Summary
Прикалывание прикорневой головки растения черного перца является коротким и экономящим время методом его повреждения. Здесь мы предоставили подробные шаги с видео для заражения растений черного перца.
Abstract
Piper nigrum L. (черный перец) - типичная древесная лоза, которая является экономически важной культурой специй во всем мире. На производство черного перца значительно влияет болезнь корневой гнили, вызванная Phytophthora capsici, которая серьезно повлияла на развитие отрасли как проблема «удушья». Однако молекулярно-генетический механизм резистентности у черного перца неясен, что приводит к медленному прогрессу в развитии новых сортов черного перца. Эффективная система посева и точного отбора проб Phytophthora capsici на растениях черного перца имеет важное значение для изучения этого взаимодействия растений и патогенов. Основной целью этого исследования является демонстрация подробной методологии, в которой базальная головка черного перца инокулируется Phytophthora capsici, а также обеспечивает ссылку на прививку древесных виноградных растений. Базальная головка растения черного перца была приколота, чтобы повредить его, а гранулы мицелиала покрыла три отверстия, чтобы сохранить влагу, чтобы патоген мог хорошо заразить растение. Этот метод обеспечивает лучший способ решения нестабильности, вызванной традиционными методами посева, включая обливание почвы или погружение корней. Он также предоставляет перспективные средства для изучения способа действия между растениями и другими почвенными патогенами растений в сельскохозяйственной точной селекции.
Introduction
Черный перец (Piper nigrum L.) является древесным альпинистом и одной из самых важных культур специй. Он известен как «Король специй»1 и культивируется в более чем 40 странах и регионах Азии, Африки и Латинской Америки. Корневая гниль Phytophthora является самым разрушительным заболеванием черного перца и вызывается оомицетом Phytophthora capsici. Этот возбудитель также поражает кукурбиты, баклажаны, перец чили и помидоры 2,3. С черным перцем целый урожай иногда может быть уничтожен этим заболеванием. Расширение посевных площадей перца ограничено в результате отсутствия устойчивых сортов, что значительно затруднило развитие китайской индустрии черного перца. Эффективная прививка и точная система отбора проб Phytophthora capsici на растениях черного перца имеют важное значение для изучения этого взаимодействия растений и патогенов.
Выявление и скрининг резистентности в ресурсах зародышевой плазмы является основным требованием для исследования патогенности патогена, а также для селекции и использования резистентных сортов. Широко используемый подход заключается в использовании различных методов идентификации на основе видов растений и групп патогенов. Современные методы идентификации включают идентификацию популяции, индивидуальную идентификацию, идентификацию органов, идентификацию тканей, идентификацию клеток, биохимическую идентификацию и молекулярную идентификацию, которые были разработаны в последние годы 4,5. В этих областях были достигнуты успехи, но есть и много проблем. Независимо от того, какой метод выбран, основные требования идентификации устойчивости растений являются последовательными, включая четкие цели, надежные результаты и методы, которые просты, быстры и легко стандартизируются. Этот принцип также должен соблюдаться при выявлении устойчивости черного перца.
В естественных полевых условиях на выявление устойчивости к болезням могут влиять многие факторы окружающей среды. Поэтому было предложено использовать в лаборатории отдельные листья и орошаемые корни для выявления устойчивости к болезням. Молодые листья здоровых растений прививали in vitro в лаборатории, а площадь больных листьев измеряли путем инокуляции возбудителя с целью выявления устойчивости растений к болезням6. Однако прививка листьев in vitro может использоваться только для общей идентификации резистентности, а не для исследований молекулярного взаимодействия. Несмотря на это, статус устойчивости к болезням часто присутствует в орошаемой корневой прививке, вызывая неопределенность в последующем исследовании молекулярной селекции для устойчивости к болезням. Поэтому быстрые и простые методы обнаружения внутри помещений имеют важное значение. Это исследование направлено на то, чтобы обеспечить метод идентификации резистентности в лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка растений черного перца к заражению
- Возьмите пятиузловый черенок, длиной около 40 см и диаметром 0,5 см, из здоровой и энергично растущей ортотропной ветви черного перца с помощью дезинфицированного ножа для обрезки или секаторов. Обрежьте три нижних узла плагиотропных ветвей, при этом два верхних узла остались с примерно 10 нетронутыми листьями.
- Готовят укореняющий субстрат, содержащий почвенный и животный навоз (коровий навоз или навоз овец) в соотношении 1:1. Автоклав укореняющего субстрата при 121 °C в течение 20 мин.
