Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

استكشاف استقلاب طاقة الميتوكوندريا من كرويات الأنسجة الدقيقة 3D واحدة باستخدام تحليل التدفق خارج الخلية

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63346
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3
1School of Biosciences, University of Birmingham, 2Nanomedicine, Drug Delivery & Nanotoxicology Lab, School of Pharmacy, University of Birmingham, 3Mitochondrial Profiling Centre, University of Birmingham

ERRATUM NOTICE

Summary

ستساعد هذه البروتوكولات المستخدمين على التحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا في الكرويات المشتقة من خط الخلايا السرطانية 3D باستخدام تحليل التدفق خارج الخلية من فرس البحر.

Abstract

أصبحت المجاميع الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) ، والتي يطلق عليها كرويات ، في طليعة زراعة الخلايا في المختبر في السنوات الأخيرة. على النقيض من زراعة الخلايا كطبقات أحادية ثنائية الأبعاد وأحادية الخلية (ثقافة 2D) ، فإن زراعة الخلايا الكروية تعزز وتنظم وتدعم البنية الخلوية الفسيولوجية والخصائص الموجودة في الجسم الحي ، بما في ذلك التعبير عن بروتينات المصفوفة خارج الخلية ، وإشارات الخلية ، والتعبير الجيني ، وإنتاج البروتين ، والتمايز ، والانتشار. تم الاعتراف بأهمية ثقافة 3D في العديد من المجالات البحثية ، بما في ذلك علم الأورام والسكري وبيولوجيا الخلايا الجذعية وهندسة الأنسجة. على مدى العقد الماضي ، تم تطوير طرق محسنة لإنتاج الكرويات وتقييم وظيفتها الأيضية ومصيرها.

تم استخدام محللات التدفق خارج الخلية (XF) لاستكشاف وظيفة الميتوكوندريا في الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد مثل الكرويات باستخدام إما لوحة التقاط جزيرة XF24 أو صفيحة كروية XFe96. ومع ذلك ، لم يتم وصف البروتوكولات المتميزة وتحسين استقلاب طاقة الميتوكوندريا في الكرويات باستخدام تقنية XF بالتفصيل. يقدم هذا البحث بروتوكولات مفصلة للتحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا في كرويات 3D واحدة باستخدام لوحات كروية كروية مع محلل XFe96 XF. باستخدام خطوط الخلايا السرطانية المختلفة ، أثبتت تقنية XF أنها قادرة على التمييز بين التنفس الخلوي في كرويات 3D ليس فقط بأحجام مختلفة ولكن أيضا بأحجام مختلفة وأرقام خلايا ومحتوى الحمض النووي ونوعه.

يتم استخدام تركيزات مركب تأثير الميتوكوندريا الأمثل من oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A للتحقيق في معلمات محددة من استقلاب طاقة الميتوكوندريا في كرويات ثلاثية الأبعاد. تناقش هذه الورقة أيضا طرق تطبيع البيانات التي تم الحصول عليها من الكرويات وتتناول العديد من الاعتبارات التي يجب مراعاتها عند استكشاف التمثيل الغذائي الكروي باستخدام تقنية XF. سيساعد هذا البروتوكول في دفع البحث في النماذج الكروية المتقدمة في المختبر .

Introduction

التقدم في النماذج المخبرية في البحوث البيولوجية قد تقدم بسرعة على مدى السنوات ال 20 الماضية. وتشمل هذه النماذج الآن طرائق العضوية على رقاقة ، والأعضاء العضوية ، وكرويات الأنسجة الدقيقة 3D ، وكلها أصبحت تركيزا مشتركا لتحسين الترجمة بين الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي. يمتد استخدام النماذج المتقدمة في المختبر ، وخاصة الكروية ، إلى العديد من المجالات البحثية ، بما في ذلك هندسة الأنسجة ، وأبحاث الخلايا الجذعية ، والسرطان ، وبيولوجيا الأمراض1،2،3،4،5،6،7 ، واختبار السلامة ، بما في ذلك علم السموم الوراثي8،9،10 ، علم السموم للمواد النانوية 11 ، 12,13,14، واختبار سلامة الأدوية وفعاليتها 8,15,16,17,18,19.

