Summary
Pinchar la cabeza basal de la planta de pimienta negra es un método breve y que ahorra tiempo para dañarla. Aquí, proporcionamos pasos detallados con un video para infectar plantas de pimienta negra.
Abstract
Piper nigrum L. (pimienta negra) es una vid leñosa típica que es un cultivo de especias económicamente importante en todo el mundo. La producción de pimienta negra se ve afectada significativamente por la enfermedad de la podredumbre de la raíz causada por Phytophthora capsici, que ha influido seriamente en el desarrollo de la industria como un problema de "punto de estrangulamiento". Sin embargo, el mecanismo genético molecular de resistencia en la pimienta negra no está claro, lo que lleva a un progreso lento en el desarrollo de nuevas variedades de pimienta negra. Una inoculación efectiva y un sistema de muestreo preciso para Phytophthora capsici en plantas de pimienta negra es esencial para estudiar esta interacción planta-patógeno. El objetivo principal de este estudio es demostrar una metodología detallada donde la cabeza basal de la pimienta negra se inocula con Phytophthora capsici, al tiempo que proporciona una referencia para la inoculación de plantas de vid leñosa. La cabeza basal de la planta de pimienta negra fue pinchada para dañarla, y los gránulos miceliales cubrieron los tres agujeros para retener la humedad y así el patógeno pudiera infectar bien la planta. Este método proporciona una mejor manera de resolver la inestabilidad causada por los métodos tradicionales de inoculación, incluido el empapamiento del suelo o la inmersión de la raíz. También proporciona un medio prometedor para estudiar el modo de acción entre las plantas y otros patógenos de plantas transmitidos por el suelo en el mejoramiento agrícola de precisión.
Introduction
La pimienta negra (Piper nigrum L.) es una trepadora leñosa y uno de los cultivos de especias más importantes. Es conocido como el "Rey de las Especias"1 y se cultiva en más de 40 países y regiones de Asia, África y América Latina. La podredumbre de la raíz de Phytophthora es la enfermedad más devastadora de la pimienta negra, y es causada por el oomiceto Phytophthora capsici. Este patógeno también infecta cucurbitáceas, berenjenas, chiles y tomates 2,3. Con la pimienta negra, un cultivo entero a veces puede ser diezmado por esta enfermedad. La expansión de las áreas de siembra de pimiento está restringida como resultado de la falta de disponibilidad de variedades resistentes, lo que ha obstaculizado significativamente el desarrollo de la industria china de la pimienta negra. Una inoculación efectiva y un sistema de muestreo preciso para Phytophthora capsici en plantas de pimienta negra son esenciales para estudiar esta interacción planta-patógeno.
La identificación y el cribado de la resistencia en los recursos de germoplasma es el requisito básico para investigar la patogenicidad del patógeno y el mejoramiento y la utilización de variedades resistentes. Un enfoque ampliamente utilizado es utilizar una variedad de métodos de identificación basados en especies de plantas y grupos de patógenos. Los métodos de identificación actuales incluyen la identificación de poblaciones, la identificación individual, la identificación de órganos, la identificación de tejidos, la identificación celular, la identificación bioquímica y la identificación molecular, que se han desarrollado en los últimos años 4,5. Ha habido éxito en estas áreas, pero también hay muchos problemas. No importa qué método se elija, los requisitos básicos de la identificación de la resistencia de la planta son consistentes, incluidos objetivos claros, resultados confiables y métodos que son simples, rápidos y fáciles de estandarizar. Este principio también debe seguirse en la identificación de la resistencia a la pimienta negra.
En condiciones de campo natural, la identificación de la resistencia a las enfermedades puede verse influenciada por muchos factores ambientales. Por lo tanto, se propuso que las hojas separadas y las raíces irrigadas se utilizaran en el laboratorio para identificar la resistencia a las enfermedades. Las hojas jóvenes de plantas sanas se inocularon in vitro en el laboratorio, y el área de hojas enfermas se midió inoculando el patógeno para identificar la resistencia a las enfermedades de las plantas6. Sin embargo, la inoculación foliar in vitro solo se puede utilizar para la identificación de resistencia general y no para estudios de interacción molecular. A pesar de esto, el estado de resistencia a la enfermedad a menudo se presenta en la inoculación radicular irrigada, causando incertidumbre en el estudio de seguimiento del mejoramiento molecular para la resistencia a la enfermedad. Por lo tanto, los métodos de detección de interiores rápidos y simples son esenciales. Este estudio tiene como objetivo proporcionar un método para la identificación de resistencias en el laboratorio.
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Protocol
1. Preparación de plantas de corte de pimienta negra para la infección
- Tome un corte de cinco nodos, de aproximadamente 40 cm de largo con un diámetro de 0,5 cm, de una rama ortotrópica sana y de crecimiento vigoroso de pimienta negra con un cuchillo de poda desinfectado o secateurs. Pode los tres nodos inferiores de las ramas plagiotrópicas, con los dos nodos superiores restantes con aproximadamente 10 hojas intactas.
