Summary
Pinpricking basalhovedet på den sorte peberplante er en kort og tidsbesparende metode til at beskadige den. Her leverede vi detaljerede trin med en video til infektion af sorte peberplanter.
Abstract
Piper nigrum L. (sort peber) er en typisk træagtig vinstok, der er en økonomisk vigtig krydderiafgrøde over hele verden. Produktionen af sort peber er væsentligt påvirket af rodrotsygdom forårsaget af Phytophthora capsici, som alvorligt har påvirket industriudviklingen som et "choke point" -problem. Den molekylærgenetiske resistensmekanisme i sort peber er imidlertid uklar, hvilket fører til langsomme fremskridt i udviklingen af nye sort peber sorter. Et effektivt podningssystem og præcist prøveudtagningssystem for Phytophthora capsici på sorte peberplanter er afgørende for at studere denne plantepatogen-interaktion. Hovedformålet med denne undersøgelse er at demonstrere en detaljeret metode, hvor basalhovedet af sort peber podes med Phytophthora capsici, samtidig med at det giver en reference til podning af træagtige vinplanter. Det basale hoved på den sorte peberplante blev pinpricked for at beskadige det, og myceliske pellets dækkede de tre huller for at bevare fugtigheden, så patogenet kunne inficere planten godt. Denne metode giver en bedre måde at løse den ustabilitet, der er forårsaget af traditionelle podningsmetoder, herunder jorddypning eller roddypning. Det giver også et lovende middel til at studere handlingsmåden mellem planter og andre jordbårne plantepatogener i landbrugspræcisionsavl.
Introduction
Sort peber (Piper nigrum L.) er en træagtig klatrer og en af de vigtigste krydderiafgrøder. Det er kendt som "Kongen af krydderier"1 og dyrkes i over 40 lande og regioner i hele Asien, Afrika og Latinamerika. Phytophthora rodrot er den mest ødelæggende sygdom af sort peber og er forårsaget af oomycete Phytophthora capsici. Dette patogen inficerer også cucurbits, ægplanter, chili peber og tomater 2,3. Med sort peber kan en hel afgrøde undertiden decimeres af denne sygdom. Udvidelsen af peberplantningsområder er begrænset som følge af manglende tilgængelighed af resistente sorter, hvilket har hindret udviklingen af den kinesiske sorte peberindustri betydeligt. En effektiv podning og et præcist prøveudtagningssystem for Phytophthora capsici på sorte peberplanter er afgørende for at studere denne plantepatogen-interaktion.
Identifikation og screening af resistens i germplasmressourcer er det grundlæggende krav til forskning i patogenens patogenicitet og avl og anvendelse af resistente sorter. En meget anvendt tilgang er at anvende en række forskellige identifikationsmetoder baseret på plantearter og patogengrupper. Nuværende identifikationsmetoder omfatter populationsidentifikation, individuel identifikation, organidentifikation, vævsidentifikation, celleidentifikation, biokemisk identifikation og molekylær identifikation, som er blevet udviklet i de senere år 4,5. Der har været succes på disse områder, men der er også mange problemer. Uanset hvilken metode der vælges, er de grundlæggende krav til identifikation af planteresistens konsistente, herunder klare mål, pålidelige resultater og metoder, der er enkle, hurtige og lette at standardisere. Dette princip skal også følges ved identifikation af sort peberresistens.
Under naturlige feltforhold kan identifikationen af sygdomsresistens påvirkes af mange miljøfaktorer. Derfor blev det foreslået, at løsrevne blade og kunstvandede rødder anvendes i laboratoriet for at identificere sygdomsresistens. Unge blade fra sunde planter blev podet in vitro i laboratoriet, og det syge bladområde blev målt ved at pode patogenet for at identificere planternes sygdomsresistens6. In vitro bladpodning kan dog kun anvendes til generel resistensidentifikation og ikke til molekylære interaktionsundersøgelser. På trods af dette er den sygdomsresistente status ofte til stede i den kunstvandede rodpodning, hvilket forårsager usikkerhed i opfølgningsundersøgelsen af molekylær avl for sygdomsresistens. Derfor er hurtige og enkle indendørs detektionsmetoder afgørende. Denne undersøgelse har til formål at tilvejebringe en metode til resistensidentifikation i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af sort peber skære planter til infektion
- Tag en fem-knude skæring, ca. 40 cm lang med en diameter på 0,5 cm, fra en sund og kraftigt voksende ortotrop gren af sort peber ved hjælp af en desinficeret beskæringskniv eller beskæresakse. Beskær de nederste tre knuder i de plagiotropiske grene, med de to øverste knuder tilbage med ca. 10 blade intakte.
- Forbered rodunderlag indeholdende jord og husdyrgødning (komøg eller fåremøg) i forholdet 1:1. Autoklave rodsubstratet ved 121 °C i 20 min.
- Indsæt stiklinger i rodsubstratet i en vinkel på ca. 50 °, hvor den tredje knude bare berører overfladen af substratet og den aksillære knopp på denne knude over substratet.