مورفولوجيا الخلية الطبيعية أمر بالغ الأهمية للنمط الظاهري البيولوجي والنشاط. تسمح زراعة الخلايا في كرويات الأنسجة الدقيقة 3D للخلايا باعتماد مورفولوجيا ، ووظيفة النمط الظاهري ، والهندسة المعمارية ، أقرب إلى تلك التي لوحظت في الجسم الحي ولكن من الصعب التقاطها باستخدام تقنيات زراعة الخلايا أحادية الطبقة الكلاسيكية. في كل من الجسم الحي والمختبر ، تتأثر الوظيفة الخلوية بشكل مباشر بالبيئة الدقيقة الخلوية ، والتي لا تقتصر على الاتصالات الخلوية والبرمجة (على سبيل المثال ، تكوينات تقاطع الخلايا الخلوية ، وفرص تشكيل منافذ الخلية) ؛ تعرض الخلايا للهرمونات وعوامل النمو في البيئات المباشرة (على سبيل المثال ، التعرض الخلوي للسيتوكين كجزء من الاستجابة الالتهابية) ؛ تكوين المصفوفات الفيزيائية والكيميائية (على سبيل المثال ، ما إذا كانت الخلايا تزرع في البلاستيك المزروع بالأنسجة الصلبة أو بيئة الأنسجة المرنة) ؛ والأهم من ذلك ، كيف يتأثر التمثيل الغذائي الخلوي بالتغذية والحصول على الأكسجين وكذلك معالجة منتجات النفايات الأيضية مثل حمض اللاكتيك.

تحليل التدفق الأيضي هو وسيلة قوية لفحص التمثيل الغذائي الخلوي داخل أنظمة المختبر المحددة. وعلى وجه التحديد، تسمح تقنية XF بتحليل التغيرات الحية في الوقت الفعلي في الطاقة الحيوية الخلوية للخلايا والأنسجة السليمة. بالنظر إلى أن العديد من الأحداث الأيضية داخل الخلايا تحدث في غضون ثوان إلى دقائق ، فإن النهج الوظيفية في الوقت الفعلي لها أهمية قصوى لفهم التغيرات في الوقت الفعلي في التدفق الأيضي الخلوي في الخلايا والأنسجة السليمة في المختبر.