- Prepare sustrato de enraizamiento que contenga tierra y estiércol animal (estiércol de vaca o estiércol de oveja) en una proporción de 1: 1. Autoclave el sustrato de enraizamiento a 121 °C durante 20 min.
- Inserte los esquejes en el sustrato de enraizamiento en un ángulo de aproximadamente 50 °, con el tercer nodo simplemente tocando la superficie del sustrato y la yema axilar en este nodo por encima del sustrato.
NOTA: La bolsa utilizada aquí tiene las siguientes dimensiones: altura de 40-60 cm, diámetro de 25-30 cm. - Vierta 10-20 L de agua sobre las raíces de la planta. Coloque los esquejes en un invernadero con un 90% de sombra a una temperatura de 25-30 ° C para el enraizamiento y el crecimiento.
2. Propagación de Phytophthora capsici (P. capsici)
NOTA: Se mantiene un stock de cultivo de Phytophthora capsici en el laboratorio de protección vegetal del Instituto de Investigación de Especias y Bebidas, Academia China de Ciencias Agrícolas Tropicales7.
- Cepille y limpie los tubérculos de papa con agua corriente del grifo y luego corte 200 g de papas en cubos de 1 cm3. Coloque algunos de los cubos en un vaso de precipitados que contenga 800 ml de agua de doble destilación (ddH2O) y hierva durante 20 minutos.
- Filtre el caldo a través de una gasa doble utilizando la filtración por gravedad. Preparar el agar de dextrosa de patata (PDA) añadiendo 20 g de dextrosa y 15 g de agar al filtrado y rematando el volumen hasta 1 L con ddH2O. Autoclave la mezcla a 121 °C durante 20 min8.
- Vierta 20 ml del PDA esterilizado en forma líquida en una placa de Petri redonda de 9 cm de diámetro dentro de una campana de flujo de aire laminar. Deje las placas PDA con tapas abiertas dentro de la campana de flujo de aire laminar durante la noche como un medio para evitar la condensación.
- Use un lazo de inoculación para recoger micelios de la cepa de Phytophthora capsici dentro de un tubo de ensayo. Coloque el inóculo con el lado micelial en contacto con el PDA en una placa de Petri.
3. Infección de pimienta negra
- Incubación
- Identifique un área de 5 cm por encima de la superficie del sustrato y cerca de las raíces en el tallo para la inoculación.
- Extraiga un disco de micelio de 0,5 cm de diámetro en el borde de crecimiento del cultivo de Phytophthora capsici en PDA en una placa de Petri utilizando un barrenador tapón.
- Dañe el tallo con una aguja de jeringa y haga tres agujeros en un patrón triangular en el área de inoculación seleccionada. Cubra cada orificio con un disco micelio. Coloque los orificios cerca uno del otro para asegurarse de que el área herida esté completamente cubierta con los discos miceliales.
- Cubra los discos miceliales con almohadillas de algodón humedecidas esterilizadas como un medio para evitar el secado. Ata la almohadilla al tallo con una tira de polietileno para mantener la posición de los discos inoculantes.
NOTA: A las 8 h después de la inoculación, los agujeros inoculados se volvieron negros y la lesión se extendió a medida que pasaba el tiempo. Las hojas se volvieron amarillas y se cayeron, y la planta inoculada murió 7-10 días después de la inoculación. No se desarrollaron lesiones en las plantas de control. La mayoría de los genes se expresaron de manera diferente después de la inoculación con Phytophthora capsici en comparación con el grupo control. El análisis histopatológico de los tejidos infectados demostró que Phytophthora capsici colonizó en el xilema.
- Muestrear los materiales vegetales de interés y almacenarlos a -80 °C en nitrógeno líquido para su uso en estudios posteriores.
NOTA: El nitrógeno líquido, las bolsas de plástico, los rotuladores, las cizallas de ramas y otros materiales se prepararon antes de los experimentos. - Después de muestrear los materiales vegetales específicos para su uso, autoclave todos los materiales vegetales restantes, el cultivo y el medio de cultivo de Phytophthora capsici sobrantes, y todos los instrumentos y artículos de laboratorio utilizados en este trabajo de inoculación.
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Representative Results
La Figura 1 muestra los síntomas de las hojas de pimienta negra después de la inoculación de P. capsici . La Figura 2 muestra los síntomas de los tallos de pimienta negra después de la inoculación de P. capsici . El patógeno infectó la pimienta negra en el tallo basal; síntomas que incluyen amarilleo de las hojas, aparición de marchitamiento, pardeamiento del xilema y ennegrecimiento de los vasos que aparecen gradualmente. La Figura 3 muestra la mayoría de los genes expresados de manera diferente después de la inoculación con Phytophthora capsici en comparación con el grupo control. La Figura 4 ha demostrado Phytophthora capsici colonizada en el xilema mediante el análisis histopatológico de tejidos infectados.
