Summary
Pinpricking av det basala huvudet på svartpepparväxten är en kort och tidsbesparande metod för att skada den. Här gav vi detaljerade steg med en video för att infektera svartpepparplantor.
Abstract
Piper nigrum L. (svartpeppar) är en typisk träig vinstock som är en ekonomiskt viktig kryddgröda över hela världen. Svartpepparproduktionen påverkas avsevärt av rotrotsjukdom orsakad av Phytophthora capsici, vilket allvarligt har påverkat industrins utveckling som ett "choke point" -problem. Den molekylärgenetiska resistensmekanismen i svartpeppar är dock oklar, vilket leder till långsamma framsteg i utvecklingen av nya svartpepparsorter. Ett effektivt ympning och exakt provtagningssystem för Phytophthora capsici på svartpepparplantor är viktigt för att studera denna växt-patogeninteraktion. Huvudsyftet med denna studie är att demonstrera en detaljerad metod där svartpepparns basala huvud inokuleras med Phytophthora capsici, samtidigt som det ger en referens för ympning av träiga vinstockar. Svartpepparplantans basala huvud var nålstickat för att skada det, och mycelpellets täckte de tre hålen för att behålla fukten så att patogenen kunde infektera växten väl. Denna metod ger ett bättre sätt att lösa instabiliteten som orsakas av traditionella ympningsmetoder inklusive jorddränkning eller rotdoppning. Det ger också ett lovande sätt att studera verkningssättet mellan växter och andra jordburna växtpatogener i jordbrukets precisionsavel.
Introduction
Svartpeppar (Piper nigrum L.) är en träig klättrare och en av de viktigaste kryddgrödorna. Det är känt som "kryddkungen"1 och odlas i över 40 länder och regioner i Asien, Afrika och Latinamerika. Phytophthora rotrot är den mest förödande sjukdomen hos svartpeppar och orsakas av oomyceten Phytophthora capsici. Denna patogen infekterar också cucurbits, äggplanter, chilipeppar och tomater 2,3. Med svartpeppar kan en hel gröda ibland decimeras av denna sjukdom. Utvidgningen av pepparplanteringsområden är begränsad till följd av att resistenta sorter inte är tillgängliga, vilket avsevärt har hindrat utvecklingen av den kinesiska svartpepparindustrin. En effektiv ympning och ett exakt provtagningssystem för Phytophthora capsici på svartpepparplantor är avgörande för att studera denna växt-patogeninteraktion.
Identifiering och screening av resistens i bakterieplasmaresurser är det grundläggande kravet för att undersöka patogenens patogenicitet och avel och användning av resistenta sorter. Ett allmänt använt tillvägagångssätt är att använda en mängd olika identifieringsmetoder baserade på växtarter och patogengrupper. Nuvarande identifieringsmetoder inkluderar populationsidentifiering, individuell identifiering, organidentifiering, vävnadsidentifiering, cellidentifiering, biokemisk identifiering och molekylär identifiering, som har utvecklats under de senaste åren 4,5. Det har varit framgång på dessa områden, men det finns också många problem. Oavsett vilken metod som väljs är de grundläggande kraven för identifiering av växtmotstånd konsekventa, inklusive tydliga mål, tillförlitliga resultat och metoder som är enkla, snabba och lätta att standardisera. Denna princip måste också följas vid identifiering av svartpepparresistens.
Vid naturliga fältförhållanden kan identifieringen av sjukdomsresistens påverkas av många miljöfaktorer. Därför föreslogs att fristående löv och bevattnade rötter skulle användas i laboratoriet för att identifiera sjukdomsresistens. Unga blad från friska växter inokulerades in vitro i laboratoriet, och det sjuka lövområdet mättes genom att ympa patogenen för att identifiera sjukdomsresistensen hos växter6. In vitro-bladinokulering kan dock endast användas för allmän resistensidentifiering och inte för molekylära interaktionsstudier. Trots detta uppvisar den sjukdomsresistenta statusen ofta i den bevattnade rotinokuleringen, vilket orsakar osäkerhet i uppföljningsstudien av molekylär avel för sjukdomsresistens. Därför är snabba och enkla inomhusdetekteringsmetoder viktiga. Denna studie syftar till att tillhandahålla en metod för resistensidentifiering i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av svartpepparskärväxter för infektion
- Ta en femnodsskärning, ca 40 cm lång med en diameter av 0,5 cm, från en hälsosam och kraftigt växande ortotropisk gren av svartpeppar med en desinficerad beskärningskniv eller sekatörer. Beskär de tre nedre noderna i de plagiotropa grenarna, med de två övre noderna kvar med cirka 10 blad intakta.
- Förbered rotsubstrat som innehåller jord och djurgödsel (kogödsel eller fårgödsel) i förhållandet 1:1. Autoklavera rotsubstratet vid 121 °C i 20 minuter.