BEMÆRK: Tasken, der bruges her, har følgende dimensioner: højde på 40-60 cm, diameter på 25-30 cm. - Hæld 10-20 liter vand over plantens rødder. Placer stiklinger i et drivhus med 90% skygge ved en temperatur på 25-30 ° C til rodfæstning og vækst.
2. Formering af Phytophthora capsici (P. capsici)
BEMÆRK: En bestand af Phytophthora capsici-kultur opretholdes i plantebeskyttelseslaboratoriet ved Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences7.
- Pensl og rengør kartoffelknolde under rindende ledningsvand og skær derefter 200 g kartofler i terninger på 1 cm3. Nogle af terningerne hældes i et bægerglas indeholdende 800 ml dobbeltdestilleret vand (ddH2O) og koges i 20 minutter.
- Filtrer bouillon gennem dobbelt gasbind ved hjælp af tyngdekraftfiltrering. Tilbered kartoffeldextroseagar (PDA) ved at tilsætte 20 g dextrose og 15 g agar til filtratet og fylde volumenet op til 1 L med ddH2O. Autoklave blandingen ved 121 °C i 20 min8.
- Hæld 20 ml af den steriliserede PDA i flydende form i en rund petriskål med en diameter på 9 cm inde i en laminær luftstrømshætte. Lad PDA-pladerne med låg stå åbne inde i den laminære luftstrømshætte natten over som et middel til at forhindre kondens.
- Brug en podningssløjfe til at hente mycelia fra Phytophthora capsici-bestand inde i et reagensglas. Placer podestoffet med mycelsiden i kontakt med PDA'en i en petriskål.
3. Infektion af sort peber
- Inkubation
- Identificer et område 5 cm over substratoverfladen og tæt på rødderne på stammen til podning.
- Core ud en disk af mycelia 0,5 cm i diameter ved den voksende kant af Phytophthora capsici kultur på PDA i en Petri skål ved hjælp af en prop borer.
- Beskadiget stammen ved hjælp af en sprøjtenål og lav tre huller i et trekantet mønster ved det valgte podningsområde. Dæk hvert hul med en mycelskive. Placer hullerne tæt på hinanden for at sikre, at det sårede område er fuldt dækket af mycelskiverne.
- Dæk mycelskiverne med steriliserede fugtede bomuldspuder som et middel til at forhindre tørring. Bind puden på stilken med en polyethylenstrimmel for at opretholde podningsskivernes position.
BEMÆRK: 8 timer efter podning blev de podede huller sorte, og læsionen forlængedes som tiden gik. Bladene blev gule og faldt af, og den podede plante døde 7-10 dage efter podning. Ingen læsioner udviklet i kontrolplanterne. De fleste af generne udtrykkes forskelligt efter podning med Phytophthora capsici sammenlignet med kontrolgruppen. Histopatologisk analyse af de inficerede væv viste, at Phytophthora capsici koloniserede i xylem.
- Der udtages prøver af de relevante plantematerialer, og der opbevares -80 °C flydende nitrogen til brug i efterfølgende undersøgelser.
BEMÆRK: Flydende nitrogen, plastposer, tuschpenne, grensaks og andre materialer blev fremstillet forud for forsøgene. - Efter at de specifikke plantematerialer er udtaget til brug, autoklaveres alle de resterende plantematerialer, resterende Phytophthora capsici-kultur - og kulturmedium og alle de instrumenter og labware, der anvendes i dette podningsarbejde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser symptomerne på sorte peberblade efter P. capsici-podning . Figur 2 viser symptomerne på sorte peberstængler efter P. capsici-podning . Patogenet inficerede den sorte peber ved basalstammen; symptomer, herunder bladgulning, visning, der vises, xylembruning og karsorting, der gradvist vises. Figur 3 viser de fleste gener udtrykt forskelligt efter podning med Phytophthora capsici sammenlignet med kontrolgruppen. Figur 4 har vist Phytophthora capsici koloniseret i xylem ved histopatologisk analyse af inficerede væv.
