Biology

Nagetier-Östruszyklus-Überwachung mit vaginaler Lavage: So etwas wie ein normaler Zyklus nicht

Published: August 30, 2021 doi: 10.3791/62884

Hannah Robert¹, Lindsay Ferguson¹, Olivia Reins², Tiffany Greco¹, Mayumi L. Prins¹, Michael Folkerts²

¹Department of Neurosurgery, Brain Injury Research Center, UCLA, David Geffen School of Medicine, ²Department of Psychology, Pepperdine University, Seaver College

Summary

Diese Studie beschreibt die entscheidenden Faktoren, die bei experimentellen Designs mit weiblichen Ratten zu berücksichtigen sind. Im weiteren Sinne dienen diese Daten dazu, die Stigmatisierung zu verringern und die Entwicklung umfassenderer Diagnose- und Interventionsinstrumente zu unterstützen.

Abstract

Die aktuelle Methodik etabliert einen reproduzierbaren, standardisierten und kostengünstigen Ansatz zur Überwachung des Östruszyklus weiblicher Sprague Dawley (SD) heranwachsender Ratten. Diese Studie zeigt die Komplexität der Hormonzyklen und das breite Spektrum des Verständnisses, das erforderlich ist, um eine zuverlässige und valide Überwachungstechnik zu konstruieren. Durch eine eingehende Untersuchung der wichtigsten experimentellen Design- und Verfahrenselemente bietet diese Beschreibung des Zyklus und seiner Grundprinzipien einen Rahmen für das weitere Verständnis und dekonstruiert Missverständnisse für die zukünftige Replikation.

Zusammen mit einem Überblick über den Probenentnahmeprozess unter Verwendung von vaginaler Lavage beschreibt das Verfahren den Mechanismus der Datenkategorisierung in das vierstufige Modell von Proestrus, Östrus, Metestrus und Diestrus. Diese Stadien sind durch einen neuen vorgeschlagenen Ansatz gekennzeichnet, der die 4 kategorisierenden Determinanten des vaginalen Flüssigkeitszustands, des Zelltyps (der vorhandenen Zelltypen), der Zellanordnung und der Zellmenge zum Zeitpunkt der Sammlung verwendet. Variationen jeder Stufe, günstige und ungünstige Stichproben, die Unterscheidung zwischen Zyklizität und Azyklizität sowie grafische Darstellungen der gesammelten Kategorisierungskomponenten werden neben effektiven Interpretations- und Organisationspraktiken der Daten präsentiert. Insgesamt ermöglichen diese Tools erstmals die Veröffentlichung quantifizierbarer Datenbereiche, was zur Standardisierung von Kategorisierungsfaktoren bei der Replikation führt.

Introduction

Neue Beiträge
Der Östruszyklus von Nagetieren wurde als wesentlicher Indikator für das Wohlbefinden identifiziert. Unbewusste Vorurteile der Forscher und ungenaue Interpretationen in Bezug auf den weiblichen Körper behindern jedoch die wissenschaftliche Gemeinschaft. Die Etymologie des Wortes "Östrus" impliziert ein Gefühl von Minderwertigkeit und Negativität. Euripides benutzte den Begriff, um eine "Raserei" oder einen Wahnsinn zu beschreiben, Homer, um Panik zu beschreiben, und Platon, um einen irrationalen Antrieb zu beschreiben. Diese Studie zeigt, wie diese urzeitlichen Perspektiven die aktuelle wissenschaftliche Gemeinschaft beeinflussen, und adressiert diese Bedenken durch ein neuartiges Mosaikparadigma - eine aktualisierte Kombination zuvor untersuchter Methoden, die im Rahmen eines umfassenderen Ansatzes erweitert wurde.

Das Studium und die Verwendung dieser Technik sind erstens notwendig, da es keine standardisierte und umfassende Überwachungstechnik gibt und die Dateninterpretationspraktiken unklar sein können. Zweitens, obwohl die Merkmale des Östruszyklus von einzelnen untersuchten Ratten abhängen, sind sie oft universellisiert. Drittens, während hormonelle Zyklen routinemäßige und nützliche Prozesse sind, sind sie von einem gefährlichen Stigma umgeben, das im Abschnitt "Übersetzung an den Menschen" untersucht wird. Diese Studie zielt darauf ab, diese drei Probleme auf drei Arten anzugehen: (A) durch die Beschreibung einer eingehenden Östruszyklusüberwachungstechnik und die Klärung, wie die Ergebnisse interpretiert werden können, (B) durch die Skizzierung von Methoden, die die Integrität und Individualität jedes Zyklus aufrechterhalten, und (C) durch die Aufmerksamkeit auf Missverständnisse, die unbegründete Praktiken aufrechterhalten.

Diese Studie ist auch einzigartig in ihrem Fokus auf jugendliche Ratten, eine Periode, die durch entscheidende Entwicklungsveränderungen gekennzeichnet ist, die Licht auf verschiedene verhaltensbezogene, anatomische und physiologische Manifestationen im Erwachsenenalter^{werfen 1}. Der Aufbau eines standardisierten experimentellen Designs zur Überwachung der Hormonzyklen in einer wenig erforschten Population bei gleichzeitiger Dekonstruktion gemeinsamer Verzerrungen ermöglicht die Entwicklung zuverlässiger und gültiger hormoneller Korrelationen ^2,3,4 und die Bestimmung zustandsabhängiger Zyklusstörungen 5,6,7,8,9,10 . Letztendlich dienen diese Neuheiten dazu, diagnostische Kriterien, Behandlungen und Interventionen verschiedener Wellness-Anliegen zu erweitern.

Grundlegende Definitionen und Verwendungen
Der Östruszyklus ist eine Sammlung dynamischer physiologischer Prozesse, die als Reaktion auf die drei oszillierenden weiblichen Sexualsteroidhormone auftreten: Östradiol, leuteinisierendes Hormon (LH) und Progesteron (Abbildung 1A, B). Wechselwirkungen zwischen dem endokrinen und dem zentralen Nervensystem regulieren den Zyklus, der meistens 4-5 Tage anhält und vom Beginn der sexuellen Reifung bis zur reproduktiven Seneszenz und / oder Beendigung wiederkehrt. Es ist in separate Kategorien unterteilt, die auf dem Hormonspiegel basieren - am häufigsten in die 4 Stadien von Diestrus (DIE), Proestrus (PRO), Estrus (EST) und Metestrus (MET), die kreisförmig verlaufen. Die Anzahl der Divisionen kann je nach Art der Studie 13 zwischen 3 Stufen¹¹ und¹³ Stufen¹² liegen. Die geringere Anzahl von Abteilungen schließt MET oft als Phase aus und klassifiziert es als eine kurze Übergangsperiode. Die höhere Zahl umfasst typischerweise Unterabschnitte, die eine genauere Untersuchung von Phänomenen wie Tumorentwicklung oder spontaner Pseudoschwangerschaft, dem physiologischen Zustand der Schwangerschaft ohne embryonale Implantation 12,14,15, ermöglichen.

In dieser Studie wurden die Stadien durch Komponenten des Vaginalkanals identifiziert, die als 3 kategorisierende Determinanten - Zelltyp (n), Zellanordnung und Zellmenge bezeichnet werden (Abbildung 2A-D). Während der Zustand der Vaginalflüssigkeit in dieser Studie nicht überwacht wurde, wird empfohlen, sie als vierte kategorisierende Komponente einzubeziehen. Weitere Informationen zur Untersuchung der Vaginalflüssigkeit finden Sie in der Referenzliste¹⁶. Die kategorisierenden Komponenten können untersucht werden, indem Zellen über vaginale Lavage extrahiert werden, die primäre Technik, die in der modernen Überwachung des Östruszyklus empfohlen wird. Während die eingehenden physiologischen Prozesse innerhalb jeder Phase außerhalb des Rahmens dieser Studie liegen, finden Sie weitere Informationen in der Literatur¹⁷.

Die Verwendung und Weiterentwicklung dieser Überwachungstechnik des Östruszyklus beruht auf den Verbindungen zwischen Sexualsteroidhormonen und der Funktion von Körpersystemen wie dem Herz-Kreislauf-System¹⁸, dem endokrinen System⁸ und dem zentralen Nervensystem 19,20,21. Gleichzeitig ist eine Überwachung des Östruszyklus möglicherweise nicht immer erforderlich, wenn weibliche Nagetiere beteiligt sind ^22,23,24,25. Vielmehr ist es wichtig zunächst zu prüfen, ob in dem spezifischen Studienbereich geschlechtsspezifische Unterschiede berichtet wurden, die in veröffentlichten Reviews^22,23 weiter untersucht werden können. Obwohl die Überwachung des Östruszyklus in einem breiten Spektrum von Forschungsuntersuchungen von entscheidender Bedeutung ist, sollte sie nicht als Hindernis für die Einbeziehung weiblicher Nagetiere in Experimente angesehen werden. Während diese Technik komplex und zeitaufwendig erscheinen mag, kann das Verfahren selbst je nach Prüfer weniger als 15 Minuten dauern und ist kostengünstig. Insgesamt ist die Einbeziehung weiblicher Nagetiere in wissenschaftliche Studien vorteilhaft für das Verständnis von Körpersystemen, verschiedenen Zuständen und Pathologien sowie für das allgemeine Wohlbefinden, da diese Entwicklungen hauptsächlich auf der männlichen Körpervorlage basieren.

Universelle Parameter und natürliche Variabilitäten beim Nagetier
Die Festlegung von Bereichen für Aspekte, die als "typisch" angesehen werden, ist notwendig, um Standardzyklusmuster zu definieren, Parameter für vergleichende und analytische Zwecke festzulegen und Anomalien und Ausreißer zu erkennen. Gleichzeitig ist es auch wichtig zu erkennen, dass der Zyklus jeder Ratte einzigartig ist und Abweichungen aufgrund von Tierstamm, physiologischen Prozessen und Umweltbedingungen erwartet werden. Tatsächlich ist einer der "normalsten" Aspekte des Östruszyklus die Variabilität. Dies zeigt sich in der Gesamtzykluslänge mit einem Bereich von 3-38 Tagen^26,27; das Alter der sexuellen Reifung, das von 32-34 Tagen bis zu mehreren Wochen^{reichen kann 28,29,30}; was als azyklisch 11 und die kategorisierenden Determinantenmuster^{als 11,13} gilt. Insgesamt gibt es keine universelle Vorlage für den Östruszyklus, und dies sowohl für die wissenschaftliche Gemeinschaft als auch für die breite Öffentlichkeit zu übersetzen, ist ein wichtiger Teil des experimentellen Prozesses.

Experimentelle Zeitpunkte und Entwicklungsalter
Die Anerkennung dieses Variabilitätsprinzips hilft beim Aufbau eines zuverlässigen und gültigen Versuchsdesigns. Zum Beispiel hängt der Beginn der Überwachung des Östruszyklus von der anatomischen und physiologischen Entwicklung der Ratten ab, die je nach Umwelt- und physiologischen Faktoren variiert. Die Überwachung kann erst mit der Entwicklung der Vaginalöffnung (VO) beginnen, bei der es sich um die äußere Vaginalöffnung handelt, die von der Vulva umgeben ist und zum inneren Teil des Vaginalkanals führt (Abbildung 3A-D). Während sich die VO oft im Alter zwischen 32 und 34 Tagen vollständig entwickelt, bleibt sie für jedes Subjekt individualisiert, und vieles über den Prozess bleibt unbekannt. Diese Öffnung wurde verwendet, um den Beginn der Geschlechtsreifung zu identifizieren, der mit dem Anstieg von^{Östradiol 31}, der Reifung der Hypothalamus-Hypophysen-Ovarialachse 32 und dem ersten Eisprung bei Ratten 17,33,34,35 in Verbindung gebracht wurde. Neuere Veröffentlichungen haben jedoch ergeben, dass es nur ein indirekter Marker für die reproduktive Entwicklung ist, da es sich von hormonellen und entwicklungsbedingten Ereignissen in ungünstigen Umgebungen entkoppeln^{kann 31} und Veränderungen des Östradiolspiegels anstelle der sexuellen Reifung darstellen^{kann 33}. Daher wird empfohlen, sich nicht nur auf die VO zu verlassen, um das Entwicklungsalter zu bestimmen und als Qualifikator für die Überwachung des Östruszyklus³⁶ zu verwenden, sondern auch das Auftreten des ersten EST-Stadiums und die Verhornung der^{Epithelzellen 30} zu nutzen, um den Beginn der sexuellen Reifung zu markieren.

Das Körpergewicht korreliert bei Nagetieren^30,37 Jahren deutlich mit dem Entwicklungsalter während der Adoleszenzzeit und kann daher auch bei der Bestimmung des Entwicklungsalters in diesem Zeitraum helfen. Zu den vorgeschlagenen Mechanismen im Zusammenhang mit diesem Phänomen gehören die Stimulation von Hormonen, die für die Fortpflanzungsentwicklung notwendig sind, wie Wachstumshormon, und die Hemmung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse (HPA) durch den Appetitregulator^{Leptin 30}. Es wird jedoch nicht empfohlen, dieses Maß als einzigen Indikator für das Entwicklungsalter zu verwenden, da die Varianz zwischen Ratten zwischen den Arten und den Anbietern^{groß ist 38}. Die Variabilität, die bei der Entwicklung der VO und des Körpergewichts beobachtet wurde, veranschaulicht die Bedeutung des Konzepts im gesamten experimentellen Prozess.