Figura 1: Los síntomas de las hojas de pimienta negra después de la inoculación de P. capsici 7. CK: grupo control; Inoculado: después de la inoculación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El síntoma de los tallos de pimienta negra después de la inoculación de P. capsici 7. Inoculado: después de la inoculación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Perfiles de expresión detallados de los genes en las raíces de pimienta negra. Las barras de error en las figuras denotan el error estándar de los niveles de expresión de tres replicaciones biológicas. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 y 48 en el eje x se refieren a 8, 12, 24 y 48 h en el control y 8, 12, 24 y 48 h, respectivamente, después de la inoculación con P. capsici. El eje y representa el nivel de expresión relativo en comparación con la ubiquitina. Cada columna representa el valor medio más SD (desviación estándar) de tres réplicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis histopatológico de tejidos infectados. La comparación entre la tinción de azul toluidina O sola (columna izquierda) y la doble tinción de azul de algodón y safranina O (columna derecha) (20X). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, la cabeza basal fue pinchada para dañar y proporcionar un sistema de inoculación eficaz en la planta de pimienta negra. Los gránulos de micelio cubrieron los tres orificios para retener la humedad y permitir que el patógeno infecte bien la planta. Después de la inoculación, las hojas se volvieron amarillas y se cayeron y las plantas inoculadas murieron. No se desarrollaron lesiones en las plantas de control. La mayoría de los genes se expresaron de manera diferente después de la inoculación con Phytophthora capsici en comparación con el grupo control. Las enfermedades fúngicas son responsables de trastornos estructurales y fisiológicos en un número significativo de cultivos, lo que lleva a una disminución de la productividad y pérdidas económicas para sus productores. Los estudios estructurales que emplean técnicas histológicas sobre el modo de penetración y colonización de los tejidos vegetales por hongos proporcionan una indicación detallada de las interacciones entre el patógeno y el tejido vegetal. Estos estudios han revelado aspectos importantes para ayudar a entender el monociclo de las enfermedades. El análisis histopatológico de los tejidos infectados demostró Phytophthora capsici colonizado en el xilema. Este método proporciona un mejor medio para resolver la inestabilidad causada por los métodos tradicionales de inoculación, incluido el empapamiento del suelo o la inmersión de la raíz. Una inoculación efectiva y un sistema de muestreo preciso para Phytophthora capsici en plantas de pimienta negra son esenciales para estudiar esta interacción planta-patógeno. También proporciona un medio prometedor para estudiar el modo de acción entre las plantas y otros patógenos de plantas transmitidos por el suelo en el mejoramiento agrícola de precisión.
Al mismo tiempo, este protocolo representa una forma más eficiente de proporcionar referencia para la incubación de vid leñosa. En estudios previos, los patógenos fueron inoculados por inmersión radicular con suspensiones de esporas cultivadas en medio V89. La suspensión de esporas tarda 7 días en estar lista, mientras que el uso de PDA para cultivar Phytophthora capsici tarda solo 5 días. La placa de PDA se selló con cinta quirúrgica permeable como un medio para evitar la contaminación de otras bacterias y hongos. Los cultivos se mantuvieron a temperatura ambiente. El método utilizado en este estudio puede ahorrar más tiempo y realizarse más rápidamente. La pimienta negra es una vid leñosa con muchos azúcares y fenoles10, y las zoosporas producidas por Phytophthora capsici generalmente se producen en los suelos, lo que dificulta infectar las vides de pimienta negra y causar inestabilidad de infección en la raíz11. Este protocolo proporciona mejores resultados, lo que permite una fuerte interacción entre las plantas de vid y los patógenos transmitidos por el suelo. La detección del proceso dinámico entre plantas y patógenos es visible y conveniente.
El método de irrigación de la raíz es rápido y ahorra tiempo, pero sigue sin resolverse un problema para la pimienta negra. Phytophthora capsici es un patógeno transmitido por el suelo que generalmente infecta las raíces de las plantas a través de esporangios y zoosporas12. En la naturaleza, los esporangios pueden propagarse a través de la lluvia y el riego. Una vez que las zoosporas se adhieren a la superficie de la planta, los tubos germinales pueden desarrollarse rápidamente y penetrar en el tejido vegetal, lo que resulta en una infección13,14. Esto puede causar incertidumbre de que la elección de las hifas como fuente de infección será similar a la suspensión de esporas. El método utilizado en este estudio comienza con pinchar la cabeza basal de la planta de pimienta negra para dañarla. El área dañada se cubre con Phytophthora capsici y se retiene la humedad, lo que garantiza que el patógeno pueda infectar bien la planta. Este método es mejor para resolver la inestabilidad causada por los métodos tradicionales de inoculación, incluido el empapamiento del suelo o la inmersión de la raíz. También es un método prometedor para estudiar el modo de acción entre las plantas y otros patógenos de plantas transmitidos por el suelo en el mejoramiento agrícola de precisión.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa Nacional Clave de I + D de China (2020YFD1001200), el Sistema de Investigación Agrícola de China (CARS-11), el fondo de investigación específico de la Plataforma de Innovación para Académicos de la Provincia de Hainan (YSPTZX202154), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hainan de China (321RC652) y la Fundación de Ciencias Naturales de China (No. 31601626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
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