تقدم هذه الورقة بروتوكولات لزراعة خطوط الخلايا المشتقة من السرطان A549 (السرطان الغدي الرئوي) ، HepG2 / C3A (سرطان الخلايا الكبدية) ، MCF-7 (سرطان الثدي الغدي) ، و SK-OV-3 (سرطان المبيض الغدي) كما هو الحال في نماذج كروية ثلاثية الأبعاد في المختبر باستخدام نهج التجميع القسري (الشكل 1). كما يصف (i) بالتفصيل كيفية التحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا للكرويات ثلاثية الأبعاد المفردة باستخدام محلل Agilent XFe96 XF ، (ii) يسلط الضوء على طرق تحسين اختبارات XF باستخدام كرويات 3D واحدة ، و (iii) يناقش الاعتبارات والقيود المهمة للتحقيق في التمثيل الغذائي الكروي ثلاثي الأبعاد باستخدام هذا النهج. الأهم من ذلك ، تصف هذه الورقة كيفية جمع مجموعات البيانات التي تسمح بحساب معدل استهلاك الأكسجين (OCR) لتحديد الفسفرة التأكسدية وبالتالي وظيفة الميتوكوندريا في الكرويات الخلوية. على الرغم من عدم تحليله لهذا البروتوكول ، إلا أن معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) هو معلمة أخرى يتم قياسها جنبا إلى جنب مع بيانات OCR في تجارب XF. ومع ذلك، غالبا ما يتم تفسير ECAR بشكل سيئ أو غير صحيح من مجموعات بيانات XF. نحن نقدم تعليقا على قيود حساب ECAR باتباع الأساليب الأساسية من الشركة المصنعة للتكنولوجيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figure 1
الشكل 1: سير العمل الرسومي لتوليد الكرويات الخلوية وتحليل التدفق خارج الخلية والمقايسات النهائية. تم استزراع أربعة خطوط خلايا سرطانية بشكل انتقائي كطبقات أحادية (A) ، منفصلة عن قوارير زراعة الأنسجة ، وزرعت في صفائح دقيقة منخفضة للغاية من 96 بئرا لتشكيل كرويات (B). تم زرع سرطان الرئة A549 ، وسرطان الكبد HepG2 / C3A ، وسرطان المبيض الغدي SK-OV-3 ، وخلايا سرطان الثدي MCF-7 في 1 × 10 3-8 × 103 خلايا / بئر ونمت لمدة تصل إلى 7 أيام لتشكيل كرويات واحدة وتحسين كثافة البذر الكروي ووقت الزراعة عن طريق المراقبة المستمرة والقياسات المستوية. بمجرد تشكيلها ، تم غسل الكرويات المفردة في وسط XF خال من المصل وزرعها بعناية في صفائح دقيقة للفحص الكروي ، مغلفة مسبقا ب poly-D-lysine (C). خضعت الكرويات لتحليل التدفق خارج الخلية باستخدام محلل XFe96 باستخدام عدة بروتوكولات لمعالجة: (1) الحجم الكروي الأمثل لاستجابة التنفس الميتوكوندريا القاعدية. (2) المعايرة المحسنة لمثبطات الجهاز التنفسي الميتوكوندريا ؛ (3) تحسين وضع الكروية داخل الآبار الصغيرة. (د) استخدمت تحليلات ما بعد XF، والفحص المجهري لتباين الطور، وتحديد كمية الحمض النووي الكروي لتطبيع البيانات وغيرها من الفحوص المخبرية في المراحل النهائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. زراعة خطوط الخلايا السرطانية كما 3D في كرويات المختبر

خط الخلية وصف الوسط الثقافي مصدر
إيه 549 خط خلايا سرطان الرئة RPMI 1640 المجموعة الأوروبية من مزارع الخلايا الموثقة (ECACC)
بيروفات الصوديوم (1 ملليمتر)
البنسلين - الستربتومايسين - (100 U / مل - 100 ملغ / مل)
10٪ (v/v) FBS
HepG2/C3A خط خلايا سرطان الكبد ، وهو مشتق نسيلي من خط خلية HepG2 الأصلي DMEM مجموعة زراعة الأنسجة الأمريكية (ATCC)
البنسلين - الستربتومايسين - (100 U / مل - 100 ملغ / مل)
10٪ (v/v) FBS
MCF7 خط خلايا سرطان الثدي الغدي RPMI 1640 المجموعة الأوروبية من مزارع الخلايا الموثقة (ECACC)
بيروفات الصوديوم (1 ملليمتر)
البنسلين - الستربتومايسين - (100 U / مل - 100 ملغ / مل)
10٪ (v/v) FBS
SK-OV-3 خط خلايا سرطان المبيض الغدي RPMI 1640 المجموعة الأوروبية من مزارع الخلايا الموثقة (ECACC)
بيروفات الصوديوم (1 ملليمتر)
البنسلين - الستربتومايسين - (100 U / مل - 100 ملغ / مل)
10٪ (v/v) FBS
مكون متوسط فحص RPMI (حجم نهائي 50 مل)
قاعدة متوسطة فرس البحر الرقيق XF RPMI، درجة الحموضة 7.4
الجلوكوز (1 مليون مخزون معقم) 11 مللي متر (0.55 مل من محلول المخزون)
L-الجلوتامين (200 مللي متر مخزون معقم) 2 ملليمتر (0.5 مل من محلول المخزون)
بيروفات الصوديوم (مخزون معقم 100 ملليمتر) 1 ملليمتر (0.5 مل من محلول المخزون)

الجدول 1: وسائط خط الخلايا السرطانية وتركيبات وسائط XF.