Übersetzung an den Menschen: kulturelle und wissenschaftliche Kontexte
Die translationale Beziehung von Tier-zu-Mensch-Fortpflanzungsstudien ist bidirektional. Die Ergebnisse tierbasierter Studien beeinflussen, wie die menschlichen Prozesse bewertet, angegangen und analysiert^{werden 39}. Die Wahrnehmung des menschlichen Fortpflanzungssystems und der damit verbundenen Prozesse beeinflussen, wie Tiere untersucht werden. Tatsächlich ist einer der lautesten Hinweise auf weitere Forschung in diesem Bereich auf voreingenommene soziokulturelle Überzeugungen im Zusammenhang mit hormonellen Zyklen, die den wissenschaftlichen Prozess beeinflussen. Viele dieser Konventionen leiten sich aus einer allgemeinen kulturellen Abneigung gegen die Diskussion über die Menstruation ab, die zu einer Datenlücke in gut fundiertem Wissen geführt^{hat 40,41}. Dies hat ein Spektrum von Konsequenzen, die von geringfügig bis tödlich reichen - von Regalhöhe und Smartphone-Größe bis hin zu Polizei-Körperpanzeranpassung und verpassten Krebsdiagnosen⁴².

Die Beschreibung der Menstruation als unhygienisch, destruktiv und toxisch - gesehen in verehrten Texten, Medien, Wörterbüchern und medizinischen Lehren - wird von wissenschaftlichen Publikationen konserviert. Dies geschieht durch ungenaue und voreingenommene Beschreibungen von Hormonzyklen, die Isolierung des Fortpflanzungssystems von seinen neuroendokrinen Gegenstücken und Umwelteinflüssen und die reduktionistische Perspektive der Vollendung eines Zyklus als "Versagen der Empfängnis^"43,44. Dies führt zur Schaffung unsolider experimenteller Praktiken, wie dem Weglassen externer Variablen, die hormonelle Zyklen beeinflussen, der Bestimmung von Start und Endpunkten, die ausschließlich auf anatomischen Entwicklungen basieren, und der Messung des Zyklusfortschritts in linearer und nicht zirkulärer Weise. Trotz der direkten Korrelation zwischen soziokulturellen Faktoren und biologischen Konsequenzen wird sie in der wissenschaftlichen Literatur nicht oft berücksichtigt. Durch die Inspektion ganzheitlicherer Publikationen^43,44,45 können Forscher diese Stigmata dekonstruieren und zuverlässigere und validere experimentelle Designs erstellen.

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Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Handhabungs- und Verfahrensmethoden stimmen mit den Tierpflege- und Verwendungsrichtlinien der National Institutes of Health (NIH) überein und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Pepperdine University und dem Animal Research Committee (ARC) des UCLA-Kanzlers genehmigt.

1. Tierpflege und -verwendung

Erwerben Sie weibliche Ratten in Zahlen gemäß der Leistungsanalyse und männliche Ratten, um den Whitten-Effekt oder ein konsistenteres Radfahren^{zu fördern 46}. Bestimmen Sie die Dehnung basierend auf dem Ziel der Studie in bekannten Datenbanken⁴⁷.
HINWEIS: Die aktuellen Daten spiegeln die des weiblichen SD International Genetic Standardization Program (IGS) in Anwesenheit von männlichen SD-Ratten wider, die sich sowohl an der Pepperdine University als auch an den UCLA-Labors im Rahmen einer gemeinsamen Studie befinden. Diese Ratten kamen im Alter von 28 Tagen in getrennten Gruppen an, und die Progression des Brunstzyklus wurde entweder für 10 oder 20 Tage überwacht, um Unterschiede auf akuten und chronischen Ebenen zu zeigen, beginnend im Alter von 34 Tagen (nach einer 7-tägigen Akklimatisierungsphase).
Planen Sie vor der Handhabung eine Quarantäne und/oder eine Eingewöhnungsphase zur physiologischen Stabilisierung nach dem Transport und der Anpassung an die neue Umgebung ein.
HINWEIS: Es wurde ein Mindestzeitraum von 3 Tagen angegeben, wobei ein Zeitraum von 7 Tagen^{empfohlen wird 48,49,50,51,52}. Insgesamt hängt dies von den Transportbedingungen, der Tierbelastung und den Studienzielen ab.
Stellen Sie sicher, dass Stress durch die Verwendung einer Akklimatisierungsphase reduziert wird, da Stress die ordnungsgemäße Funktion des Fortpflanzungssystems stören kann⁵³. Überkompensieren Sie jedoch nicht, indem Sie versuchen, es zu beseitigen, da ein moderater Stress für das Wohlbefinden der Tiere von Vorteil ist⁵¹.
Wirtsratten in einer temperatur- (68-79 ° F, dh 20-26 ° C) und feuchtigkeitskontrollierten (30-70%) Umgebung, indem Sie das Vivarium oder Laborleiter kontaktieren und diese Eigenschaften sicherstellen. Verteilen Sie Wasser und Chow ad libitum mit Nährstoffkomponenten, die auf der Website des Unternehmens aufgeführt sind, und reinigen Sie den Käfig einmal pro Woche.
HINWEIS: In dieser Studie wurden die Ratten in Gruppen von 2 Personen untergebracht, die nach Geschlecht in 19 "x 10" x 8" klaren wiederverwendbaren Kunststoffkäfigen getrennt waren und Zugang zu Maiskolbenbettwäsche hatten, die einmal pro Woche gewechselt wurde. Die Temperatur wurde bei 70 ° F und die Luftfeuchtigkeit bei 35-79% gehalten, mit einem Durchschnitt von 62%.
Überprüfen Sie die Entwicklung einer Ringschwanz- oder ischämischen Nekrose des Schwanzes und der Zehen auf Hinweise auf niedrige relative Luftfeuchtigkeit und extreme Temperaturen, die den Wechsel biologischer Reaktionen verursachen können.
HINWEIS: Temperatur und Luftfeuchtigkeit sind wichtig für das Fortpflanzungssystem, die sexuelle Reifung und die Östruszyklizität^{54,55,56,57,58}.
Stellen Sie eine ordnungsgemäße und ausgewogene Beleuchtung im gesamten Wohnraum sicher, indem Sie im gesamten Laborraum gleiche Mengen an Lichtquellen ablegen, die auf ein zeitgesteuertes Licht-zu-Dunkel-System wirken.
HINWEIS: Hier wurde ein 12:12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus mit eingeschaltetem Licht von 06:00 bis 18:00 Uhr von linearen 2.550-Lumen-LED-Lampen gesteuert.
Befolgen Sie die Lux-Anforderungen⁵², basierend auf Variationen der Pigmentierung, des Alters, des Stammes, des Geschlechts und des Hormonstatus der Tiere.
HINWEIS: Wenn Forscher die gesammelten Zellproben kategorisieren, ermöglicht eine konsistente Beleuchtung eine ordnungsgemäße visuelle Erkennung und ein zuverlässiges Staging⁵⁹. Die Dauer und Intensität des Lichts stehen in direktem Zusammenhang mit dem Fortpflanzungssystem, der sexuellen Reifung und dem Östruszyklus 54,55,56,57,60,61.

2. Ausrüstung und Versuchsvorbereitung

Überprüfen Sie die Kategorisierungsdeterminanten (siehe Abbildung 2A): Wie man jede Stufe des Östruszyklus identifiziert und wie man das Mikroskop und die Kameraausrüstung bedient.
Stellen Sie sicher, dass jedes zu überwachende Subjekt die sexuelle Reifung erreicht hat und geeignete Indikatoren für die Entwicklung aufweist - VO, Körpergewicht und Alter. Wiegen Sie die Ratten und untersuchen Sie sie jeden Tag zur gleichen Zeit auf VO für genaue Vergleiche und übertragen Sie sie mit einer zugelassenen Handhabungsmethode. Wenden Sie sich an den an der Universität angeschlossenen Tierarzt, wenn ein Tier mehr als 20% seines vorherigen Körpergewichts verliert.
HINWEIS: Die VO bleibt kaudal zur Harnröhrenöffnung und der Schädel zum Anus, der sich zwischen den beiden befindet, wie in Abbildung 3 dargestellt.
Da diese Faktoren belastungsabhängig sind, erkundigen Sie sich beim Lieferanten nach Spezifikationen und berücksichtigen Sie die für das Labor spezifischen Umweltfaktoren⁶².
HINWEIS: Im Allgemeinen tritt dies zwischen 32 und 34 Tagen und einem durchschnittlichen Körpergewicht zwischen 75 und 150 Gramm⁶³ für SD-Ratten auf und wird durch eine kreisförmige Öffnung angezeigt, die zuvor von einer membranösen Hülle bedeckt war.
Wählen Sie einen Probenentnahmezeitraum aus, der für die Gruppe der überwachten Ratten geeignet ist, um die Entnahme von Übergangsproben zu verhindern. Probieren Sie zunächst einige Tiere zu 2 oder 3 verschiedenen Zeitpunkten im Laufe des Tages, um die Zeit zu bestimmen, zu der die meisten Zyklusphasen vorhanden sind (z. B. Probenahme um 12:00 Uhr, 13:00 Uhr und 14:00 Uhr für verschiedene Tiere). Schließen Sie die vaginale Spülung jeden Tag zur gleichen Zeit ab, um eine konsistente und zuverlässige Inszenierung zu gewährleisten.
HINWEIS: Es wurde berichtet, dass die Stunden zwischen 12:00 und 14:00 Uhr am besten geeignet sind, um alle Etappen einzufangen. In dieser Studie fand die Überwachung des Östruszyklus zwischen 12:00 und 14:00 Uhr statt, wobei das Halten im Kompressionsstil erfolgte (siehe Schritt 3.4). Die Bedeutung des Timings der Überwachung des Östruszyklus im Vergleich zu anderen experimentellen Interventionen (z. B. Verhaltenskonditionierung, Medikamente) ist ein sich entwickelndes Forschungsgebiet und kann weiter erforscht^{werden 11}. Die Bestimmung der Dauer des Östruszyklus-Monitorings ist studienabhängig und kann in veröffentlichten Studien^11,33 weiter untersucht werden.
Entfernen Sie die Schutzhülle vom Mikroskop und befestigen Sie die Kamera am Computer, indem Sie die Schutzobjektivabdeckung der Kamera entfernen und das Objektiv über das Okular des Mikroskops legen.
Öffnen Sie dann die vorausgewählte Software auf dem Computer. Um die in dieser Studie ausgewählte Software zu verwenden, wählen Sie unter der Registerkarte Kameraliste die Kamera aus, die an den USB-Anschluss auf der linken Seite des Bildschirms angeschlossen ist. Stellen Sie sicher, dass die USB-Kamera ordnungsgemäß an den Computer angeschlossen ist, wodurch No Device unter der Registerkarte Camera List (Kameraliste) angezeigt wird, falls dies nicht der Fall ist.
Sobald die USB-Kamera unter der Registerkarte ausgewählt wurde, schalten Sie den Mikroskoplichtschalter ein, der sich auf der Basis befindet.
Erstellen Sie einen Ordner auf dem Computer, der für die Zellenbeispielfotos vorgesehen ist. Erstellen Sie einen Dateiordner für jeden einzelnen Tag, an dem Daten gesammelt werden, und bereiten Sie ihn vor, bevor Bilder aufgenommen werden.
Wenn die Ausrüstung vorbereitet ist, holen Sie den Käfig des Probanden aus seinem Halteplatz und bringen Sie ihn zur Probenentnahmestation.

3. Sammlung von Vaginalzellen

Holen Sie sich eine Einwegspritze und füllen Sie jede der Spritzen mit 0,2 ml sterilem 0,9% NaCl. Wenn Luftblasen vorhanden sind, streichen Sie vorsichtig mit der Fassspritze, bis alle Luftblasen die offene Spitze der Spritze erreicht haben, und stoßen Sie die Luft aus. Wenn noch Luftblasen vorhanden sind, stoßen Sie die Lösung wieder in den NaCl-Behälter aus und füllen Sie nach, bis keine vorhanden sind.
HINWEIS: Übermäßiges Flackern kann zur Bildung von mehr Luftblasen führen.
Geben Sie jede Spritze in die Kunststoffverpackung zurück, um ein steriles Feld aufrechtzuerhalten, wobei sich die Spitze der Spritze innerhalb des versiegelten Teils der Verpackung befindet.
Öffnen Sie den Käfig und heben Sie das Subjekt vorsichtig entweder an der Basis des Schwanzes oder am Rumpf des Körpers an und schließen Sie den Deckel des Käfigs, um zu verhindern, dass andere aussteigen. Wählen Sie eine der unten aufgeführten Haltungsmethoden aus, die auf persönlichen Vorlieben und der Reaktion der Tiere basiert.
Verwenden Sie den Kompressionsstil für jugendliche Ratten, indem Sie das Subjekt gegen die obere Brustregion legen, wobei die Nase des Probanden auf den Boden zeigt. Bevor Sie mit dem Tupfer beginnen, stellen Sie sicher, dass das Subjekt ausreichend komprimiert ist, um eine Bewegung zu verhindern, aber bequem und sicher im Griff ist. Legen Sie den Vaginalkanal des Subjekts frei, indem Sie den Schwanz sanft beugen, bevor Sie die Spritze einführen.
Verwenden Sie den Hind Leg Lift für erwachsene Ratten, indem Sie die Vorderpfoten des Tieres entweder auf die Oberseite oder die Seite des Käfigs legen, während der Schwanz und die Hinterbeine mit einem sanften Halt zwischen dem ersten und zweiten Finger zurückgehalten werden, so dass der Daumen frei bleibt, um die Spritze⁶⁴ zu bedienen.
Ermöglichen Sie den Tieren, sich an die Handhabung und Überwachung zu gewöhnen. Behandeln Sie die Tiere sanft und dennoch sicher, um übermäßigen Stress abzubauen und den Forscher vor Aggressionen wie Beißen zu schützen.
HINWEIS: Die ersten Tage der Überwachung führen möglicherweise nicht zu den gewünschten Ergebnissen, da sich die Tiere an ihre Bedingungen gewöhnen. Der Umgang mit den Tieren, um Körpergewichte während der Akklimatisierungsphase zu sammeln, kann diesen Übergang^{unterstützen 33}.
Während Sie die Spritze mit Zeigefinger und Mittelfinger ruhig halten, führen Sie die Spitze der Spritze (nicht mehr als 2 mm) in einem Winkel parallel zum Vaginalkanal ein. Schleusen Sie den NaCl langsam in den Kanal, indem Sie den Kolben nach innen drücken. Führen Sie die Spritze nicht weiter in den Kanal ein, da dies den Östruszyklus stören kann.
Extrahieren Sie das NaCl aus dem Vaginalkanal, indem Sie den Kolben der Spritze von der Epithelauskleidung wegziehen (nach oben). Wenn es Schwierigkeiten gibt, das Subjekt während dieses Vorgangs im Griff zu halten, legen Sie es für eine kurze Ruhezeit zurück in den Käfig, bevor Sie die NaCl-Extraktion versuchen.
Sobald die Zellprobe entnommen wurde, legen Sie das Subjekt zurück in den Käfig und wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Tier, bevor alle Proben unter dem Mikroskop ausgewertet werden.
HINWEIS: Alternativ kann jede Probe gesammelt und ausgewertet werden, bevor sie zum nächsten Tier übergeht. Ein Tier kann eine zweite Lavage benötigen, wenn die Probe nicht kategorisiert werden kann. Die gleiche Spritze aus der ursprünglichen Sammlung kann wiederverwendet werden, wenn sie die Kochsalzlösung nicht direkt im Behälter und nur für dasselbe Tier berührt.

