm | |
| Tamaño del sensor en píxeles | 3838 × 3710 | 7676 × 7420 Super- Resolución |
| Físico al tamaño de píxel | 5 μm | |
| Binning | 1–8x | |
| Lectura del sensor | Cualquier área arbitraria | |
| Ampliación relativa a la película | 1.3–1.5x | |
| Velocidad de lectura del sensor | 50 fps completos | 400 fps completos |
| Velocidad de transferencia a la computadora | 8 fps completos | 40 fps completos |
| Visualización de imágenes | 8 fps completos | 10 fps completos |
| Rendimiento DQE (300 kV) | >0.30 (pico) >0.25 a 0.5 de Nyquist físico | >0.7 (pico) >0.50 a 0.5 de Nyquist físico >0.06 a 1.25 de Nyquist físico |
| Software | Gatan Microscopy Suite incluyendo DigitalMicrograph |
Tabla 2: Especificaciones de la cámara.
| Opción de configuración | Valor |
| Tipo de microscopio | Talos Arctica G2 |
| Alta tensión | 200 kV |
| Fuente | XFEG |
| Lente | Crio Gemelo |
| Sistema de vacío | Talos TMP IGP |
| Cargador de muestras | Autocargador |
Tabla 3: Configuración del microscopio.
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Discussion
Latitude-S es una interfaz de usuario intuitiva, que proporciona un entorno para configurar y recopilar automáticamente miles de micrografías de alta resolución o archivos de película en dos días. Proporciona una fácil navegación a través de las rejillas y mantiene la posición de la etapa del microscopio mientras se mueve de bajo aumento a alto aumento. Cada paso de la adquisición de datos con Latitude-S es eficiente en el tiempo, con características como una interfaz de usuario simple, transmisión rápida de datos a una velocidad de hasta 4.5 GB / s y visualización simultánea de datos durante la adquisición. Además, los parámetros de fraccionamiento de dosis precalibrados, tasa de dosis, enfoque y aumento se recargaron fácilmente para iniciar una nueva sesión de adquisición automática de datos y ahorrar tiempo.
Adquirir datos automáticamente en ausencia de un monitoreo constante y sin comprometer la calidad del conjunto de datos es una tarea desafiante y lenta. La recopilación automatizada de datos mediante el software Latitude-S es conveniente cuando el tiempo y los recursos son limitaciones importantes, especialmente durante esta pandemia. Sin embargo, varias estructuras crio-EM de varias proteínas del SARS-CoV-2 se han resuelto en los últimos meses, lo que ayudará a las compañías farmacéuticas a desarrollar vacunas. Diferentes laboratorios utilizan diferentes tipos de paquetes de software de recopilación automática de datos para recopilar datos. Utilizamos Latitude-S con un K2 Summit DED para la recopilación automática de datos crio-EM en rejillas de carbono perforadas o rejillas recubiertas de GO caseras30.
Ese estudio se realizó utilizando los parámetros mencionados anteriormente en la sección de protocolo, lo que proporciona pruebas sólidas de que Latitude-S es un paquete de software adecuado e ideal para la recopilación automática de datos para crio-EM de una sola partícula. Sin embargo, es muy recomendable seguir ciertos protocolos antes de iniciar la toma de imágenes utilizando una cámara K2. La cámara de detección directa K2 requiere rutinas básicas de mantenimiento para lograr el máximo rendimiento. El recocido regular de la cámara a 50 ° durante 24 h ayuda a que el sensor funcione de manera óptima al reducir el ruido de fondo y la contaminación a nivel de la superficie. Sin embargo, después del recocido de la cámara, la actualización de la ganancia y las referencias oscuras de la cámara es un paso obligatorio (tarda ~ 45 minutos) antes de realizar cualquier adquisición de imagen.
Aunque Latitude-S es un paquete de software estable y fácil de usar para la recopilación automática de datos crio-EM, es esencial optimizar varios parámetros (aumentos, tamaño del punto, brillo y tasa de dosis) en 5 estados diferentes de Latitude-S al principio. La ampliación de los orificios o estados de la cuadrícula depende del tamaño de los orificios de las rejillas agujereadas o los tipos de rejillas agujereadas (por ejemplo, R2/2 o R1.2/1.3 o R 0.6/1). Por ejemplo, el tamaño del orificio de la rejilla de tipo R0.6/1 es de 0.6 μm, y el tamaño del orificio de la rejilla R2/2 es de 2 μm. Por lo tanto, se requieren dos tipos diferentes de aumento para visualizar los orificios correctamente para los tipos de cuadrícula R0.6/1 y R2/2 en los estados de cuadrícula y agujero en Latitud-S.
Por lo tanto, la configuración de ampliación para varios tipos de cuadrículas en 5 estados diferentes será variable. El tamaño del punto y el brillo dependen en gran medida de la ampliación. Por lo tanto, estos valores pueden cambiar a diferentes valores de aumento. Por lo tanto, se recomienda optimizar los diversos parámetros de los 5 estados diferentes de Latitude-S utilizando diferentes tipos de cuadrículas crio-EM antes de iniciar la adquisición automática de datos. Sin embargo, una vez que todos los parámetros están optimizados y guardados, es fácil recargar todos los parámetros en función de los requisitos del usuario y usar Latitude-S en diferentes aumentos o tipos de cuadrícula.