  1. استزرع جميع خطوط الخلايا باستخدام تقنية زراعة الأنسجة المعقمة القياسية وتأكد من خلوها من الميكوبلازما باستخدام مجموعة فحص مناسبة.
  2. استزرع خطوط الخلايا في قوارير زراعة الأنسجة T75 أو ما يعادلها ، باستخدام الوسط الموصى به (الجدول 1). قم بزراعة خطوط الخلايا إلى 65-80٪ من الالتقاء ومرورها بانتظام بحد أقصى 25 مقطعا.
  3. اشطف قوارير زراعة الخلايا مرتين في محلول ملحي معدل مخزن بالفوسفات (DBPS) من دولبيكو.
  4. افصل الخلايا عن القوارير ب 3 مل من كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية وتأكد من الانفصال عن طريق الفحص المجهري.
  5. قم بشفط تعليق الخلية المنفصل بلطف لضمان تعليق خلية واحدة وإلغاء تنشيط كاشف تفكك الخلية باستخدام 7 مل من وسط زراعة الأنسجة الكامل.
  6. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق، والتخلص من supernatant، وإعادة تعليق الخلايا في وسط كامل.
  7. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي ومعايرة كثافة الخلايا المطلوبة المطلوبة للبذر.
    ملاحظة: لزرع صفيحة كاملة من 96 بئرا عند 100 ميكرولتر / بئر عند 4 × 103 خلايا / بئر ، يجب معايرة الخلايا إلى 4 × 104 خلايا / مل في حجم موصى به من 12 مل.
  8. قم بصب تعليق الخلية في خزان معقم وقم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة صغيرة طاردة للخلايا باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    ملاحظة: يجب فقط زرع 60 بئرا داخلية من صفيحة صغيرة وملء الباقي ب DPBS. سيشكل هذا حاجزا للتبخر ، ويضمن التجانس الكروي عبر اللوحة ، ويقلل من تأثيرات حافة اللوحة.
  9. الصفائح الكروية المجهرية لأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 15 دقيقة لإجبار الخلايا على الدخول في مجاميع فضفاضة.
  10. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة لا تقل عن 3 أيام لضمان تكوين كروية.
  11. إجراء الفحص المجهري لتباين الطور باستخدام الممارسات المختبرية الموحدة لمراقبة نمو الكرويات. قم بتجديد وسط زراعة الخلايا كل 3 أيام أو مرتين أسبوعيا عن طريق إجراء تبادل متوسط نصف حجم.

2. فحص استقلاب طاقة الميتوكوندريا للكرويات المفردة باستخدام تقنية التدفق خارج الخلية (XF)