4. Stichprobenauswertung

Beginnen Sie mit der Kategorisierung, indem Sie die extrahierte Vaginalflüssigkeitsprobe untersuchen. Notieren Sie die Viskosität entweder viskos oder nicht viskos und die Färbung als undurchsichtig oder transparent auf dem Beschreibungsdokument oder einem anderen Aufzeichnungssystem.
HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls kann zum Zeitpunkt der Probenentnahme oder später durchgeführt werden.
Stoßen Sie 2-3 Tropfen der Flüssigkeit auf einen Objektträger aus und legen Sie ein Mikroskop-Deckglas auf den Objektträger. Legen Sie das Deckglas auf den Objektträger von der Oberseite des Objektträgers nach unten oder von einer Seite des Objektträgers zur anderen, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern. Wenn möglich, lassen Sie etwa die Hälfte der gesammelten Probe in der Spritze, wenn eine weitere Untersuchung erforderlich ist, und um zu verhindern, dass eine überschüssige Menge Flüssigkeit auf den Objektträger gegeben wird.
Suchen Sie die gesammelten Zellen, indem Sie den Objektträger über die Bühne bewegen. Wenn zu wenige Zellen oder eine hohe Menge an Ablagerungen vorhanden sind, stoßen Sie die verbleibende Flüssigkeit auf einen neuen Objektträger aus und untersuchen Sie sie erneut. Wenn die in der Spritze verbleibende Probenmenge nicht ausreicht oder wenn der zweite Tropfen ähnliche Probleme aufweist, entnehmen Sie dem Subjekt eine weitere Probe, bevor Sie versuchen, das Östruszyklusstadium zu identifizieren.
Sobald die Zellen gefunden wurden und bevor Sie den Computer oder die Computertastatur berühren, entfernen Sie den einen Handschuh, um eine Verschmutzung der Tastatur zu verhindern.
Erfassen Sie Bilder der Zellproben, indem Sie auf die Funktion Snap auf der linken Seite des Software-Bedienfelds klicken.
Speichern Sie dann die Datei, indem Sie unter dem Dateisymbol in der oberen linken Ecke der Seite auf Speichern unter klicken. Speichern Sie das Foto in einem vorbeschrifteten Ordner auf dem Computer.
HINWEIS: Beispiel für eine Etikettenvorlage: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective verwendete Linse.
Nehmen Sie mehr als ein Foto an jedem Objektivobjektiv auf, wenn sich nicht viele Zellen in jedem Rahmen befinden.
HINWEIS: Beispielbeschriftungen für mehrere Bilder: #1_01/09/2021_EST_4x1 und #1_01/09/2021_EST_4x2.
Wiederholen Sie den Vorgang für jede gesammelte Probe unter mehreren Objektivlinsen. Schließen Sie mindestens eine kleinere Objektivierung, z. B. 4x, und mindestens eine größere Objektivierung, z. B. 20x, ein.
Laden Sie die Bilder auf ein freigegebenes Laufwerk / einen freigegebenen Ordner oder eine externe Festplatte hoch, damit alle beteiligten Forscher Zugriff auf die Dateien haben und Sicherungskopien verfügbar sind.

5. Stufenkategorisierung

Richten Sie den Computerbildschirm so ein, dass gleichzeitig die aufgenommenen Fotos und das Aufnahmeblatt angezeigt werden (Abbildung 4A-C).
HINWEIS: Auf diese Weise kann die Dokumentation während der Anzeige der gesammelten Probe erfolgen. Dieser Teil des Protokolls kann zum Zeitpunkt der Probenentnahme oder später abgeschlossen werden.
Bestimmen Sie, welche Zelltypen in der Probe vorhanden sind. Wählen Sie anhand der Kriterien eine der vier Optionen aus, die in den Schritten 5.2.1-5.2.4 aufgeführt sind, und zeichnen Sie die Ergebnisse auf.
1. Anukleierte keratinisierte Epithelzellen (AKE)/verhornte Epithelzellen
  1. Suchen Sie nach gezackten oder eckigen Zellen, wie in Abbildung 2B und Abbildung 5C zu sehen, die trotz des Fehlens von Kernen leichte runde Bereiche (Kerngeister) innerhalb der Zelle zeigen können, die darstellen, wo einst ein Kern vorhanden war. Verwenden Sie eine höhere Vergrößerung, z. B. 20x und höher, um zwischen solchen kernhaltigen und anukleierten Zellen zu unterscheiden.
  2. Verwenden Sie eine höhere Vergrößerung, um den keratinisierten oder verhornten Teil der Zelle zu unterscheiden - eine dünne Schicht von Zellen, denen Kerne fehlen und die mit Keratin gefüllt sind - falls gewünscht.
    HINWEIS: Zusätzlich zu ihrem gezackten Aussehen können diese auch dadurch unterschieden werden, wie sie sich falten oder zerlegen können, wodurch gezackte und längliche Strukturen entstehen, die als Keratinstäbe bekannt sind.
2. Große kernhaltige Epithelzellen (LNE)
  1. Suchen Sie nach diesen typischerweise runden bis polygonal geformten Zellen, die von unregelmäßigen, gezackten oder eckigen Rändern umgeben sind.
  2. Beobachten Sie, wie ihre Kerne verschiedene Formen annehmen können, die von intakt bis degeneriert oder pykontisch reichen und sich auf die irreversible Kondensation von Chromatin im Kern einer Zelle beziehen, die sich dem Tod oder der Verschlechterung unterzieht, wie in Abbildung 2B und Abbildung 5D1,2 zu sehen ist. Beachten Sie, dass diese Kerne weniger Platz einnehmen als das Zytoplasma innerhalb der Zelle, mit einem niedrigeren Kern-Zytoplasma-Verhältnis (N: C) als die kleinen Epithelzellen. Achten Sie auf zytoplasmatische Granulate, die bei höheren Vergrößerungen¹³ zu sehen sind.
3. Leukozyten (LEUs)/Neutrophile/polymorphkernige Zellen
  1. Suchen Sie nach diesen kompakten, kugelförmigen Zellen mit multilobulierten Kernen (daher als polymorphkernige Zellen bekannt), die mit zunehmender Zellreife verschwinden (Abbildung 2B und Abbildung 5A). Eine höhere Vergrößerung (z. B. 40x) kann verwendet werden, um die mehrfach lobulierten Kerne zu beobachten.
    HINWEIS: Bei der Sammlung und Vorbereitung können diese Zellen kondensieren, falten oder reißen.
4. Kleine kernhaltige Epithelzellen (SNE)
  1. Achten Sie auf diese runden bis ovalen Zellen, die größer sind als die oben beschriebenen Neutrophilen.
  2. Beobachten Sie die runden Kerne dieser nicht keratinisierten Epithelzellen (Abbildung 2B), die eine größere Menge an Platz einnehmen als das Zytoplasma in der Zelle, wodurch ein höheres N: C-Verhältnis im Vergleich zu großen Epithelzellen entsteht.
    HINWEIS: Beim Sammeln und Vorbereiten können sich diese Zellen falten oder überlappen, um eine Form zu erzeugen, die einer Schnur oder einem Balken ähnelt, wie in Abbildung 5B1 dargestellt.
Untersuchen Sie, wie die im Beispiel vorhandenen Zellen für jede Objektivierung organisiert sind. Verwenden Sie die untere Objektivierung, z. B. 4x, um eine repräsentative Ansicht der gesamten Zellanordnung anzuzeigen. Notieren Sie, ob die Zellen verklumpt (C), gleichmäßig dispergiert (ED) oder zufällig dispergiert (RD) sind (siehe Abbildung 4C), und notieren Sie die spezifische Organisation jedes Zelltyps (z. B. sind kleine kernhaltige Epithelzellen verklumpt und Neutrophile sind gleichmäßig verteilt).
Als nächstes schätzen und notieren Sie visuell die Gesamtzellmenge (ein bisschen, mäßig, zahlreich) und die einzelnen Zellmengen (Prozentsatz jedes vorhandenen Zelltyps).
HINWEIS: Ein Smidge stellt die kleinste Anzahl vorhandener Zellen dar, die zur Bestimmung der Stichprobenkategorisierung verwendet werden können, zahlreiche stellen das Vorhandensein einer unzähligen Anzahl von Zellen dar, die entweder den größten, wenn nicht den gesamten Platz auf dem Objektträger ausmachen oder übereinander gestapelt sind, und eine moderate Anzahl von Zellen stellt eine vergleichsweise durchschnittliche Anzahl von Zellen dar (Beispiele in Abbildung 5A-D und Abbildung 6A-D).
Beachten Sie, ob es Abweichungen von den aufgeführten Kriterien oder von Aspekten gibt, die für das spezifische Thema in der Kategorie "Anomalien" typisch sind, und konsultieren Sie bei Bedarf einen Tierarzt.
Bestimmen Sie, welche Östruszyklusstufe in der Stichprobe dargestellt wird, indem Sie die kategorisierenden Komponenten und die folgenden Beschreibungen verwenden.
1. Sterben
  1. Suchen Sie nach LEUs als dominantem oder einzigem Zelltyp, die zu Beginn des DIE verklumpt angeordnet sind, aber in späten Stadien stärker verstreut sind.
    HINWEIS: Während des Übergangs in DIE kann die Menge der Zellen abnehmen, wenn die Epithelzellen zu zerfallen beginnen, wie in Abbildung 6D1 zu sehen ist. Gleichzeitig beginnt die Anzahl der LEUs zuzunehmen, und sie neigen dazu, zunächst verklumpt angeordnet zu sein und sich im Laufe der Zeit zu zerstreuen.
  2. Beachten Sie, dass die Gesamtmenge der Zellen vergleichsweise niedrig sein kann, meistens in den späteren Stadien der DIE-Periode, am zweiten oder dritten Tag.
  3. Beobachten Sie die hohe Menge an Schleim, die in dieser Phase vorhanden sein kann, die sich als konzentrierte Stränge von LEUs darstellt (Abbildung 5A1). Achten Sie auf kleine Klumpen oder Zellstränge von SNE-Zellen, die die LEUs in späten Phasen des Übergangs zu PRO begleiten (Abbildung 5A1,2).
  4. Beobachten Sie das viskose und undurchsichtige Erscheinungsbild der Vaginalflüssigkeit beim Übergang in DIE, beim vollständigen Übergang in und beim Übergang aus dem DIE.
    HINWEIS: Die durchschnittliche Dauer dieser Phase beträgt 48 h während eines 4-Tage-Zyklus und möglicherweise 72 h während eines 5-Tage-Zyklus.
2. Profi
  1. Suchen Sie nach SNE-Zellen als dominanten Zellen und nach LEUs, LNE und / oder AKE-Zellen, die in geringer Anzahl zu sehen sind. Verwenden Sie eine hohe Objektivierung, um das körnige Erscheinungsbild der SNE-Zellen zu beobachten, die typischerweise in dieser Phase in Clustern, Blättern oder Strängen angeordnet sind (Abbildung 5B1,2).
  2. Beobachten Sie das viskose und undurchsichtige Aussehen der Vaginalflüssigkeit, wenn Sie von DIE in PRO übergehen, und wie es nicht viskos und transparent wird, sobald es vollständig in das PRO-Stadium übergegangen ist (durchschnittliche Dauer von 14 h bei Ratten).
3. Est
  1. Achten Sie auf die Dominanz von AKE-Zellen, eine Verringerung der SNE-Zellen in EST und eine Zunahme der Anzahl und Größe der Zellen, da EST weiterhin^11,13 anhält.
  2. Beachten Sie das Unterscheidungsmerkmal der oft gruppierten Anordnung von AKE-Zellen in Form von Keratinstäben oder Geisterkernen, die sich beim Übergang von PRO (Abbildung 6B) und zu MET (Abbildung 6C) zufälliger ausbreiten können.
  3. Beobachten Sie die charakteristische nichtviskose und transparente Vaginalflüssigkeit, die erwartet werden kann, wenn die Ratten in EST übergehen, vollständig in EST übergehen und aus ihr übergehen.
    HINWEIS: Die Progression von EST beinhaltet eine starke Diversifizierung (Abbildung 5C und Abbildung 6B, C). Das Stadium tritt typischerweise für durchschnittlich 24 h in einem 4-Tage-Zyklus oder möglicherweise 48 h in einem 5-Tage-Zyklus auf.
4. Traf
  1. Achten Sie auf eine höhere Anzahl von SNE- und ^LNE-Zellen, wenn die Ratte in MET übergeht, entweder dominant in Bezug auf den Zellanteil innerhalb des Kanals oder fast gleich hoch wie die LEUs^11,13. Notieren Sie sich außerdem die größere Menge an Trümmern in MET und die Übergänge als in anderen Stadien aufgrund des Epithelzellzerfalls nach EST und der Bewegung in DIE.
  2. Beachten Sie das Fehlen einer konsistenten Anordnung, da alle Zelltypen in verschiedenen Mengen gesehen werden (Abbildung 5D1-3). Achten Sie jedoch auf die LEUs, die in den Anfangsstadien in der Nähe der Epithelzellen gepackt oder verklumpt sind, die beim Übergang in DIE zur verklumpten Anordnung zurückkehren können.
  3. Beobachten Sie das nicht viskose und transparente Aussehen der Vaginalflüssigkeit in diesem Stadium und die Veränderung zu einem viskoseren und undurchsichtigeren Aussehen, während Sie sich in DIE bewegen.
    HINWEIS: Die durchschnittliche Dauer dieser Phase beträgt 6-8 h.
Beschriften Sie Proben in Übergängen mit dem Stadium, auf das sich das Subjekt zubewegt, wobei der Übergang in Klammern zu verfolgen ist, wann diese gesammelt werden. Weitere Informationen zur Unterscheidung zwischen diesen 4 Stufen und ihren Übergängen finden Sie in den repräsentativen Ergebnissen.
HINWEIS: Da die gesammelten Proben statisch sind und der Zyklus dynamisch ist, können die Objektträger Übergänge zwischen den Stufen darstellen (siehe Abbildung 6A-D).
Schließen Sie diesen Vorgang für jedes Tier ab, bis die Überwachungsphase abgeschlossen ist.
An Tag 11 (45 Tage alt) oder 21 (55 Tage alt) euthanasieren Sie die Ratten mit 5% Isofluran und 2% Sauerstoff vor einer Guillotine-Enthauptung. Diese Zeitpunkte können je nach Art der Studie variieren.