Figur 1: Symptomerne på sort peber blade efter P. capsici podning7. CK: kontrolgruppe; Podet: efter podning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Symptomet på sort peber stammer efter P. capsici inokulation7. Podet: efter podning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Detaljerede ekspressionsprofiler af generne i de sorte peberrødder. Fejllinjer i figurerne angiver standardfejlen i ekspressionsniveauer fra tre biologiske replikationer. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 og 48 på x-aksen henviser til henholdsvis 8, 12, 24 og 48 timer på kontrollen og henholdsvis 8, 12, 24 og 48 timer efter podning med P. capsici. Y-aksen repræsenterer det relative ekspressionsniveau sammenlignet med ubiquitin. Hver kolonne repræsenterer middelværdien plus SD (standardafvigelse) fra tre biologiske replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Histopatologisk analyse af inficerede væv. Sammenligningen mellem toluidinblå O-farvning alene (venstre søjle) og bomuldsblå og safranin O dobbeltfarvning (højre kolonne) (20X). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse blev basalhovedet pinpricked til skade og giver et effektivt podningssystem i den sorte peberplante. Mycelpellets dækkede derefter de tre huller for at bevare fugt og gøre det muligt for patogenet at inficere planten godt. Efter podning blev bladene gule og faldt af, og de podede planter døde. Ingen læsioner udviklet i kontrolplanterne. De fleste gener udtrykkes forskelligt efter podning med Phytophthora capsici sammenlignet med kontrolgruppen. Svampesygdomme er ansvarlige for strukturelle og fysiologiske lidelser i et betydeligt antal afgrøder, hvilket fører til nedsat produktivitet og økonomiske tab for deres producenter. Strukturelle undersøgelser, der anvender histologiske teknikker om svampens penetrationsmåde og kolonisering af plantevæv, giver en detaljeret indikation af interaktionerne mellem patogenet og plantevævet. Disse undersøgelser har afsløret vigtige aspekter for at hjælpe med at forstå sygdommens monocyklus. Histopatologisk analyse af inficerede væv viste Phytophthora capsici koloniseret i xylem. Denne metode giver et bedre middel til at løse den ustabilitet, der er forårsaget af traditionelle podningsmetoder, herunder jorddypning eller roddypning. En effektiv podning og præcist prøveudtagningssystem for Phytophthora capsici på sorte peberplanter er afgørende for at studere denne plante-patogen interaktion. Det giver også et lovende middel til at studere handlingsmåden mellem planter og andre jordbårne plantepatogener i landbrugspræcisionsavl.
Samtidig repræsenterer denne protokol en mere effektiv måde at give reference til inkubation af træagtig vin. I tidligere undersøgelser blev patogener podet ved roddypning med sporesuspensioner dyrket i V8-medium9. Det tager 7 dage for spore suspension at være klar, mens brugen af PDA til dyrkning Phytophthora capsici tager kun 5 dage. PDA-pladen blev forseglet ved hjælp af permeabel kirurgisk tape som et middel til at undgå forurening fra andre bakterier og svampe. Kulturerne blev holdt ved stuetemperatur. Metoden, der anvendes i denne undersøgelse, kan spare mere tid og udføres hurtigere. Sort peber er en træagtig vinstok med mange sukkerarter og phenoler10, og zoosporerne produceret af Phytophthora capsici forekommer generelt i jord, hvilket gør det vanskeligt at inficere sorte peber vinstokke og forårsage infektion ustabilitet i roden11. Denne protokol giver bedre resultater, hvilket muliggør et stærkt samspil mellem vinplanter og jordbårne patogener. Påvisning af den dynamiske proces mellem planter og patogener er synlig og praktisk.
Vandingsrodsmetoden er hurtig og tidsbesparende, men et problem forbliver uløst for sort peber. Phytophthora capsici er et jordbåren patogen, der generelt inficerer planterødder via sporangia og zoosporer12. I naturen er sporangierne i stand til at sprede sig via regn og kunstvanding. Når zoosporerne bliver fastgjort til planteoverfladen, kan kimrørene hurtigt udvikle sig og trænge ind i plantevævet, hvilket resulterer i infektion13,14. Dette kan medføre usikkerhed om, at valg af hyfer som infektionskilde vil svare til sporesuspensionen. Metoden, der anvendes i denne undersøgelse, starter med at stikke basalhovedet på den sorte peberplante for at beskadige den. Det beskadigede område dækkes derefter med Phytophthora capsici, og fugt bevares, hvilket sikrer, at patogenet kan inficere planten godt. Denne metode er bedre til at løse ustabilitet forårsaget af traditionelle podningsmetoder, herunder jorddypning eller roddypning. Det er også en lovende metode til at studere virkningsmåden mellem planter og andre jordbårne plantepatogener i landbrugspræcisionsavl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev økonomisk støttet af National Key R&D Program of China (2020YFD1001200), China Agriculture Research System (CARS-11), den specifikke forskningsfond for The Innovation Platform for Academicians of Hainan Province (YSPTZX202154), Natural Science Foundation of Hainan Province of China (321RC652) og Natural Science Foundation of China (nr. 31601626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
- Gordo, S. M., et al. High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome. BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).
- Leonian, L. H. Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov. Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).
- Ding, X., et al. Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease. Frontiers in Plant Science. 6, 830 (2015).
- Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa. Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).
- Altier, N. A., Thies, J. A. Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method. Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).
- Pratt, R. G., Rowe, D. E. Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling. Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).
- Hao, C., et al. De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici. BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).
- Dong, C., et al. Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides. Bio-protocol. 8 (23), 3099 (2018).
- English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae. Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).
- Chatterjee, S., et al. Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans). Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).
- Pfender, W. F. Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil. Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).
- Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence. HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Hardham, A., Gubler, F. Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube. Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).