  1. إعداد الفحص (قبل يوم واحد)
    1. تحقق من الجدوى الكروية باستخدام مجهر ضوئي مقلوب مع تباين الطور عند تكبير 4x لضمان بنية كروية سليمة ومورفولوجيا وتوحيد عام بين العينات.
    2. قم بترطيب خرطوشة المستشعر.
      1. Aliquot ~ 20 مل من المعايرة في أنبوب مخروطي.
      2. ضع الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على المعايرة في حاضنة غير CO2 37 °C بين عشية وضحاها.
      3. قم بإزالة المحتويات من مجموعة أدوات الفحص.
      4. قم بإزالة خرطوشة المستشعر من لوحة الأداة المساعدة وضعها رأسا على عقب على سطح العمل بجوار لوحة الأداة المساعدة.
      5. ماصة 200 ميكرولتر من DDH2O المعقمة في كل بئر من لوحة الأداة المساعدة لخرطوشة المستشعر باستخدام ماصة P300 متعددة القنوات.
      6. ضع خرطوشة المستشعر أعلى لوحة الأداة المساعدة.
      7. تحقق من أن مستوى المياه في كل بئر مرتفع بما يكفي لغمر مجسات الاستشعار.
      8. انقل خرطوشة المستشعر المجمعة إلى حاضنة غير CO2 37 درجة مئوية واتركها طوال الليل.
        ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة قبل 12-72 ساعة من بدء الفحص.
  2. معطف كروية فحص microplate
    1. باستخدام تقنيات التعقيم ، أضف 30 ميكرولتر / بئر من محلول Poly-D-Lysine المعقم (0.1 mg / mL) إلى الصفيحة الدقيقة الكروية واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بشفط المحلول من كل بئر من الصفيحة الدقيقة الكروية ، وعكس اللوحة ، واضغط عليها بقوة على المناديل الورقية لإزالة أي محلول متبقي.
    3. اغسل الطبق مرتين باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من DDH2O المعقم.
    4. بعد الغسيل النهائي ، اقلب الصفيحة الدقيقة واضغط عليها بقوة على المناديل الورقية لإزالة أي ماء متبقي.
    5. اترك اللوحة لتجف في الهواء لمدة 30 دقيقة قبل استخدامها أو تخزينها عند 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.
      ملاحظة: يجب طلاء الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي بمادة لاصقة جزيئية لضمان تثبيت الكرويات في الجزء السفلي من الصفيحة الدقيقة. بدون مادة لاصقة جزيئية ، يمكن أن يتم إزاحة الكرويات وتتداخل مع نتائج الفحص. يمكن أيضا استخدام مواد لاصقة جزيئية أخرى كبديل ل Poly-D-Lysine لألواح الطلاء المسبق. يمكن تخزين الألواح المطلية مسبقا عند 4 درجات مئوية ولكن يجب تركها لتوازن درجة حرارة الغرفة قبل بدء الفحص.
  3. إعداد XF فحص المتوسطة
    1. تحضير وسيط XF RPMI، كما هو مفصل في الجدول 1، ومرشح معقم بفلتر حقنة 0.22 ميكرومتر
  4. إعداد الفحص (1 ساعة قبل الفحص)
    1. قم بتسخين فحص XF RPMI المكمل بدرجة حرارة متوسطة إلى 37 درجة مئوية.
    2. قم بتسخين صفيحة الفحص الكروية المطلية مسبقا في حاضنة غير CO2 37 °C أو حمام جاف.
    3. قم بإعداد خرطوشة المستشعر.
      1. أخرج الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على المعايرة وخرطوشة المستشعر من حاضنة الهواء.
      2. قم بإزالة خرطوشة المستشعر من لوحة الأداة المساعدة وضعها رأسا على عقب على سطح العمل.
      3. باستخدام ماصة P300 متعددة القنوات ، استنشق الماء من لوحة المرافق وتخلص منها.
      4. صب محلول المعايرة في خزان كاشف معقم وأضف 200 ميكرولتر / بئر من المعايرة المسخنة مسبقا إلى لوحة المرافق باستخدام ماصة P300 متعددة القنوات.
      5. التقط خرطوشة المستشعر وضعها مرة أخرى أعلى لوحة الأداة المساعدة، مما يضمن غمر المستشعرات جيدا في العيار.
      6. انقل خرطوشة المستشعر المجمعة مرة أخرى إلى الحاضنة غير CO2 37 °C حتى تصبح جاهزة لتحميل حلول حقن المنفذ.
  5. اغسل الكرويات باستخدام وسيط الفحص.
    1. قم بإزالة لوحة الاستزراع الكروي من حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 وراقب الكرويات تحت المجهر لضمان سلامتها قبل خطوات النقل الكروية.
    2. قم بتحميل جميع آبار اللوحة الكروية ب 180 ميكرولتر / بئر من وسط الفحص المحمي مسبقا ، بما في ذلك أي آبار تصحيح الخلفية.
    3. املأ جزئيا طبق بتري 7 سم ب 3 مل من وسط الفحص.
    4. باستخدام ماصة متعددة القنوات محملة بأطراف ماصة فتحة عريضة ، انقل الكرويات من لوحة الاستزراع 96 بئرا إلى أطباق بتري 7 سم عن طريق ضبط الماصة على حجم شفط يتراوح بين 10 و 50 ميكرولتر.
  6. كرويات البذور في الصفائح الدقيقة لفحص كروي مغلف مسبقا.
    1. باستخدام مجهر تشريح وجهاز لايت بوكس، انقل الكرويات من طبق بتري إلى صفيحة الفحص الكروية كما هو مفصل أدناه.
      1. اضبط حجم ماصة أحادية القناة مزودة بطرف ماصة فتحة عريضة على 20 ميكرولتر وقم بشفط كروي واحد بعناية. ضع الطرف مباشرة في وسط كل بئر من الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي واسمح للجاذبية بإخراج كروي واحد في وسط كل بئر ، أي لا تطرد أي وسط من طرف الماصة وتسمح للعمل الشعري بسحب الكروية من طرف الماصة. لتأكيد الاستخلاص ، يمكن إعادة محتويات الماصة إلى طبق بتري 7 سم تحت المجهر.
        ملاحظة: عادة ما يستغرق إزالة الجاذبية من كروي واحد 15-30 ثانية اعتمادا على حجم/كثافة الكروي. خلال هذا الوقت ، لا ينبغي إزالة الماصة. يجب أن تكون أي آبار تصحيح خلفية خالية من الكرويات وتحتوي فقط على وسيط مقايسة. تحت المجهر ، تأكد من موضع كل كروي. يجب وضع كل كروي بشكل مثالي داخل وسط كل بئر.
      2. بمجرد نقل جميع الكرويات إلى الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي ، انقل اللوحة إلى حاضنة غير CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل الفحص.