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Representative Results

Die aktuellen Daten spiegeln die des weiblichen SD International Genetic Standardization Program (IGS) in Anwesenheit von männlichen SD-Ratten wider. Diese Tiere wurden im Rahmen einer gemeinsamen Studie sowohl in den Labors der Pepperdine University als auch der UCLA gefunden. Abbildung 5 zeigt mehrere Variationen der 4 Zyklusstufen. Abbildung 5A1 wurde als Diestrusprobe mit mehreren Zelltypen identifiziert. Dieses Beispiel zeigt, dass Proben mit einer größeren Anzahl von Epithelzellen als Diestrus gelten, wenn sie die anderen Qualifikationen der Kategorisierungskomponente erfüllen, z. B. eine Dominanz von LEUs. Diese Probe zeigte auch die Schleimstranganordnung, die häufig in diesem Stadium zu sehen ist, zusammengesetzte LEUs, die den Strängen ähneln, die aus SNE-Zellen bestehen, die im PRO-Stadium beobachtet wurden. Um einen Schleimstrang im DIE-Stadium von den Strängen zu unterscheiden, die im PRO-Stadium aus SNE-Zellen auftreten, ist es wichtig, die Dominanz von LEUs zu identifizieren. Abbildung 5A2,3 zeigt eine häufig beobachtete Progression der Zellanordnung – eine anfängliche Verklumpung der LEUs, die in späteren Perioden des DIE-Stadiums gesammelt und zu einer zufälligen (RD) oder sogar Auszahlung (ED) bewegt werden. Insbesondere war Abbildung 5A2 eine DIE-Probe mit zahlreichen vorhandenen Zellen. Dies spiegelt wider, wie die LEUs auch von einer hohen Anzahl von Epithelzellen begleitet werden können (Abbildung 5A1,2), die sich von Metestrus durch eine Dominanz von LEUs und das Fehlen von Keratinstäben unterscheiden. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 5A3, dass eine niedrige Gesamtzellzahl (ein Smidge) häufig während der späteren Phase des DIE-Stadiums, z. B. während des zweiten oder dritten Tages, beobachtet wurde. Während der PRO-Phase wurden die SNE-Zellen häufig in Strängen angeordnet, wobei zahlreiche Zellen übereinander gestapelt waren (Abbildung 5 B1) oder ein Stück Zellen in kleineren Klumpen angeordnet waren (Abbildung 5B2). Abbildung 5B3 veranschaulicht eine PRO-Probe mit der charakteristischen blattartigen Verklumpung von SNE-Zellen, die sich überlappen und Balken bilden, die mit den Keratinstäben verwechselt werden könnten, die aus AKE-Zellen bestehen, die im EST-Stadium vorhanden sind. Um die beiden zu unterscheiden, ist es wichtig, die Dominanz von SNE-Zellen in PRO und von AKE-Zellen in EST zu identifizieren.

Abbildung 5C1,2 zeigt die typische Verklumpung und zufällige Auszahlung von AKE-Zellen, die in EST beobachtet wurden, wobei erstere zahlreiche Zellen und letztere eine moderate Anzahl umfasst. Geisterkerne, Keratinstabbildungen und Bakterien, die oft in diesem Stadium gesammelt werden, sind in diesen Beispielen zu sehen. SNE-Zellen wurden während der EST-Phase (Abbildung 5C1) zeitweise als Überbleibsel der vorherigen PRO-Stufe dargestellt. Das späte EST-Stadium, in dem SNE-Zellen auftauchen, wenn sich das Subjekt in Richtung MET bewegt, wird oft mit dem PRO-Stadium verwechselt. Um die beiden zu unterscheiden, ist es wichtig, die Kerngröße zu berücksichtigen. Im Allgemeinen haben die kernhaltigen Zellen von PRO ein höheres N:C-Verhältnis. Die in Abbildung 5C3 gezeigte Stichprobe zeigte eine strangartige Anordnung zahlreicher AKE-Zellen, die nicht als Merkmal des EST-Stadiums angesehen wurde. Dies zeigt, dass jedes Tier einzigartig ist, dass es zu Abweichungen von den Kriterien kommen kann und dass die Kategorisierungsdeterminanten in Kombination zu untersuchen sind.

Um zwischen EST und PRO zu unterscheiden, wenn SNE-Zellen vorhanden sind, wurde beobachtet, dass in diesen Zellen während der EST-Phase ein niedrigeres N:C-Verhältnis auftrat. Um die in EST vorhandenen Keratinstäbe von denen zu unterscheiden, die durch die Überlappung oder das Rollen von SNE-Zellen im PRO-Stadium gebildet werden (Abbildung 5B3), und solchen, die von zerfallenden Epithelzellen im Übergang von MET gebildet werden (Abbildung 6D1), ist es wichtig, den dominanten Zelltyp, die Anordnung und die Menge zu identifizieren, um das dargestellte Stadium zu unterscheiden. Schließlich veranschaulicht Abbildung 5D1,2 die Kombination aller Zelltypen, die in der zufälligen Auszahlung vorhanden sind, die die MET-Stufe darstellt. Zusätzlich zu den zahlreichen Zellen, die in diesen Beispielen vorhanden sind, war es üblich, in diesem Stadium eine höhere Menge an Trümmern zu sammeln (Abbildung 5D2) aufgrund des Zerfalls von Epithelzellen nach EST und des Übergangs in DIE mit einer Dominanz von LEUs, die den Vaginalkanal von Epithelzellen reinigen. Abbildung 5D2 zeigt auch, wie MET von DIE durch seine höhere Konzentration von Epithelzellen und das Vorhandensein von Keratinstäben unterschieden werden kann. Insgesamt stellen diese Darstellungen das breite Spektrum dar, das innerhalb jeder Stufe vorhanden ist, und sind nicht erschöpfend.

Darstellungen der 4 Übergangsphasen sind in Abbildung 6 dargestellt. Während diese Studie Proben im Übergang als eine der 4 Östruszyklusphasen kategorisierte, bleibt es wichtig, die Übergangsphasen richtig zu identifizieren. Beim Übergang von DIE zu PRO (Abbildung 6A) kam es häufig zu einer allgemeinen Abnahme der Anzahl der LEUs und einer Zunahme der Anzahl der SNE-Zellen. LNE- und AKE-Zellen waren in diesem Übergang zeitweise vorhanden, wenn auch nicht in hohen Mengen (Abbildung 6A1). Abbildung 6A2-4 zeigt die höhere Anzahl von verklumpten und zufällig dispergierten SNE-Zellen, die während dieses Übergangs häufig gesammelt wurden, mit einer geringen Anzahl von zufällig und gleichmäßig verteilten LEUs. Insgesamt war es bei der Unterscheidung von anderen Übergangsstadien wichtig, die Dominanz von SNE-Zellen und den Beginn von Klumpen und Strangbildungen zu beachten, die bei PRO beobachtet wurden. Alle Beispiele in Abbildung 6A stellen eine Vielzahl von Zellen mit Ausnahme von Abbildung 6A4 mit einem kleinen Fleck dar. In Abbildung 6B zeigt das Bild ein Beispiel für zahlreiche verklumpte SNE- und AKE-Zellen, die beim Übergang von PRO zu EST zu sehen sind.

Während dieses Übergangs ist zu sehen, dass SNE-Zellen in höherer Anzahl mit weniger verklumpten und mehr zufälligen Auszahlungen von AKE-Zellen als während EST sind. Abbildung 6C zeigt die Entstehung von AKE, SNE und LNE und die Abnahme von AKE-Zellen beim Übergang von EST zu MET mit einer hohen Anzahl von Zellen. Die vorhandenen Trümmer stellen die zerfallenden AKE-Zellen aus dem vorherigen Östrusstadium dar, die oft in Metestrus zu sehen sind. Dies zeigt sich auch im letzten Übergangsstadium von MET zu DIE, wo die Epithelzellen zu zerfallen begannen und Trümmer produzierten (Abbildung 6D1,2), wobei zahlreiche Zellen in der ersteren und eine moderate Anzahl in der letzteren vorhanden waren. Diese Zahlen zeigen das Phänomen, dass LEUs an Zahl zunehmen, um der dominante Zelltyp im Übergang zum Diestrus zu werden. Für die Gruppe, die 20 Tage lang überwacht wurde (n = 3), gab es 12 Tage, an denen Übergangsproben gesammelt wurden, mit einem Durchschnitt von 4. Für die Gruppe, die 10 Tage lang überwacht wurde (n = 3), gab es 9 Tage, an denen Übergangsproben gesammelt wurden, mit einem Durchschnitt von 3.

Abbildung 7 zeigt ungünstige Zellprobensammlungen, von denen ein Großteil wiederholte Lavagen rechtfertigte. Abbildung 7A1 zeigt eine Masse von Plattenepithelzellen, die aufgrund einer unsachgemäßen Spritzeneinführung und -extraktion gesammelt wurden, wodurch Plattenepithelzellen von der Vaginalkanalwand abgesaugt werden. Diese Zellen können von verklumpten Epithelzellen oder LEUs aufgrund der hohen Dichte und Kompaktheit der Masse und ihrer charakteristischen Grenzen unterschieden werden. Abbildung 7B stellt eine Ansammlung von Ablagerungen dar, bei der entweder keine Zellen extrahiert wurden, die Fokusebene falsch ist oder der Objektträger nicht vollständig nach Zellen durchsucht wurde. Trümmer können von Zellen durch die Vertrautheit mit den Zelltypen und die oft charakteristische geringe Größe und Verklumpung unterschieden werden. Diese Trümmer stammen oft von Tiereinstreu, Haaren oder Zellzerfall. Abbildung 7C zeigt eine Folie, die eine Zellenanzahl enthält, die unter einem Smidge liegt. Während niedrige Zellzahlen häufig während der späten MET und frühen DIE beobachtet wurden, stellt dies Objektträger dar, die zu wenige Zellen haben, um sie genau in ein Stadium einzuordnen.

Abbildung 7D zeigt zwei Beispiele der NaCl-Extraktionslösung in Kombination mit Vaginalflüssigkeit aus dem Kanal auf dem Objektträger. Im ersten Bild, Abbildung 7D1, war die Flüssigkeit vorhanden und unscharf, was die Fähigkeit zur genauen Kategorisierung behinderte. In Abbildung 7D2 wurde die Flüssigkeit in zusammenhängenden Kreisen neben den LEUs über den Objektträger verteilt. Während dieses Beispiel aufgrund der hohen Zellpräsenz keine wiederholte Lavage erfordert, ist es wichtig, die Menge der auf dem Objektträger platzierten Flüssigkeit und die Platzierung des Objektträgers zu berücksichtigen, um Abstriche zu vermeiden. Insgesamt betonen diese Bilder, wie wichtig es ist, qualitativ hochwertige repräsentative Bilder für die richtige Kategorisierung zu erfassen. Dazu gehört die Berücksichtigung der Art der Zellextraktion, der Fokusebene und des Inhalts des Bildes, indem jedes Dia vor der Aufnahme eines Bildes gescannt wird.

Nach der Kategorisierung jedes Tieres in der/den Versuchsgruppe(n) ist es üblich, die Stadienprogressionen entweder in einem Balken- oder Liniendiagramm darzustellen. Dies ermöglicht es den Forschern, das Gesamtzyklusmuster zu untersuchen und festzustellen, wann das Tier eine unregelmäßige Progression der Östrusstadien aufweist, die als Azyklizität bekannt ist. Die Proben können dann anhand der Zykluslänge und des Stufenverlaufsmusters in diesem Analysewerkzeug analysiert werden. In Abbildung 8A,B dargestellt, umfasst dieses Konzept die Zuweisung von Balken unterschiedlicher Höhe im Falle dieser Studie zu den einzelnen Stufen und die Übersetzung der aufgezeichneten Daten (Abbildung 4B) über die x-Achse. In diesen Beispielen werden MET und DIE durch die niedrigste, PRO durch die mittlere und EST durch die höchsten Balkenhöhen dargestellt. Aufgrund der kurzen Dauer der MET-Stufe wird sie mit der DIE-Stufe zu einem Takt zusammengefasst. Obwohl es verschiedene Methoden zur Messung von Zyklusabschlüssen gibt, ist es üblich, einen vollständigen Zyklus als die Bewegung von einem EST zu einem anderen¹¹ zu zählen. Dies spiegelt jedoch keinen Zyklusabschluss wider, sondern eine 2-tägige EST-Phasendauer, wenn es aufeinanderfolgende EST-Phasen gibt.