- Вставьте черенки в укореняющий субстрат под углом примерно 50°, при этом третий узел просто касается поверхности субстрата и подмышечной почки на этом узле над субстратом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сумка, используемая здесь, имеет следующие размеры: высота 40-60 см, диаметр 25-30 см. - Налейте 10-20 л воды на корни растения. Поместите черенки в теплицу с 90% оттенком при температуре 25-30 °C для укоренения и роста.
2. Размножение Phytophthora capsici (P. capsici)
ПРИМЕЧАНИЕ: Запас культуры Phytophthora capsici хранится в лаборатории защиты растений Научно-исследовательского института специй и напитков Китайской академии тропических сельскохозяйственных наук7.
- Смажьте щеткой и очистите клубни картофеля под проточной водопроводной водой, а затем нарежьте 200 г картофеля кубиками по 1см3. Поместите часть кубиков в стакан, содержащий 800 мл двойной дистиллированной воды (ddH2O) и кипятите в течение 20 минут.
- Процедить бульон через двойную марлю с помощью гравитационной фильтрации. Готовят картофельный декстрозный агар (КПК), добавляя в фильтрат 20 г декстрозы и 15 г агара и доливая объемом до 1 л с ddH2O. Автоклав смеси при 121 °C в течение 20 мин8.
- Вылейте 20 мл стерилизованного КПК в жидкой форме в круглую чашку Петри диаметром 9 см внутри ламинарной вытяжки с воздушным потоком. Оставьте пластины КПК с открытыми крышками внутри ламинарного вытяжки потока воздуха на ночь, чтобы предотвратить конденсацию.
- Используйте петлю прививки, чтобы забрать мицелий из запаса Phytophthora capsici в пробирке. Поместите инокулятор с мицелиальной стороной в контакт с КПК в чашку Петри.
3. Заражение черным перцем
- Инкубация
- Определите область 5 см над поверхностью субстрата и рядом с корнями на стебле для прививки.
- Выделите диск мицелия диаметром 0,5 см на растущем краю культуры Phytophthora capsici на КПК в чашке Петри с помощью пробки.
- Повредите стебель с помощью шприцевой иглы и сделайте три отверстия в треугольном рисунке в выбранной области прививки. Закройте каждое отверстие мицелиальным диском. Расположите отверстия близко друг к другу, чтобы область ранения была полностью покрыта мицелиальными дисками.
- Накройте мицелиальные диски стерилизованными увлажненными ватными дисками в качестве средства предотвращения высыхания. Привяжите прокладку к стеблю полиэтиленовой полоской, чтобы сохранить положение инокулирующих дисков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 8 ч после прививки привитые отверстия становились черными, и поражение расширялось с течением времени. Листья пожелтели и опали, а привитое растение погибло через 7-10 дней после прививки. Никаких поражений не развилось в контрольных растениях. Большинство генов экспрессировались по-разному после прививки Phytophthora capsici по сравнению с контрольной группой. Гистопатологический анализ инфицированных тканей показал, что Phytophthora capsici колонизирована в ксилеме.
- Возьмите образец растительного материала, представляющего интерес, и храните при -80 °C в жидком азоте для использования в последующих исследованиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкий азот, пластиковые пакеты, маркерные ручки, ножницы для ветвей и другие материалы были подготовлены до экспериментов. - После того, как конкретные растительные материалы отобраны для использования, автоклавирует все оставшиеся растительные материалы, оставшуюся культуру Phytophthora capsici и культуральную среду, а также все инструменты и лабораторную посуду, используемые в этой работе по вакцинации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны симптомы листьев черного перца после прививки P. capsici . На рисунке 2 показаны симптомы стеблей черного перца после прививки P. capsici . Возбудитель заразил черный перец на прикорневом стебле; симптомы, включая пожелтение листьев, появление увядания, потемнение ксилемы и постепенное почернение сосудов. На рисунке 3 показано большинство генов, экспрессируемых по-разному после прививки Phytophthora capsici по сравнению с контрольной группой. На рисунке 4 продемонстрирована Phytophthora capsici , колонизированная в ксилеме путем гистопатологического анализа инфицированных тканей.