Un beneficio importante de usar K2 con Latitude-S es que los usuarios pueden regular fácilmente la válvula de apertura / cierre del haz, insertar / retraer la cámara, insertar / retraer la pantalla de fósforo del microscopio y regular el llenado de nitrógeno líquido utilizando la GUI de Latitude-S. Sin embargo, no se puede acceder a ninguna otra opción (como la inclinación del cañón, el desplazamiento del cañón, el desplazamiento del haz, los puntos de pivote, el centrado de apertura C2, el centro de rotación, la alineación sin coma) a través de la pestaña GUI K2 Latitude-S (Figura suplementaria S1 y Figura 2). Durante las largas horas de recopilación de datos, la posición del haz puede cambiar.
Latitude-S puede ejecutar comprobaciones y correcciones periódicas automatizadas para realizar un seguimiento de la estabilidad del sistema durante todo el período de adquisición de datos. La estabilidad del sistema se mantiene centrando el haz y actualizando las referencias oscuras. La comprobación constante garantiza la alta calidad de los datos adquiridos. En Latitude-S, la altura eucéntrica (altura Z) se corrige solo una vez antes de la recopilación de datos, y la altura eucéntrica es calculada automáticamente por Latitude-S cuando cambia el cuadrado de la cuadrícula. El enfoque se mide y ajusta automáticamente en función del rango de enfoque definido por el usuario. El programa restablecerá la posición de la etapa Z si excede el valor de umbral dado. Esta estabilidad se controla a través de la paleta Estabilidad del sistema. Sin embargo, al igual que otros paquetes de adquisición automática de datos, Latitude-S también tiene algunas limitaciones.
Latitude-S no puede calcular la altura eucéntrica (altura Z) si la cuadrícula es desigual. En este escenario, no puede recopilar ningún dato o los valores de desenfoque estarán completamente fuera del rango. Por lo tanto, los usuarios deben ser extremadamente cautelosos para preparar sus cuadrículas sin ninguna curva e imaginar solo cuadrículas de superficie plana utilizando Latitude-S. Además, a diferencia de Leginon, SerialEM y UCSF-Image, Latitude-S no es un paquete de software disponible gratuitamente. Latitude-S es compatible con las cámaras Gatan, incluidas las cámaras de detección directa K2, K3 y K3 base filtradas o independientes, así como las cámaras Rio y OneView. Otra desventaja importante para los usuarios es que no es compatible con otros DED populares como Falcon DED. Sin embargo, esto también es cierto para EPU, otro paquete de software de adquisición automática de datos, que está disponible con criocromiscopios y solo es compatible con la cámara Falcon. Sin embargo, EPU también es funcional con K2 / K3 con un filtro de energía (BioQuantum K3 Imaging Filter) pero no con una cámara K2 / K3 independiente.
Latitude-S es bastante similar a EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation y Leginon, que son paquetes de software utilizados para la adquisición automática de datos para cryo-EM de una sola partícula. Sin embargo, Latitude-S solo es compatible con K2 DED, K3 DED o BioQuantum K3 Imaging Filter. Además, la compañía proporciona soporte técnico continuo para los usuarios de Latitude-S. Este soporte técnico es beneficioso para pequeños grupos de usuarios, que necesitan usar los dispositivos K2 DED, K3 DED o BioQuantum K3 Imaging Filter para la adquisición de datos y no tienen conocimientos previos sobre cómo configurar o usar paquetes de software libre como SerialEM y Leginon.
Hay muchas otras características, como la difracción de electrones microcristales (microED), la tomografía y la espectrometría de rayos X de dispersión de energía (EDS), que están disponibles en varias otras versiones de Latitude. Por lo tanto, los usuarios pueden utilizar el mismo paquete de software para la recopilación de datos en otros modos. Hasta donde sabemos, la recopilación de datos para microED, tomografía y EDS no está disponible en EPU ni en ningún otro paquete de software. Por lo tanto, este paquete de software Latitude podría ser útil para diferentes propósitos, además de la adquisición automática de datos en cryoEM de una sola partícula. Sin embargo, SerialEM y Leginon, ambos paquetes de software libre, son adecuados para cámaras Falcon o K2 / K3 y son extremadamente útiles para los nuevos usuarios. Sin embargo, Latitude-S no está disponible gratuitamente, lo que podría ser una desventaja de este paquete de software.
En resumen, la herramienta de adquisición automática de datos Latitude-S es tan buena como otros paquetes de software de adquisición automática de datos (por ejemplo, EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image). Latitude-S es un paquete de software de adquisición de datos extremadamente estable y fácil de usar, que está disponible con cámaras de detección directa K2, K3 y K3 base filtradas o independientes, así como cámaras Rio y OneView.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses competitivos o financieros que declarar.
Acknowledgments
Reconocemos al Departamento de Biotecnología, al Departamento de Ciencia y Tecnología (DST) y Ciencia, y al Ministerio de Desarrollo de Recursos Humanos (MHRD), India, por la financiación y la instalación de crio-EM en IISc-Bangalore. Reconocemos el Programa DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) y DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) para la instalación nacional de Cryo-EM en IISc, Bangalore. Agradecemos el apoyo financiero de la Junta de Investigación en Ciencia e Ingeniería (SERB) (Subvención No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 y SERB-IPA/2020/000094), DBT (Subvención No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Agradecemos a la Sra. Ishika Pramanick por preparar las rejillas crio-EM, la recopilación de datos crio-EM y la preparación de la Tabla de Materiales. También agradecemos al Sr. Suman Mishra por el procesamiento de imágenes crio-EM y por ayudarnos a preparar las figuras. Agradecemos al Prof. Raghavan Varadarajan por ayudarnos a obtener la muestra de proteína espiga purificada para este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
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