Abbildung 8A zeigt Daten von einer Ratte, die durch eine konsistente und sich wiederholende Progression durch MET/DIE, PRO und EST fortschreitet. Darüber hinaus fiel diese Ratte in den Bereich von 4- bis 5-Tage-Zyklen mit einer durchschnittlichen Länge von 4,375. Jede Stufe überschreitet nicht die standardisierten Längenbereiche mit durchschnittlich 1,0625 Tagen, die in EST verbracht werden, eine typische Bewertung der Azyklizität. Wenn die extrahierten Daten diesem Muster von EST bis EST mit Regelmäßigkeit folgen, bestätigt dies nicht nur, dass der Hormonspiegel des Probanden in akzeptablen Bereichen blieb, sondern auch, dass das Verfahren durchgeführt wurde, ohne den zyklischen Charakter des Prozesses signifikant zu unterbrechen. Schließlich absolvierte diese Ratte 16 Zyklen, die durch Zählen der Anzahl der EST- bis EST-Balken bestimmt wurden.

Abbildung 8B zeigt häufige Arten von Azyklizität, einschließlich erweiterter (als EXT bezeichnet) und nicht aufgezeichneter Phasen. Diese Abbildung unterstreicht auch, wie wichtig es ist, sowohl das Zyklusmuster als auch die Länge und Anzahl der in jeder Phase verbrachten Tage zu untersuchen. Während in diesem Beispiel die durchschnittliche Zykluslänge und die Anzahl der Tage in EST innerhalb der skizzierten Parameter liegen, zeigte das Zyklusmuster der Stufenprogression Anomalien. Daher ist es wichtig, den Östruszyklus umfassend zu untersuchen. Sowohl erweiterte DIE- (als Ext Diest bezeichnet) als auch EST- (als Ext Est bezeichnet) -Phasen wurden während der in der Abbildung gezeigten Zyklen aufgezeichnet, und es gab mehrere Zyklen, in denen die PRO-Stufe nicht aufgezeichnet wurde. Dieses Beispiel zeigt auch, wie wichtig es ist, die Anzahl der beobachteten aufeinanderfolgenden Phasen zu untersuchen, die außerhalb typischer Bereiche liegen, anstatt nur die durchschnittliche Länge des Zyklus und der Tage in EST zu untersuchen, die in typische Bereiche fallen.

Die Ursachen und Korrelationen dieser Beispiele können Faktoren wie physiologische Anomalien (Tumore, Pseudoschwangerschaft, anhaltender Stress), schädliche Umweltbedingungen (verlängerte Beleuchtung, Exposition gegenüber toxischen Chemikalien, Einzelunterbringung), unsachgemäßes Timing der Probenentnahme, Forscherfehler (schlechte Probenentnahme, Bildaufnahme, unsachgemäße Inszenierung), altersbedingte Phänomene (häufige Unregelmäßigkeit in der Adoleszenz und reproduktive Seneszenz) oder Abweichungen, die für die spezifische Tier. Um Forscherfehler oder unsachgemäßes Timing der Probenentnahme und physikalische Anomalien oder altersbedingte Phänomene zu trennen, ist es hilfreich, die 4 kategorisierenden Komponenten genauer zu untersuchen. Dies kann bei der Bestimmung der möglichen Ursachen von Unregelmäßigkeiten helfen oder im weiteren Sinne in Studien verwendet werden, die die Merkmale des Östruszyklus genauer untersuchen.

Abbildung 9 veranschaulicht diese genauere Betrachtung, indem es die Gesamt- und Einzelzellengrößen auf der y-Achse, den Zelltyp(en), der durch verschiedene Balkenfüllfarben dargestellt wird, und die Zellenanordnung(en), die durch unterschiedliche Balkenfüllmuster dargestellt werden, die über den gesamten Überwachungszeitraum grafisch dargestellt werden, einbezieht. Diese Analysemethode ermöglichte es, die Gesamtzahl der abgeschlossenen Zyklen, die Länge jedes Zyklus, die Stufenprogression und die Kategorisierungskomponenten für jede einzelne Ratte genauer zu untersuchen. Abbildung 9A stellt eine Ratte dar, die eine unterdurchschnittliche Anzahl von Zyklen hatte, mit insgesamt 3 vollen Zyklen in den 10 überwachten Tagen - zwei 3-Tage-Zyklen und ein 5-Tage-Zyklus (Durchschnitt von 3,67). Die Unregelmäßigkeit, die in der Stufenprogression mit 50% der Tage beobachtet wurde, umfasste eine oder mehrere nicht aufgezeichnete Stadien und 30% der gesammelten Proben befanden sich im Übergang - Tag 2 als MET-DIE, Tag 5 als EST-MET und Tag 8 als PRO-DIE-Übergang. Dies könnte auf das unsachgemäße Timing der Probenentnahme, Forscherfehler, ein altersbedingtes Phänomen oder einzigartige Abweichungen zurückzuführen sein. Eine weitere Überwachung hätte Klarheit darüber schaffen können, welche Anwendung zutrifft.

Die typischen dominanten Anordnungen, Zelltypen sowie Einzel- und Gesamtzellmengen wurden in jedem der aufgezeichneten Stadien beobachtet. Innerhalb der EST-Stadien wurden ein Smidge (25% der Proben), moderate (25% der Proben) und zahlreiche (50% der Proben) verklumpte AKE-Zellen mit einer geringeren Präsenz von LEUs, SNE und LNE-Zellen beobachtet. In der einen erfassten MET-Phase war eine Kombination aus zahlreichen zufällig dispergierten LEUs (50%), AKE-Zellen (20%), LNE (15%) und SNE (15%) Zellen. Für die DIE-Stadien wurde eine geringe (50% der Proben) und zahlreiche (50% der Proben) Menge zufällig dispergierter, gleichmäßig dispergierter und eine Kombination von dominanten LEUs mit AKE-, LNE- und SNE-Zellen durchsetzt. In der einen PRO-Stufe, die gesammelt wurde, war ein Hauch von zufällig dispergierten LEUs (60% der vorhandenen Zellen) und SNE-Zellen (40% der vorhandenen Zellen), die sich in einer Kombination von Anordnungen befanden, vorhanden, was einen Übergang von DIE zu PRO darstellte.

In Abbildung 9B hatte die dargestellte Ratte insgesamt 3 vollständige Zyklen mit einem 4-tägigen Zyklusmuster. Die gesammelten Proben stellten keine konsistente Stufenprogression dar, mit einer verlängerten DIE-Periode (Tage 6-9) und 5 weiteren Fällen von nicht aufgezeichneten Stufen (2 nicht aufgezeichnete MET-Stufen, 2 nicht aufgezeichnete PRO-Stufen und 1 nicht aufgezeichnete EST-Stufe). Da sich nur 20 % der Proben im Übergang befanden (Tag 3 als DIE-PRO, Tag 5 als EST-MET, Tag 18 als MET-DIE und Tag 19 als DIE-PRO) und nur 3 Stadien außerhalb des MET-Stadiums und des verlängerten DIE-Zeitraums nicht aufgezeichnet wurden, wurde der Schluss gezogen, dass der Zeitpunkt der Probenentnahme für dieses spezifische Tier angemessen war. Da die letzten 10 überwachten Tage eine geordnete Progression durch die 4 Stufen beinhalteten, konnten die anfänglichen Unregelmäßigkeiten auf das Alter des Jugendlichen zurückgeführt werden. Die erhöhte Überwachungsdauer (20 Tage) ermöglichte diese Schlussfolgerung.

Die Untersuchung der kategorisierenden Komponenten ergab typische Bereiche. Die EST-Stadien spiegelten eine Dominanz einer moderaten (50% der Proben) bis einer zahlreichen Anzahl (50% der Proben) von verklumpten AKE-Zellen mit weniger LEUs, SNE und LNE-Zellen wider. In den gesammelten MET-Proben gab es eine Kombination aus moderaten (33,33% der Proben) bis zahlreichen (66,67% der Proben) zufällig dispergierten und verklumpten LEUs (mit einem Mengenbereich von 10-90%), verklumpten SNE (0-30%), zufällig dispergierten LNE (0-10%) und verklumpten und zufällig dispergierten AKE-Zellen (10-90%). Die DIE-Stadien spiegelten eine Dominanz einer moderaten (20%) bis einer zahlreichen (80% der Stichproben) Menge gleichmäßig verteilter, zufällig dispergierter und verklumpter LEUs (Bereich von 50-100%) in Gegenwart von zufällig dispergierten AKE- und SNE-Zellen wider. Die PRO-Stadien wurden durch die Dominanz einer kleinen (3,33% der Proben) und zahlreicher (66,67% der Proben) Menge zufällig dispergierter und verklumpter SNE-Zellen (10-99%) in Gegenwart von LEUs, AKE und LNE-Zellen identifiziert.

Eine weitere Option bei der Analyse der extrahierten Daten ist die Erstellung von Östruszyklusprofilen unter Einbeziehung der zuvor beschriebenen Elemente – Gesamt- und Einzelzellengrößen auf der y-Achse, Zelltyp(en), die durch verschiedene Balkenfüllfarben dargestellt werden, und Zellenanordnung(en), die durch unterschiedliche Balkenfüllmuster dargestellt werden, die über den gesamten Überwachungszeitraum für jede Zyklusstufe grafisch dargestellt werden. Dies kann pro Ratte oder Durchschnittswerten der gesamten Gruppe abgeschlossen werden. Der Zweck dieses Analysewerkzeugs ist es, die Kategorisierungskomponententrends pro Stufe zu untersuchen, was der gesamten wissenschaftlichen Gemeinschaft bei der Charakterisierung der Kategorisierungskomponentenunterscheidungen hilft, die für die Kategorisierungen der Zyklusphasenkategorisierungen spezifisch sind. In Abbildung 10 A1 zeigte das 10-Tage-DIE-Profil eine Dominanz einer moderaten (50% der Proben) und zahlreichen (50% der Proben) Menge gleichmäßig verteilter LEUs (durchschnittlich 78,25%) neben weniger SNE-, AKE- und LNE-Zellen. In Abbildung 10 A2 zeigte das 20-Tage-Diestrus-Profil eine Dominanz einer moderaten (20% der Stichproben) und zahlreichen (80% der Proben) Menge gleichmäßig dispergierter, verklumpter und zufällig dispergierter LEUs (durchschnittlich 82% wie in allen 10 Tagen vorhanden) neben einer geringeren Anzahl von AKE- und SNE-Zellen.

Die PRO-Stufe, die in Abbildung 10B1 gezeigt wurde, zeigte eine Dominanz einer moderaten Anzahl von zufällig dispergierten SNE-Zellen (60%) in Gegenwart von LEUs und AKE-Zellen. Das 20-tägige PRO-Stufenprofil in Abbildung 10B2 zeigte eine Dominanz eines Smidge (33,33% der Stichproben) und einer zahlreichen (66,67% der Stichproben) Menge einer Kombination von Anordnungen und zufällig dispergierten SNE-Zellen (durchschnittlich 66,33% wie in allen 3 Proben vorhanden) neben LEUs und AKE-Zellen. Das 10-Tage-EST-Profil, das in Abbildung 10C1 zu sehen ist, zeigte eine Dominanz einer moderaten (50% der Proben) oder einer zahlreichen (50% der Proben) Menge an AKE-Zellen (durchschnittlich 80% für die 2 Tage anwesend) in einer Kombination von Anordnungen, neben einer geringeren Anzahl von LEUs, SNE und LNE-Zellen. In Abbildung 10 C2 zeigte das 20-Tage-EST-Profil eine Dominanz von moderaten (75% der Stichproben) oder einer zahlreichen Anzahl (15% der Stichproben) Anzahl von zufällig dispergierten AKE-Zellen (durchschnittlich 57,5% für die 4 Tage anwesend) oder solchen in einer Kombination von Anordnungen, zusammen mit einer geringeren Anzahl von LEUs, SNE und LNE-Zellen.

Das 10-Tage-MET-Stadium-Profil in Abbildung 10D1 umfasste zahlreiche zufällig dispergierte LEUs (50%), AKE (20%) Zellen und SNE (30%) Zellen. Das 20-Tage-MET-Stadium-Profil in Abbildung 10 D2 zeigte eine moderate (3,33% der Proben) oder eine zahlreiche (6,667% der Stichproben) Menge an LEUs (durchschnittlich 50% in allen 3 Stichproben), SNE (durchschnittlich 15%, wie in allen 3 Proben vorhanden), AKE-Zellen (mit 23,33% in den 3 vorhandenen Proben), LNE-Zellen (durchschnittlich 15% in allen 2 vorhandenen Proben). Die Hälfte der LEUs war zufällig verteilt (1 Stichprobe) und die restlichen 50% waren eine Kombination von Anordnungen (1 Stichprobe). Zwei Drittel der SNE-Zellen wurden zufällig dispergiert, wenn sie vorhanden waren, während die restlichen 33,33% in einer Kombination von Anordnungen waren, wenn sie vorhanden waren (1 von 3 Stichproben). Schließlich waren 66,67% der AKE-Zellen in den vorhandenen Proben verklumpt (2 Tage), während die restlichen 33,33% in einer Kombination von Anordnungen (1 Tag) waren. Tabelle 1 enthält die numerischen Mittelwerte der kategorisierenden Determinanten aus den beiden Gruppen. Während die Daten in Abbildung 9A, B und Abbildung 10A-D Informationen über die Kategorisierungsdeterminanten einzelner Tiere enthalten, enthalten diese Tabellen als Beispiel Durchschnittswerte für das Brunststadium. Wenn sie in anderen Laboratorien reproduziert werden, könnten diese Parameter zum Standard für die Stufenidentifikation werden. Dies wiederum könnte das Niveau der Subjektivität verringern, das derzeit im Inszenierungsprozess involviert ist.