- Sätt in sticklingarna i det roterande substratet i en vinkel på cirka 50 °, med den tredje noden som bara rör vid ytan på substratet och axillärknoppen på denna nod ovanför substratet.
OBS: Påsen som används här har följande mått: höjd 40-60 cm, diameter 25-30 cm. - Häll 10-20 liter vatten över växtens rötter. Placera sticklingarna i ett växthus med 90% skugga vid en temperatur på 25-30 °C för rotning och tillväxt.
2. Förökning av Phytophthora capsici (P. capsici)
OBS: Ett lager av Phytophthora capsici-kultur upprätthålls i växtskyddslaboratoriet vid Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences7.
- Pensla och rengör potatisknölarna under rinnande kranvatten och skär sedan 200 g potatis i kuber på 1 cm3. Lägg några av kuberna i en bägare som innehåller 800 ml dubbeldestillerat vatten (ddH2O) och koka i 20 min.
- Filtrera buljongen genom dubbel gasbindning med tyngdkraftsfiltrering. Bered potatisdextrosagar (PDA) genom att tillsätta 20 g dextros och 15 g agar till filtratet och toppa volymen upp till 1 L med ddH2O. Autoklavera blandningen vid 121 °C i 20 min8.
- Häll 20 ml av den steriliserade handdatorn i flytande form i en rund petriskål med en diameter på 9 cm inuti en laminär luftflödeshuv. Lämna PDA-plattorna med lock öppna inuti den laminära luftflödeshuven över natten som ett sätt att förhindra kondens.
- Använd en inokuleringsslinga för att plocka upp mycelia från Phytophthora capsici-lager inuti ett provrör. Placera inokulatet med mycelsidan i kontakt med handdatorn i en petriskål.
3. Infektion av svartpeppar
- Inkubation
- Identifiera ett område 5 cm över substratytan och nära rötterna på stammen för ympning.
- Kärna ur en skiva av mycelia 0,5 cm i diameter vid den växande kanten av Phytophthora capsici-kulturen på PDA i en petriskål med en proppborrare.
- Skada stammen med en sprutnål och gör tre hål i ett triangulärt mönster vid det valda ympningsområdet. Täck varje hål med en mycelskiva. Placera hålen nära varandra för att säkerställa att det sårade området är helt täckt med mycelskivorna.
- Täck mycelskivorna med steriliserade fuktade bomullspuddar som ett sätt att förhindra torkning. Bind dynan på stammen med en polyetenremsa för att bibehålla positionen för de ympande skivorna.
OBS: Vid 8 timmar efter inokulering blev de inokulerade hålen svarta och lesionen förlängdes med tiden. Bladen blev gula och släppte av, och den inokulerade växten dog 7-10 dagar efter inokulering. Inga skador utvecklades i kontrollanläggningarna. De flesta av generna uttrycktes annorlunda efter inokulering med Phytophthora capsici jämfört med kontrollgruppen. Histopatologisk analys av de infekterade vävnaderna visade att Phytophthora capsici koloniserades i xylem.
- Provsmaka de växtmaterial som är av intresse och förvara vid -80 °C i flytande kväve för användning i efterföljande studier.
OBS: Flytande kväve, plastpåsar, markeringspennor, grensaxar och andra material framställdes före experimenten. - Efter att de specifika växtmaterialen har provtagits för användning, autoklavera alla återstående växtmaterial, överblivna Phytophthora capsici-odlings- och odlingsmedium och alla instrument och labware som används i detta ympningsarbete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar symtomen på svartpepparblad efter P. capsici-ympning . Figur 2 visar symtomen på svartpepparstammar efter P. capsici-ympning . Patogenen infekterade svartpeppar vid basalstammen; symtom inklusive bladgulning, vissnande utseende, xylem browning och kärlsvartning uppträder gradvis. Figur 3 visar de flesta gener som uttrycks annorlunda efter inokulering med Phytophthora capsici jämfört med kontrollgruppen. Figur 4 har visat Phytophthora capsici koloniserad i xylem genom histopatologisk analys av infekterade vävnader.