3. إعداد وتحميل المركبات في خرطوشة الاستشعار لاختبارات XF

استراتيجية الحقن كمبوند (ميناء) XFe96 حجم بدء تشغيل البئر الصغير (ميكرولتر) تركيز البئر النهائي المطلوب حجم المنفذ (ميكرولتر) النهائي XFe96 ميكروويل حجم ما بعد الحقن (ميكرولتر) تركيز المخزون العامل
1 أوليغوميسين (أ) 180 3 ميكروغرام/مل 20 200 30 ميكروغرام/مل
روتينون (ب) 200 2 ميكرومتر 20 220 22 ميكرومتر
أنتيميسين أ (ب) 200 2 ميكرومتر 20 220 22 ميكرومتر
2 BAM15 (أ) 180 5 ميكرومتر 20 200 50 ميكرومتر
روتينون (ب) 200 2 ميكرومتر 20 220 22 ميكرومتر
أنتيميسين أ (ب) 200 2 ميكرومتر 20 220 22 ميكرومتر

الجدول 2: تركيزات مركبات الميتوكوندريا للتحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا للكرويات ثلاثية الأبعاد المفردة باستخدام محلل XFe96.

  1. قم بإعداد تركيزات مخزون العمل لكل مركب كما هو مذكور في الجدول 2 باستخدام وسيط فحص XF RPMI المكمل بالكامل والمسخن مسبقا.
  2. قم بتوجيه لوحة الخرطوشة (مقترنة بلوحة الأداة المساعدة) من الناحية العمودية ، 1-12 من اليسار إلى اليمين.
  3. في حالة استخدام دليل تحميل، ضعه فوق لوحة الخرطوشة وفقا لإجراء التحميل الجيد، على سبيل المثال، إذا تم تحميل المنفذ A أولا، فتأكد من أن A مرئي في الزاوية العلوية اليمنى من الدليل.
  4. انقل محلول العمل لكل مركب إلى خزان مناسب ، وباستخدام ماصة P100 متعددة القنوات معايرة ، قم بتوزيع 20 ميكرولتر في جميع المنافذ المقابلة. كرر لكل مركب في المنافذ المتبقية.
    ملاحظة: إذا لم يتم استخدام أي منافذ على لوحة خرطوشة المستشعر، فيمكن تركها فارغة أو تعبئتها بوسيط الفحص. إذا تم استخدام مجموعة مختارة فقط من خطاب منفذ معين ، فتأكد من تحميل المنافذ الأخرى المقابلة لذلك الحرف بوسيط فحص ؛ خلاف ذلك ، سيتم حقن الهواء في البئر ، مما يعرض للخطر النتائج في تلك الآبار.
  5. بعد تحميل المنفذ، قم بإزالة أدلة تحميل اللوحة (إذا تم استخدامها) وقم بإعداد المحلل لتحميل خرطوشة المستشعر.
    ملاحظة: إذا لم يتم تشغيل الفحص مباشرة بعد تحميل المنافذ، فضع الغطاء مرة أخرى على خرطوشة المستشعر وضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة الهواء التي تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتحميل في الماكينة.