Рисунок 1: Симптомы листьев черного перца после прививки P. capsici 7. CK: контрольная группа; Прививки: после прививки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Симптом стеблей черного перца после прививки P. capsici 7. Прививки: после прививки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Подробные профили экспрессии генов в корнях черного перца. Полосы ошибок на рисунках обозначают стандартную погрешность уровней экспрессии из трех биологических репликаций. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 и 48 по оси X относятся к 8, 12, 24 и 48 ч на контроле и 8, 12, 24 и 48 ч соответственно, после прививки P. capsici. Ось Y представляет относительный уровень выражения по сравнению с убиквитином. Каждый столбец представляет среднее значение плюс SD (стандартное отклонение) от трех биологических реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистопатологический анализ инфицированных тканей. Сравнение между окрашиванием только толуидиновым синим O (левая колонка) и хлопковым синим и сафранином O двойного окрашивания (правая колонка) (20X). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании базальная головка была приколота, чтобы повредить и обеспечить эффективную систему прививки в растении черного перца. Затем гранулы Mycelial покрыли три отверстия, чтобы сохранить влагу и позволить патогену хорошо заразить растение. После прививки листья пожелтели и упали, а привитые растения погибли. Никаких поражений не развилось в контрольных растениях. Большинство генов экспрессировались по-разному после прививки Phytophthora capsici по сравнению с контрольной группой. Грибковые заболевания ответственны за структурные и физиологические нарушения в значительном числе культур, что приводит к снижению урожайности и экономическим потерям для их производителей. Структурные исследования с использованием гистологических методов о способе проникновения и колонизации тканей растений грибами дают подробное представление о взаимодействиях между патогеном и растительной тканью. Эти исследования выявили важные аспекты, помогающие понять моноцикл заболеваний. Гистопатологический анализ инфицированных тканей продемонстрировал Phytophthora capsici , колонизированный в ксилеме. Этот метод обеспечивает лучшее средство для решения нестабильности, вызванной традиционными методами посева, включая обливание почвы или погружение в корни. Эффективная инокуляция и точная система отбора проб Phytophthora capsici на растениях черного перца имеют важное значение для изучения этого взаимодействия растений и патогенов. Он также предоставляет перспективные средства для изучения способа действия между растениями и другими почвенными патогенами растений в сельскохозяйственной точной селекции.
В то же время этот протокол представляет собой более эффективный способ обеспечения эталона для инкубации древесной лозы. В предыдущих исследованиях патогены были инокулированы путем погружения в корень споровыми суспензиями, культивируемыми в среде V89. Для того, чтобы споровая суспензия была готова, требуется 7 дней, тогда как использование КПК для культивирования Phytophthora capsici занимает всего 5 дней. Пластина КПК была запечатана с помощью проницаемой хирургической ленты в качестве средства предотвращения загрязнения от других бактерий и грибков. Культуры хранились при комнатной температуре. Метод, используемый в этом исследовании, может сэкономить больше времени и быть выполнен быстрее. Черный перец представляет собой древесную лозу с большим количеством сахаров и фенолов10, а зооспоры, производимые Phytophthora capsici , обычно встречаются в почвах, что затрудняет заражение лоз черного перца и вызывает нестабильность инфекции в корне11. Этот протокол обеспечивает лучшие результаты, обеспечивая сильное взаимодействие между виноградными растениями и почвенными патогенами. Обнаружение динамического процесса между растениями и патогенами является видимым и удобным.
Метод орошения корней быстрый и экономящий время, но проблема остается нерешенной для черного перца. Phytophthora capsici является почвенным патогеном, который обычно заражает корни растений через спорангии и зооспоры12. В природе спорангия способна распространяться через дождь и орошение. Как только зооспоры прикрепляются к поверхности растения, зародышевые трубки могут быстро развиваться и проникать в растительную ткань, что приводит к инфекции13,14. Это может вызвать неопределенность в отношении того, что выбор гиф в качестве источника инфекции будет похож на споровую суспензию. Метод, используемый в этом исследовании, начинается с прокалывания прикорневой головки растения черного перца, чтобы повредить его. Поврежденный участок затем покрывается Phytophthora capsici, и влага удерживается, гарантируя, что патоген может хорошо заразить растение. Этот метод лучше решает проблему нестабильности, вызванной традиционными методами посева, включая обливание почвы или погружение в корни. Это также перспективный метод изучения способа действия между растениями и другими почвенными патогенами растений в сельскохозяйственной точной селекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была финансово поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2020YFD1001200), Китайской системой сельскохозяйственных исследований (CARS-11), специальным исследовательским фондом Инновационной платформы для академиков провинции Хайнань (YSPTZX202154), Фондом естественных наук китайской провинции Хайнань (321RC652) и Фондом естественных наук Китая (No 31601626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
- Gordo, S. M., et al. High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome. BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).
- Leonian, L. H. Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov. Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).
- Ding, X., et al. Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease. Frontiers in Plant Science. 6, 830 (2015).
- Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa. Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).
- Altier, N. A., Thies, J. A. Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method. Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).
- Pratt, R. G., Rowe, D. E. Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling. Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).
- Hao, C., et al. De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici. BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).
- Dong, C., et al. Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides. Bio-protocol. 8 (23), 3099 (2018).
- English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae. Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).
- Chatterjee, S., et al. Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans). Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).
- Pfender, W. F. Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil. Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).
- Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence. HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Hardham, A., Gubler, F. Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube. Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).