Statistik
Im Allgemeinen gibt es einige Parameter, die bei der Interpretation der Zyklusmerkmale zu berücksichtigen sind, obwohl es keinen Konsens darüber gibt, was als "abnormal" angesehen wird, und Abweichungen sind typisch. Goldman et al. identifizieren "regulär" als einen 4-5-Tage-Zyklus mit 24-48 h EST und 48-72 h DIE-Stufen¹¹. Die Abweichung von diesen Parametern könnte auf verschiedene Faktoren zurückzuführen sein, einschließlich einer oder mehrerer physiologischer Anomalien, eines falschen Sammlungstimings oder der anfänglichen Azyklizität, die häufig von jugendlichen Ratten erlebt wird, wenn der Hormonspiegel reift. Neben der Konsultation des Labortierarztes, der Ermöglichung einer Testerhebungszeit, um ein angemessenes Timing sicherzustellen, und der Überwachung von Tieren nach der Adoleszenz, um einen vergleichenden Zeitplan zu erstellen, können statistische Analysen hilfreich sein, um Verursachung und / oder Korrelation auf Anomalien zurückzuführen. Nach der Charakterisierung der Zyklen in Kategorien (z. B. konsistent und abnormal) kann eine Chi-Quadrat-Analyse beim Vergleich der Gruppen helfen. Zusätzlich können die kategorisierenden Komponenten oder allgemeinen Zyklusmerkmale nach der Intervention mittels Varianzanalyse (ANOVA)¹¹ verglichen werden. Solche Abweichungen sind jedoch möglicherweise nicht biologisch sinnvoll, wie in der Einleitung diskutiert, und daher muss der experimentelle Kontext berücksichtigt werden.

Abbildung 1: Hormonrhythmizität in Östruszyklusphasen. (A) Die unterschiedlichen Sexualsteroidhormonspiegel während der prominenten Östruszyklusstadien werden skizziert und zusammengefasst. Die Stufenprogression beginnt und endet mit Metestrus, um den aufbauenden Hormonspiegel und den zirkulären Verlauf des Prozesses zu demonstrieren. Adaptiert von einer externen Quelle¹¹. (B) Fluss von Sexualsteroidhormonen vom zentralen Nervensystem zum Fortpflanzungssystem über den Blutkreislauf. Es wird gesehen, dass der Hormonspiegel durch Signale aus dem Hypothalamus und der Hypophyse über das Gonadotropin-Releasing-Hormon (GrH oder LHRH) bzw. die Kombination von follikelstimulierendem Hormon bzw. luteinisierendem Hormon erhöht wird. Dies umfasst sowohl positive als auch negative Rückkopplungsschleifen, abhängig von der Konzentration von Östradiol und Progesteron. Informationen¹⁷ und Bilder aus externen Quellen^65,66,67. Abkürzung: LHRH = luteinisierendes hormonfreisetzendes Hormon. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Östruszyklus kategorisiert Determinanten gemessen. (A) Hier sind die Komponenten aufgeführt, die bei der Inszenierung der gesammelten Zellproben verwendet werden, und die dominanten Komponenten für jede Stufe. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass dies allgemeine Parameter sind und Unterschiede erwartet werden. (B) Hier sind die dominanten Zelltypen, die in jedem Stadium vorhanden sind. Während dies allgemeine Teilungen sind, kann jeder Zelltyp in allen Stadien gefunden werden. (C) Hier werden die Zellanordnungstypen vorgestellt, die in dieser Studie gefunden wurden. (D) Das Bild hier spiegelt die typischen Zellgrößen wider, die in jeder der 4 Östruszyklusstufen vorhanden sind, wobei das Quadrantenvolumen die ungefähren Zellmengen darstellt. Aus einer externen Quelle^{bezogen 13} und zuvor angepasst⁶⁸. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Vaginalöffnung bei Sprague Dawley Ratten. (A) Anatomische Ausrichtung der unentwickelten äußeren Genitalien und der vaginalen Öffnung, die zum Vaginalkanal führen, in Bezug auf die Harnröhrenöffnung. (B) Visuelle Darstellung der unbebauten Fläche, gekennzeichnet durch einen Pfeil. (C) Anatomische Ausrichtung der entwickelten äußeren Genitalien und Vaginalöffnung in Bezug auf die Harnröhrenöffnung, die typischerweise im Alter von etwa 34 Tagen auftritt. (D) Entsprechende visuelle Darstellung der in Bild A umrissenen bebauten Fläche. Alle Zahlen stammen aus einer externen Quelle²⁹. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Kategorisieren der Datenaufzeichnungsvorlage für Determinanten. (A) Eine Option für die Datenaufzeichnung; enthält Beschreibungen der Kategorisierung von Determinanten. Dies ist täglich anzuwenden, eines für jede überwachte Ratte. (B) Diese Vorlage ist eine Option zur Dateneingabe mit einer vereinfachten Aufzeichnung der Kategorisierungsdeterminanten und Rattenidentifikation. Auf diese Weise können Notizen in das Datenblatt in der zweiten PRO-Kategorisierung eingegeben werden. Die Farbe in der obersten Zeile spiegelt die Farbe wider, die der dargestellten experimentellen Gruppe zugewiesen ist, wodurch eine Gruppe von einer anderen unterschieden werden kann. (C) Eine weitere Vorlagenoption; enthält alle kategorisierenden Determinanten und kann basierend auf persönlichen Vorlieben oder Zielen der Studie geändert werden. Abkürzungen: AKE = anukleiertes keratinisiertes Epithel; LEU = Leukozyten; LNE = großes kernhaltiges Epithel; SNE = kleines kernhaltiges Epithel; C = verklumpt; ED = gleichmäßig verteilt; RD = zufällig verteilt; COM = kombiniert; SMD = smidge; MOD = moderat; NUM = zahlreich; EXE = Übung; SED = sesshaft; Est = Östrus; Die = Diestrus; met-die = Metestrus-Diestrus-Übergang; Pro = Proestrus; pro-Est = Proestrus-Östrus-Übergang; ** = Qualitätsbeispiel, das in einer Publikation hilfreich sein könnte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Stufenkategorisierung von Determinantenvariationen. (A) Diese Serie von Bildern zeigt verschiedene Beispiele des Diestrus-Stadiums. Das erste Bild (A1) zeigt eine Ablagerung von Schleim, die durch Stränge konzentrierter LEUs dargestellt wird, wobei Epithelzellen in zufälligen Auszahlungen vorhanden sind. Dies ist ein Beispiel dafür, wie wichtig es ist, sowohl die 4-fache als auch die 10-fache Vergrößerung zu verwenden. Diese 4-fache Vergrößerung erscheint ähnlich wie ein Proestrusstrang, zeigt aber bei näherer Betrachtung bei 10x eine Dominanz von LEUs. Das zweite Bild (A2) zeigt, was oft in Diestrus-Stadien zu sehen war - eine Dominanz von LEUs, die neben einer verklumpten Anordnung von Epithelzellen zu sehen ist: SNE-, LNE- und AKE-Zellen. Das letzte Bild in dieser Serie (A3) spiegelt eine zufällige Auszahlung von LEUs wider, die oft in der Diestrus-Phase inmitten von vaginalen und salzhaltigen Flüssigkeitströpfchen zu sehen sind. (B) Diese Serie von Bildern zeigt verschiedene Beispiele des Proestrusstadiums. Das erste Bild (B1) zeigt eine klumpende Anordnung von SNE-Zellen zu Strängen. Das zweite Bild (B2) zeigt einen Objektträger mit einer geringeren Gesamtzellzahl und einer Verklumpung von SNE-Zellen. Das dritte Bild (B3) zeigt die übliche Verklumpung und mehr zufällige Auszahlung von SNE-Zellen und eine geringe Anzahl von LEUs und AKE-Zellen. (C) Diese Serie von Bildern zeigt verschiedene Beispiele des Östrusstadiums. Das erste Bild (C1) zeigt eine gemeinsame Klumpenanordnung von AKE-Zellen mit Keratinstabformationen in Gegenwart von SNE-Zellen. Das zweite Bild (C2) zeigt die Verklumpung von AKE-Zellen mit Geisterkernen und Bakterien. Das letzte Bild (C3) zeigt eine strangartige Anordnung von AKE-Zellen. (D) Diese Bilderserie zeigt verschiedene Beispiele der Metestrus-Stufe. Das erste Bild (D1) zeigt die zufällige Auszahlung und Verklumpung von LEUs, SNE-Zellen, AKE-Zellen und LNE-Zellen in Gegenwart von Trümmern. Das zweite Bild (D2) spiegelt alle Zelltypen wider, die in einer klumpenden Anordnung neben Keratinstäben vorhanden sind. Das letzte Bild (D3) zeigt eine umfassendere Anordnung der vorhandenen LEUs, SNE-, AKE- und LNE-Zellen. Diese Zahlen, die entweder mit 4x (A1, A2, B2, B3, D1 und D3) oder 10x (A3, C1, C2, C3 und D2) Objektivierung aufgenommen wurden, wurden vergrößert, um eine verbesserte Visualisierung der Kategorisierungskomponenten zu ermöglichen. Maßstabsstäbe = 100 μm. Als Größenreferenz; AKE-Zellen haben einen Durchmesser von ca. 40-52 μm, LEUs von ca. 10 μm, LNE-Zellen von ca. 36-40 μm und SNE-Zellen von ca. 25-32 μm¹⁶. Abkürzungen: SNE = kleines kernhaltiges Epithel; LNE = großes kernhaltiges Epithel; AKE = anukleiertes keratinisiertes Epithel; LEUs = Leukozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Beispiele für die Übergangsphase. (A) Diese Bildserie zeigt Beispiele für den Übergang zwischen der DIE- und der PRO-Stufe. Das erste Bild (A1) zeigt große Klumpen und zufällige Auszahlungen von LEUs, SNE-, LNE- und AKE-Zellen. Das zweite Bild (A2) zeigt eine große Masse von verklumpten LEUs und SNE mit eingestreuten Strängen von LEUs. Das dritte Bild (A3) enthält Klumpen und sogar Auszahlungen von LEU und einer kleinen Menge von ANS. Das vierte und letzte Bild (A4) zeigt sowohl verklumpte als auch zufällig ausgezahlte SNE-Zellen und LEUs. (B) Dieses Bild zeigt ein Beispiel für den Übergang zwischen PRO- und EST-Stadien mit der Verklumpung von SNE- und AKE-Zellen. (C) Dieses Bild zeigt die Verklumpung und zufällige Auszahlung von AKE-, SNE- und LNE-Zellen, die inmitten von Trümmern gesehen werden, um den Übergang von EST zu MET darzustellen. (D) Das erste Bild (D1) zeigt ein Beispiel für den Übergang zwischen MET- und DIE-Stadien, wobei zerfallende Epithelzellen einen Anstieg der LEUs begleiten. Das zweite Bild (D2) zeigt AKE-Zellen in Gegenwart von verklumpten LEUs und SNE-Zellen, die zuvor beschrieben wurden. Diese Zahlen, die entweder mit der 4-fachen (A1, A2, A3, B und C) oder 10-fachen (A4, D1 und D2) Vergrößerung aufgenommen wurden, wurden vergrößert, um eine verbesserte Visualisierung der Kategorisierungskomponenten zu ermöglichen. Maßstabsstäbe = 100 m. Als Größenreferenz haben AKE-Zellen einen Durchmesser von ca. 40-52 μm, LEUs von ca. 10 μm, LNE-Zellen von ca. 36-40 μm und SNE-Zellen von ca. 25-32 μm¹⁶. Abkürzungen: AKE = anukleiertes keratinisiertes Epithel; LEUs = Leukozyten; LNE = großes kernhaltiges Epithel; SNE = kleines kernhaltiges Epithel; C = verklumpt; EST = Östrus; DIE = Diestrus; PRO = Proestrus; MET = metestrus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Ungünstige Zellprobensammlungen. (A) In diesen beiden Bildern wurden Plattenepithelzellen zusätzlich zu zufällig dispergierten LEUs von der Vaginalkanalwand abgesaugt. (B) Dieses Bild enthält eine geringe Menge an Trümmern, bei denen Zellen entweder nicht gesehen oder nicht gesammelt wurden. (C) In diesem Beispiel wurde eine insgesamt niedrige Zellzahl beobachtet. (D) In diesen beiden Bildern (D1 und D2) waren die Natriumchlorid (NaCl)-Extraktionslösung und die Vaginalflüssigkeit zu sehen und in den Objektträgern des Mikroskops verteilt. Diese Figuren, die entweder mit der 4-fachen (A1, A2 und D1) oder 10-fachen (B, C und D2) Vergrößerung aufgenommen wurden, wurden vergrößert, um eine verbesserte Visualisierung der Kategorisierungskomponenten zu ermöglichen. Maßstabsstäbe = 100 μm. Als Größenreferenz haben AKE-Zellen einen Durchmesser von ca. 40-52 μm, LEUs von ca. 10 μm, LNE-Zellen von ca. 36-40 μm und SNE-Zellen von ca. 25-32 μm¹⁶. Abkürzungen: AKE = anukleiertes keratinisiertes Epithel; LEUs = Leukozyten; LNE = großes kernhaltiges Epithel; SNE = kleines kernhaltiges Epithel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Regelmäßige und unregelmäßige Zyklusmusterstichprobe. (A) Dieses Bild spiegelt insgesamt 16 vollständige Zyklen wider, die durch ein sich wiederholendes und konsistentes Muster verlaufen, das die regelmäßige Oszillation von Sexualsteroidhormonen widerspiegelt. Innerhalb dessen wird Diestrus durch den niedrigsten, Proestrus durch die Mitte und Östrus durch den Balken in der höchsten Höhe dargestellt. Diese Daten werden analysiert, indem die Tage zwischen den Brunststadien verfolgt werden, wobei jeder Brunst-zu-Östrus einen vollständigen Zyklus darstellt. Diese Daten spiegeln Daten der weiblichen Ratten wider, die an der UCLA untergebracht sind. (B) Dieses Bild stellt eine theoretische Kombination verschiedener azyklischer Muster von 22 Ratten dar. Erweiterter Östrus kann mit mehreren sich wiederholenden Tagen von Balken in voller Höhe gesehen werden, verlängerter Diestrus mit mehreren sich wiederholenden Tagen der niedrigsten Balkenhöhe und dem Fehlen des zyklischen Progressionsmusters von Diestrus bis Metestrus. Abkürzungen: Est = Östrus; Diest/Die = Diestrus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: Individuelle Kategorisierungsdeterminanten . (A) Dieses gestapelte Balkendiagramm spiegelt jede Komponente der Werkzeuge wider, die zur Kategorisierung einzelner Proben verwendet werden, die in die östrusen Probenstufen gesammelt wurden. Hier zeigt ein Subjekt, das 10 Tage lang überwacht wurde, eine Vielzahl von Zelltypen, Mengen und Anordnungen. Dies wird für jugendliche Tiere erwartet, da die Hormonspiegel in der Regel erst im Erwachsenenalter konsistent werden oder sich regulieren. (B) Hier wird ein Östrusprofil für ein Tier dargestellt, das 20 Tage lang überwacht wurde. Ähnliche Unregelmäßigkeiten sind hier zu sehen, wo das Subjekt 4 Tage lang im Diestrus verweilte, im Vergleich zu den typischen 1-2. Diese Daten repräsentieren die 6 weiblichen Ratten, die an der Pepperdine University untergebracht sind. Abkürzungen: AKE = anukleiertes keratinisiertes Epithel; LEU = Leukozyten; LNE = großes kernhaltiges Epithel; SNE = kleines kernhaltiges Epithel; C = verklumpt; ED = gleichmäßig verteilt; RD = zufällig verteilt; COM = kombiniert; SMD = smidge; MOD = moderat; NUM = zahlreich; EXE = Übung ; SED = sesshaft; Est = Östrus; Die = Diestrus; Pro = Proestrus; Met = metestrus.