Figur 1: Symtomen på svartpepparblad efter P. capsici-ympning 7. CK: kontrollgrupp; Inokulerad: efter ympning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Symtom på svartpepparstammar efter P. capsici-ympning 7. Inokulerad: efter ympning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Detaljerade uttrycksprofiler för generna i svartpepparrötterna. Felstaplar i figurerna anger standardfelet för uttrycksnivåer från tre biologiska replikationer. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 och 48 på x-axeln hänvisar till 8, 12, 24 och 48 h på kontrollen och 8, 12, 24 respektive 48 h, efter ympning med P. capsici. Y-axeln representerar den relativa uttrycksnivån jämfört med ubiquitin. Varje kolumn representerar medelvärdet plus SD (standardavvikelse) från tre biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Histopatologisk analys av infekterade vävnader. Jämförelsen mellan toluidinblå O-färgning ensam (vänster kolumn) och bomullsblå och safranin O dubbelfärgning (höger kolumn) (20X). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie nålstickades basalhuvudet för att skada och ge ett effektivt ympningssystem i svartpepparväxten. Mycelpellets täckte sedan de tre hålen för att behålla fukt och göra det möjligt för patogenen att infektera växten väl. Efter ympning blev bladen gula och släppte av och de inokulerade växterna dog. Inga skador utvecklades i kontrollanläggningarna. De flesta gener uttryckte annorlunda efter inokulering med Phytophthora capsici jämfört med kontrollgruppen. Svampsjukdomar är ansvariga för strukturella och fysiologiska störningar i ett betydande antal grödor, vilket leder till minskad produktivitet och ekonomiska förluster för sina producenter. Strukturella studier som använder histologiska tekniker om sättet att penetrera och kolonisera växtvävnader av svampar ger en detaljerad indikation på interaktionerna mellan patogenen och växtvävnaden. Dessa studier har avslöjat viktiga aspekter för att förstå monocykeln av sjukdomar. Histopatologisk analys av infekterade vävnader visade Phytophthora capsici koloniserad i xylem. Denna metod ger ett bättre sätt att lösa instabiliteten som orsakas av traditionella ympningsmetoder inklusive jorddränkning eller rotdoppning. Ett effektivt ympning och exakt provtagningssystem för Phytophthora capsici på svartpepparplantor är avgörande för att studera denna växt-patogeninteraktion. Det ger också ett lovande sätt att studera verkningssättet mellan växter och andra jordburna växtpatogener i jordbrukets precisionsavel.
Samtidigt representerar detta protokoll ett effektivare sätt att tillhandahålla referens för inkubation av träiga vinstockar. I tidigare studier inokulerades patogener genom rotdoppning med sporsuspensioner odlade i V8 medium9. Det tar 7 dagar för sporsuspensionen att vara klar, medan användningen av PDA för att odla Phytophthora capsici tar bara 5 dagar. PDA-plattan förseglades med permeabel kirurgisk tejp som ett sätt att undvika kontaminering från andra bakterier och svampar. Kulturerna hölls vid rumstemperatur. Metoden som används i denna studie kan spara mer tid och utföras snabbare. Svartpeppar är en träig vinstock med många sockerarter och fenoler10, och zoosporerna som produceras av Phytophthora capsici förekommer i allmänhet i jordar, vilket gör det svårt att infektera svartpepparrankor och orsaka infektionsinstabilitet i roten11. Detta protokoll ger bättre resultat, vilket möjliggör en stark interaktion mellan vinstockar och jordburna patogener. Detekteringen av den dynamiska processen mellan växter och patogener är synlig och bekväm.
Den bevattnande rotmetoden är snabb och tidsbesparande, men ett problem förblir olöst för svartpeppar. Phytophthora capsici är en jordburen patogen som i allmänhet infekterar växtrötter via sporangier och zoosporer12. I naturen kan sporangierna spridas via regn och bevattning. När zoosporerna fästs på växtytan kan bakterierören snabbt utvecklas och tränga in i växtvävnaden, vilket resulterar i infektion13,14. Detta kan orsaka osäkerhet om att valet av hyfer som infektionskälla kommer att likna sporsuspensionen. Metoden som används i denna studie börjar med att nåla det basala huvudet på svartpepparplantan för att skada det. Det skadade området täcks sedan med Phytophthora capsici och fukt behålls, vilket säkerställer att patogenen kan infektera växten väl. Denna metod är bättre på att lösa instabiliteten som orsakas av traditionella ympningsmetoder inklusive jorddränkning eller rotdoppning. Det är också en lovande metod för att studera verkningssättet mellan växter och andra jordburna växtpatogener i jordbrukets precisionsavel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes ekonomiskt av National Key R&D Program of China (2020YFD1001200), China Agriculture Research System (CARS-11), den specifika forskningsfonden för The Innovation Platform for Academicians of Hainan Province (YSPTZX202154), Natural Science Foundation of Hainan Province of China (321RC652) och Natural Science Foundation of China (nr 31601626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
- Gordo, S. M., et al. High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome. BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).
- Leonian, L. H. Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov. Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).
- Ding, X., et al. Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease. Frontiers in Plant Science. 6, 830 (2015).
- Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa. Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).
- Altier, N. A., Thies, J. A. Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method. Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).
- Pratt, R. G., Rowe, D. E. Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling. Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).
- Hao, C., et al. De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici. BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).
- Dong, C., et al. Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides. Bio-protocol. 8 (23), 3099 (2018).
- English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae. Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).
- Chatterjee, S., et al. Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans). Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).
- Pfender, W. F. Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil. Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).
- Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence. HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Hardham, A., Gubler, F. Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube. Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).