Abbildung 10: Bühnenprofile . (A) In diesem Abschnitt werden die kategorisierenden Determinantendaten für einzelne Ratten an jedem Tag, der als Diestrus kategorisiert wird, dargestellt. Das erste Bild (A1) stellt Daten dar, die über 10 Tage gesammelt wurden, und das zweite (A2) für 20 Tage. (B) Dieser Abschnitt zeigt Daten für einzelne Ratten während jedes Tages, die als Proestrus kategorisiert werden. Das erste Bild (B1) stellt Daten dar, die über 10 Tage gesammelt wurden, und das zweite (B2) für 20 Tage. (C) Dies zeigt Daten für einzelne Ratten während jedes Tages, der als Östrusstadium identifiziert wird. Das erste Bild (C1) stellt Daten dar, die über 10 Tage und das zweite (C2) für 20 Tage gesammelt wurden. (D) Dieser Abschnitt der Serie zeigt die kategorisierenden Komponentendaten für einzelne Ratten während jedes Tages, der als Metestrusstadium identifiziert wird. Das erste Bild (D1) stellt Daten dar, die über einen Zeitraum von 10 Tagen und das zweite (D2) über einen Zeitraum von 20 Tagen gesammelt wurden. Die Daten in diesen Zahlen spiegeln die von 6 weiblichen Ratten wider, die an der Pepperdine University untergebracht sind. Abkürzungen: AKE = anukleiertes keratinisiertes Epithel; LEU = Leukozyten; LNE = großes kernhaltiges Epithel; SNE = kleines kernhaltiges Epithel; C = verklumpt; ED = gleichmäßig verteilt; RD = zufällig verteilt; COM = kombiniert; SMD = smidge; MOD = moderat; NUM = zahlreich; EXE = Übung ; SED = sesshaft; Est = Östrus; Die = Diestrus; Pro = Proestrus; Met = metestrus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

EST: 10 Tage	Dauer (Tage)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	ANS (%)	Gesamtzahl der Zellen (%)
EST: 10 Tage	3	88	2.78	1.89	7.33	MOD: 44.44 ANZAHL: 44.44 SMD: 11.11
Schussbereiche	2–4	70–100	0–10	0–17	0–20	Smidge – zahlreich
	Anordnung	C: 50 ED: 0 RD: 50	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 0 ED: 0 RD: 100	C: 50 ED: 0 RD: 50
EST: 20 Tage	Dauer (Tage)	AKE(%)	LEU (%)	LNE (%)	ANS (%)	Gesamtzahl der Zellen (%)
EST: 20 Tage	4	71.92	5.5	2.92	19.67	ZUSCHNITT: 50 ANZAHL: 50 SMD: 0
Schussbereiche	4–4	10–100	0–20	0–20	0–80	Smidge – zahlreich
	Anordnung	C: 60 ED: 6,67 RD: 33,33	C: 0 ED: 12,5 RD: 87,5	C: 33,33 ED: 0 RD: 66,67	C: 44,44 ED: 0 RD: 55,56

Tabelle 1: Durchschnittliche Stufendeterminantenstichprobe Diese Tabellen zeigen die Durchschnittswerte für die Kategorisierungsdeterminanten und eine Übersicht für alle gesammelten EST-Stufen. Die obere Tabelle spiegelt die Durchschnittswerte für alle Tiere wider, die 10 Tage lang überwacht wurden, und die untere Tabelle für 20 Tage. Dazu gehören die Dauer des Östruszyklus, die Zelltypen und Prozentsätze sowie die Zellanordnungen und der Prozentsatz jeder Anordnung, der für jeden Zelltyp beobachtet wird. Diese Daten spiegeln Daten von 6 weiblichen Ratten wider, die an der Pepperdine University untergebracht sind. Abkürzungen: AKE = anukleiertes keratinisiertes Epithel; LEU = Leukozyten; LNE = großes kernhaltiges Epithel; SNE = kleines kernhaltiges Epithel; C = verklumpt; ED = gleichmäßig verteilt; RD = zufällig verteilt; EST = Östrus.

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Discussion

Wichtige Schritte und wichtige Überlegungen
Bestimmte kritische Schritte im bereitgestellten Protokoll erfordern Betonung, insbesondere bei der Sammlung von Vaginalzellen. Während der Vaginalflüssigkeitsextraktion ist die Sicherstellung des richtigen Winkels und der richtigen Tiefe des Spritzeneinführens der Schlüssel, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen und letztendlich Reizungen, Verletzungen oder zervikale Stimulation des Tieres zu verhindern. Die Stimulation des Gebärmutterhalses kann eine Quelle der Pseudoschwangerschaftsinduktion sein, die durch 12-14 Tage eines reinen Leukozyten-Vaginalabstrichs¹¹ angezeigt wird. Während der Evaluierungsphase des Mikroskops ist es wichtig, sich auf die visuelle Ebene zu konzentrieren, auf der die gesammelten Vaginalzellen angezeigt werden. Dies wird durch die Identifizierung von ein oder zwei Zellen und die Anpassung der Visualisierung vervollständigt, bis der Fokus erreicht ist.

Anschließend erfolgt die Aufnahme repräsentativer Bilder der Vaginalzellen für das Staging, indem der gesamte Objektträger des Mikroskops gescannt wird. Dies stellt sicher, dass die aufgenommenen Bilder eine genaue Darstellung dessen widerspiegeln, was im Vaginalkanal der Tiere gesammelt und vorhanden ist. Vor der Kategorisierung ist eine Vertrautheit mit den Kategorisierungsdeterminanten notwendig, wie z.B. die Unterscheidung der Zelltypen und der verschiedenen Transformationen, die jeder Zelltyp besitzen kann. Es wird empfohlen, dass jeder Teilnehmer ordnungsgemäß geschult ist und die Phasenidentifikation durch vorbereitete Übungsfolien übt.

Um das Ausmaß an Verzerrung und Subjektivität zu verringern, das mit dem Prozess verbunden ist, wird empfohlen, zwei Teilnehmer in die Kategorisierungsphase einzubeziehen, die beide blind für die Behandlungsgruppenzuweisungen bleiben und gleichzeitig die zuvor aufgezeichneten Phasenidentifikationen für jedes Tier kennen. Die Zuweisung von zwei Teilnehmern zur Kategorisierung von Stichproben ermöglicht eine Konferenz und eine Abnahme der Subjektivität in den Identifikationen. Wenn die Teilnehmer jedoch Proben separat kategorisieren sollen, wird empfohlen, dass es eine erste Kooperationsphase gibt, um die Zuverlässigkeit zwischen den Ratern zu erhöhen, wenn Fachwissen entwickelt wird. Ein sekundäres Untersuchungssystem kann verwendet werden, um inkonsistente Befunde zu verhindern, z. B. den Austausch von Datensätzen nach der Kategorisierung und die Verwendung der Fotos zur Bestätigung der ersten Bewertungen.

Einschränkungen und Modifikationen
Zu den Einschränkungen der aktuellen Technik gehört die Dauer der Lebensfähigkeit. Aufgrund der Verletzung oder Reizung, die mit dem wiederholten Einführen einer Spritze einhergehen kann, stimmt eine längere und wiederkehrende Überwachung nicht mit der richtigen Pflege und Verwendung der Tiere überein. Daher kann es bei der Durchführung einer Längsschnittstudie erforderlich sein, das Verfahren zu ändern, indem die Häufigkeit der Lavage verringert wird. Anstatt beispielsweise jedes Tier einmal täglich zu überwachen, könnten die Ratten in Gruppen eingeteilt werden, die an verschiedenen Tagen in der Woche überwacht werden. Eine zweite Einschränkung betrifft das Fehlen von Probenfärbungen in dem skizzierten Prozess, ohne Trennung der zellulären Komponenten nach Farbe, wodurch eine größere Abhängigkeit von den im obigen Protokoll aufgeführten Kategorisierungsdeterminanten entsteht.

Darüber hinaus gibt es innerhalb solcher Kategorisierungsdeterminanten Elemente der Subjektivität, die die präzise Replikation einschränken könnten. Insbesondere basieren die Zellmengenanteile innerhalb der gesammelten Proben auf persönlichen Schätzungen. Modifikationen in dieser Hinsicht könnten die Entwicklung eines mathematischen Algorithmus zur Quantifizierung der einzelnen vorhandenen Zelltypen beinhalten. Alternative Modifikationen könnten die Anzahl der auf einem Objektträger abgelegten Proben umfassen, die je nach Größe des Objektträgers und der Abdeckung erhöht werden könnte. Weitere Einschränkungen könnten den Mangel an vaginalen Flüssigkeitsdaten in dieser Studie umfassen - eine Modifikation zukünftiger Studien könnte die Aufzeichnung der Bedingungen der vaginalen Flüssigkeit umfassen, die als Beitrag zur Stufenkategorisierung gesammelt wurde. Weitere Änderungen des Protokolls könnten die Verwendung einer anderen isotonischen Flüssigkeit für die Zellextraktion umfassen, die die gleichen Ergebnisse liefern würde, wie z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung¹³. Wenn dieses Verfahren auf Ratten unterschiedlichen Alters oder verschiedener Stämme angewendet wird, können aufgrund der Körpergröße oder des Aktivitätsniveaus Modifikationen wie Tierhandhabungstechniken erforderlich sein. Dies kann die Greifmethode⁶⁹ und die Forelimb Crisscross 64-Methode für Erwachsene und die ein- und zweihändige Restraint^64-Methode für jüngere Ratten umfassen.

Alternative Methoden
Im Vergleich zu alternativen Methoden der Überwachung des Östruszyklus ist die vaginale Lavage einzigartig in ihrer Genauigkeit, der Menge der produzierten Informationen, der minimalen Invasivität und den damit verbundenen geringen Kosten. Die histologische Untersuchung der Gebärmutter und der Eierstöcke kann zur Identifizierung von Zyklusstadien verwendet werden, ist jedoch aufdringlicher und ermöglicht keine kontinuierliche Überwachung. Während die Messung des Sexualsteroidhormonspiegels bei der Überwachung des Östruszyklus hilft, erfordert sie eine Blutentnahme und ermöglicht nicht die Charakterisierung des einzigartigen zellulären oder vaginalen Flüssigkeitsprofils jedes Probanden. Da die Entwicklung äußerer Genitalien indirekt mit dem Sexualsteroidhormonspiegel korreliert, kann die Untersuchung der Vaginalöffnung Aufschluss über die sexuelle Reifung geben. Darüber hinaus wurde die Färbung des Gewebes, der Feuchtigkeitsgehalt, die Größe und die Schwellung der Vaginalöffnung mit den Östruszyklusstadien⁷⁰ korreliert. Die genaue Physiologie, die zur Öffnung des Vaginalkanals bei Ratten führte, muss jedoch noch vollständig berichtet werden. Neuere Veröffentlichungen haben ergeben, dass dies nur ein indirekter Marker für die reproduktive Entwicklung ist und nicht immer mit der Pubertät übereinstimmt^31,34. Die biochemische Analyse von Urinproben ist kostengünstig und leicht durchzuführen, berücksichtigt jedoch nicht die Spezifität und Zuverlässigkeit anderer Methoden⁷¹. Daher ist es nicht so zuverlässig oder gültig wie die Untersuchung der im Vaginalkanal vorhandenen Zellen.

Darüber hinaus wurde die Messung der elektrischen Impedanz zur Überwachung des Östruszyklus verwendet und ist physikalisch weniger irritierend als die Flüssigkeitsspülung. Diese Methode liefert jedoch nicht so viele Informationen zu den kategorisierenden Komponenten. Dieses Gerät wurde speziell entwickelt, um das Timing der absichtlichen Paarung zu optimieren und zu messen, wann der Sexualsteroidhormonspiegel^{am höchsten ist 72,73,74}. Darüber hinaus wurde berichtet, dass diese Methode zur Unterscheidung zwischen EST und Nicht-EST wirksam ist, aber in ihrer Fähigkeit, den Östruszyklus außerhalb dieser⁷⁵ zu überwachen, begrenzt ist. Insgesamt wurde berichtet, dass diese Methode unzuverlässig und nicht immer kostengünstig ist und in der Literatur nicht häufig verwendet wird, was zu einem Mangel an vergleichbaren Daten^{führt 74}. Während der Vaginalabstrich der Lavage in den Informationen, die er liefert, am ähnlichsten ist, beinhaltet er ein erhöhtes Risiko für Reizungen oder Verletzungen, da er die Auskleidung des Vaginalkanals direkt kontaktieren muss, um Zellen zu gewinnen. Während das Färben der Objektträger einen schärferen Kontrast zwischen den Zelltypen bieten und die Probenkonservierung ermöglichen kann, ist es ein zeitaufwendigeres und kostspieligeres Unterfangen als die nasse Halterung⁵³. Insgesamt hat jede Überwachungstechnik ihre Grenzen und Vorteile, und es könnte von Vorteil sein, eine Kombination dieser Methoden zu verwenden, um eine umfassende Untersuchung des Östruszyklus von Nagetieren zu erhalten.

Anträge
Es bleibt wichtig, die aktuelle Studie im Kontext der größeren wissenschaftlichen Gemeinschaft und der breiten Öffentlichkeit zu sehen. Diese Methodik kann in jedem Projekt verwendet werden, bei dem weibliche Tiere untersucht werden - nicht nur in Studien, die sich auf die absichtliche Zucht konzentrieren, um Tiere auszuschließen, die Anomalien aufweisen, und / oder die Funktion der Hypothalamus-Hypophysen-Ovarial-Achse, sondern auch für die wichtigsten Erkenntnisse innerhalb von Behandlungsgruppen. Genauer gesagt ist dieses Verfahren in i) pharmakologischen Studien von Bedeutung, da verschiedene Medikamente und Chemikalien den Fortpflanzungstrakt und den Östruszyklus stören oder verändern 11,27,76; ii) neurologische Studien, z. B. solche, die sich auf traumatische Hirnverletzungen, Kognition oder degenerative Erkrankungen aufgrund von Wechselwirkungen zwischen Sexualsteroidhormonen und dem Nervensystem konzentrieren⁷⁷; iii) Erforschung des Kreislaufsystems aufgrund von Sexualsteroidhormonrezeptoren auf Myozyten und den nachfolgenden Wechselwirkungen⁷⁷; iv) Forschung im Zusammenhang mit Knochenwachstum³⁸; zum endokrinen System^11,78; und v) sonstige nichtreproduktive Studien³.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Studie wurde im Rahmen einer NIH-finanzierten Zusammenarbeit zwischen dem Los Angeles Brain Injury Research Center (BIRC) der University of California durchgeführt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558 Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4

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References

Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell and Tissue Research. 354 (1), 99-106 (2013).
Camacho-Arroyo, I., Montor, J. M. Beyond reproductive effects of sex steroids. MiniReviews in Medicinal Chemistry. 12 (11), 1037-1039 (2012).
Shah, S. I. A. Systemic non-reproductive effects of sex steroids in adult males and females. Human Physiology. 44, 83-87 (2018).
Wierman, M. E. Sex steroid effects at target tissues: mechanisms of action. Advances in Physiology Education. 31 (1), 26-33 (2007).
An, G., et al. Pathophysiological changes in female rats with estrous cycle disorder induced by long-term heat stress. BioMed Research International. 2020, 4701563 (2020).
Donato, J., et al. The ventral premammillary nucleus links fasting-induced changes in leptin levels and coordinated luteinizing hormone secretion. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5240-5250 (2009).
Fortress, A. M., Avcu, P., Wagner, A. K., Dixon, C. E., Pang, K. Experimental traumatic brain injury results in estrous cycle disruption, neurobehavioral deficits, and impaired GSK3β/β-catenin signaling in female rats. Experimental Neurology. 315, 42-51 (2019).
Hatsuta, M., et al. Effects of hypothyroidism on the estrous cycle and reproductive hormones in mature female rats. European Journal of Pharmacology. 486 (3), 343-348 (2004).
Jaini, R., Altuntas, C. Z., Loya, M. G., Tuohy, V. K. Disruption of estrous cycle homeostasis in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 279, 71-74 (2015).
Tropp, J., Markus, E. J. Effects of mild food deprivation on the estrous cycle of rats. Physiology and Behavior. 73 (4), 553-559 (2001).
Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Research. Part B, Developmental and Reproductive Toxicology. 80 (2), 84-97 (2007).
Thung, P. J., Boot, L. M., Muhlbock, O. Senile changes in the oestrous cycle and in ovarian structure in some inbred strains of mice. Acta Endocrinologica. 23 (1), 8-32 (1956).
Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
Bosch, L. Biochemical and endocrinological studies of normal and neoplastic tissue: The metabolism of estrogen-producing ovarian tumors and other malignancies in the mouse. , Available from: https://www.translatetheweb.com/?from=nl&to=en&ref=SERP&dl=en&rr=UC&a=https%3a%2f%2frepository.tudelft.nl%2fislandora%2fobject%2fuuid%253A8776d58a-6695-4a38-99ca-0abf607480f0 109-111 (2021).
Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta Physiologica Pharmacologica Neerlandica. 4 (3), 442-444 (1955).
Paccola, C., Resende, C., Stumpp, T., Miraglia, S., Cipriano, I. The rat estrous cycle revisited: a quantitative and qualitative analysis. Animal Reproduction. 10 (4), 677-683 (2013).
Knobil, E., Neill, J. D. Puberty in the rat. The Physiology of Reproduction. , Raven Press Ltd. New York. 363-409 (1994).
Schallmayer, S., Hughes, B. M. Impact of oral contraception and neuroticism on cardiovascular stress reactivity across the menstrual cycle. Psychology, Health & Medicine. 15 (1), 105-115 (2010).
Barreto-Cordero, L. M., et al. Cyclic changes and actions of progesterone andallopregnanolone on cognition and hippocampal basal (stratum oriens) dendritic spinesof female rats. Behavioural Brain Research. 379, 112355 (2020).
de Zambotti, M., Trinder, J., Colrain, I. M., Baker, F. C. Menstrual cycle-related variation in autonomic nervous system functioning in women in the early menopausal transition with and without insomnia disorder. Psychoneuroendocrinology. 75, 44-51 (2017).
Maghool, F., Khaksari, M., Khachki, A. S. Differences in brain edema and intracranial pressure following traumatic brain injury across the estrous cycle: Involvement of female sex steroid hormones. Brain Research. 1497, 61-72 (2013).
Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex as a biological variable: Who, what, when, why, and how. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 386-396 (2017).
Becker, J. B., Prendergast, B. J., Liang, J. W. Female rats are not more variable than male rats: a meta-analysis of neuroscience studies. Biology of Sex Differences. 7, 34 (2016).
Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
Joel, D., McCarthy, M. M. Incorporating sex as a biological variable in neuropsychiatric research: where are we now and where should we be. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 379-385 (2017).
Long, J. A., Evans, H. M. The oestrous cycle in the rat and its associated phenomena. Memoirs of the University of California. 6, 1 (1922).
Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: A practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
Lenschow, C., Sigl-Glöckner, J., Brecht, M. Development of rat female genital cortex and control of female puberty by sexual touch. PLoS Biology. 15 (9), 2001283 (2017).
Lewis, E. M., Barnett, J. F., Freshwater, L., Hoberman, A. M., Christian, M. S. Sexual maturation data for Crl Sprague-Dawley rats: Criteria and confounding factors. Drug and Chemistry Toxicology. 25 (4), 437-458 (2002).
Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 24 (4), 417-463 (2000).
Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: the puberty ovarian maturation score (pub-score). Scientific Reports. 7, 46381 (2017).
da Silva Faria, T., da Fonte Ramos, C., Sampaio, F. J. Puberty onset in the female offspring of rats submitted to protein or energy restricted diet during lactation. Journal of Nutritional Biochemistry. 15 (2), 123-127 (2004).
Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. 48 (1), 1 (2009).
Engelbregt, M. J., et al. Delayed first cycle in intrauterine growth-retarded and postnatally undernourished female rats: follicular growth and ovulation after stimulation with pregnant mare serum gonadotropin at first cycle. Journal of Endocrinology. 173 (2), 297-304 (2002).
Pescovitz, O. H., Walvoord, E. C. When puberty is precocious: Scientific and clinical aspects. , Humana Press. (2007).
USEPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. Standard Evaluation Procedure Test Guidelines 890.1450: Pubertal development and thyroid function in intact juvenile/peripubertal female rats assay. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/final_890.1450_female_pubertal_assay_sep_8.24.11.pdf (2011).
Kennedy, G. G., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. Journal of Physiology. 166 (2), 408-418 (1963).
Sengupta, S., Arshad, M., Sharma, S., Dubey, M., Singh, M. M. Attainment of peak bone mass and bone turnover rate in relation to estrous cycle, pregnancy and lactation in colony-bred Sprague-Dawley rats: Suitability for studies on pathophysiology of bone and therapeutic measures for its management. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 94 (5), 421-429 (2005).
Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
Koff, E., Rierdan, J., Stubbs, M. L. Conceptions and misconceptions of the menstrual cycle. Women & Health. 16 (3-4), 119-136 (1990).
Sahay, N. Myths and misconceptions about menstruation: A study of adolescent school girls of Delhi. Journal of Women's Health and Development. 3 (3), 154-169 (2020).
Criado-Perez, C. The deadly truth about a world built for men - from stab vests to car crashes. , Available from: https://www.theguardian.com/lifeandstyle/2019/feb/23/truth-world-built-for-men-car-crashes (2019).
Chrisler, J. C. The menstrual cycle in a biopsychosocial context. Women's Psychology. Psychology of Women: A Handbook of Issues and Theories. Denmark, F. L., Paludi, M. A. , Praeger Publishers/Greenwood Publishing Group. 193-232 (2008).
Rea, H. H. Re-cycling the menstrual cycle: A multidisciplinary reinterpretation of menstruation. , Available from: https://scholarworks.wmich.edu/masters_theses/3942 (1998).
Sato, J., Nasu, M., Tsuchitani, M. Comparative histopathology of the estrous or menstrual cycle in laboratory animals. Journal of Toxicologic Pathology. 29 (3), 155-162 (2016).
Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
Smith, J. R., et al. The year of the rat: The Rat Genome Database at 20: a multi-species knowledgebase and analysis platform. Nucleic Acids Research. 48 (1), 731-742 (2020).
Capdevila, S., Giral, M., Ruiz de la Torre, J. L., Russell, R. J., Kramer, K. Acclimatization of rats after ground transportation to a new animal facility. Laboratory Animals. 41 (2), 255-261 (2007).
Conour, L., Murray, K., Brown, M. Preparation of animals for research-issues to consider for rodents and rabbits. ILAR journal. 47 (4), 283-293 (2006).
National Academies Press (US) Committee on Guidelines for the Humane Transportation of Laboratory Animals. Guidelines for the Humane Transportation of Research Animals. National Academies Press. , (2006).
Obernier, J., Baldwin, R. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR Journal. 47 (4), 364-369 (2006).
National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. US) . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. , National Academies Press. US. (2011).
Pantier, L. K., Li, J., Christian, C. A. Estrous cycle monitoring in mice with rapid data visualization and analysis. Bio-protocol. 9 (17), 1-17 (2019).
Cohen, I., Mann, D. Seasonal changes associated with puberty in female rats: effect of photoperiod and ACTH administration. Biology of Reproduction. 20 (4), 757-776 (1979).
Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J Mice: I. cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
Pennycuik, P. R. Seasonal changes in reproductive productivity, growth rate, and food intake in mice exposed to different regimens of day length and environmental temperature. Australian Journal of Biological Sciences. 25 (3), 627-635 (1972).
Piacsek, B. E., Hautzinger, G. M. Effects of duration, intensity and spectrum of light exposure on sexual maturation time of female rats. Biology of Reproduction. 10 (3), 380-387 (1974).
Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of the estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).
JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
Campbell, C., Schwartz, N. The impact of constant light on the estrous cycle of the rat. Endocrinology. 106 (4), 1230-1238 (1980).
Nelson, J. F., Felicio, L. S., Osterburg, H. H., Finch, C. E. Altered profiles of estradiol and progesterone associated with prolonged estrous cycles and persistent vaginal cornification in aging C578L/6J mice. Biology of Reproduction. 24 (4), 784-794 (1981).
Rivest, R. W. Sexual maturation in female rats: Hereditary, developmental and environmental aspects. Experientia. 47 (10), 1026-1038 (1991).
Charles River Laboratories. CD® (Sprague Dawley) IGS Rat. Charles River Laboratories. , Available from: https://www.criver.com/products-services/find-model/cd-sd-igs-rat?region=3611 (2021).
JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. JoVE. , (2020).
Circulatory System. Biology Corner. , Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_circulatory.html (2021).
Urogenital System. n.d.). Biology Corner. , Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_urogenital.html (2021).
Kiernan, J. A. Anatomical foundations of neuroscience: Mini-atlas of rat's brain. Anatomy and Cell Biology 9535b. , University of Western Ontario. Available from: https://instruct.uwo.ca/anatomy/530/535downs.htm (2008).
Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7 (4), 1-5 (2012).
Marcondes, F. K., Bianchi, F. J., Tanno, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).
Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6 (5), (2020).
Bartos, L. Vaginal impedance measurement used for mating in the rat. Laboratory Animals. 11 (1), 53-55 (1977).
Belozertseva, I. V., Merkulov, D. D., Vilitis, O. E., Skryabin, B. V. Instrumental method for determining the stages of the estrous cycle in small laboratory rodents. Laboratory Animals for Scientific Research. (4), (2018).
Ramos, S. D., Lee, J. M., Peuler, J. D. An inexpensive meter to measure differences in electrical resistance in the rat vagina during the ovarian cycle. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 667-670 (2001).
Singletary, S. J., et al. Lack of correlation of vaginal impedance measurements with hormone levels in the rat. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (6), 37-42 (2005).
Bretveld, R. W., Thomas, C. M., Scheepers, P. T., et al. Pesticide exposure: the hormonal function of the female reproductive system disrupted. Reproductive Biology Endocrinology. 4 (30), (2006).
MacDonald, J. K., Pyle, W. G., Reitz, C. J., Howlett, S. E. Cardiac contraction, calcium transients, and myofilament calcium sensitivity fluctuate with the estrous cycle in young adult female mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 306 (7), 938-953 (2014).
Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).

Biology

Nagetier-Östruszyklus-Überwachung mit vaginaler Lavage: So etwas wie ein normaler Zyklus nicht

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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