4. تصميم المقايسة واستراتيجيات الحقن والحصول على البيانات

  1. إجراء الفحص
    1. قم بتشغيل المحلل والاتصال بوحدة التحكم (الكمبيوتر).
      ملاحظة: يمكن التحقق من ذلك من خلال حالة اتصال الجهاز في لوحة عنصر واجهة المستخدم في برنامج Wave Controller.
    2. انتقل إلى صفحة القوالب في برنامج WAVE ، وابحث عن ملف قالب الفحص للتجربة وانقر نقرا مزدوجا فوقه لفتحه.
      ملاحظة: إذا لم يظهر قالب الفحص في طريقة عرض القوالب ، فقم باستيراد ملف القالب إلى مجلد القالب من محرك أقراص شبكة مشترك أو محرك أقراص USB محمول.
    3. لبدء الفحص، انقر فوق علامة التبويب تشغيل المقايسة .
      ملاحظة: إذا تم تخصيص تعريفات المجموعة بشكل صحيح داخل خريطة اللوحة، فسيكون الفحص جاهزا للتشغيل كما هو موضح في العلامة الخضراء على الجانب الأيمن من الصفحة. في هذه المرحلة ، يمكن إدخال أي معلومات إضافية في صفحة ملخص الفحص أو الصفحة التي تركت فارغة ؛ انتقل إلى الخطوة التالية. نظرا لتأخر اختراق معدلات الميتوكوندريا في كرويات الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد (الشكل 2) ، استخدم معلومات بروتوكول القياس الموضحة في الجدول 3.
فترة القياس رقم الحقن والمنفذ تفاصيل القياس مدة الفترة (h:min:s)
المعايره لا ينطبق يقوم محللو XF دائما بإجراء هذه المعايرة للتأكد من دقة القياسات 00:20:00 (هذا متوسط ويمكن أن يختلف بين الآلات)
التكافؤ لا ينطبق يحدث التوازن بعد المعايرة ويوصى به. 00:10:00
القاعديه لا ينطبق الدورات = 5 00:30:00
مزيج = 3:00
الانتظار = 0:00
القياس = 3:00
أوليغوميسين / BAM15 الحقن 1 (المنفذ A) الدورات = 10 01:00:00
مزيج = 3:00
الانتظار = 0:00
القياس = 3:00
روتينون + مضاد للمايسين أ الحقن 2 (المنفذ B) الدورات = 10 01:00:00
مزيج = 3:00
الانتظار = 0:00
القياس = 3:00
مجموع الوقت: 03:00:00

الجدول 3: إعداد البروتوكول للتحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا للكرويات ثلاثية الأبعاد المفردة باستخدام محلل XFe96.

  1. انقر فوق بدء التشغيل لإظهار مربع الحوار حفظ الموقع .
  2. أدخل موقع الحفظ لملف النتيجة، وضع خرطوشة المستشعر المجمعة على الدرج الحراري الذي يظهر من الباب على جانب المحلل. انتظر حتى يتم فتح الدرج الحراري تلقائيا والشاشة لعرض رسالة لوحة الأداة المساعدة معايرة التحميل . قبل اتباع المطالبات التي تظهر على الشاشة، تأكد من أ) الملاءمة المناسبة لخرطوشة المستشعر على لوحة الأداة المساعدة، وب) إزالة الغطاء من خرطوشة المستشعر، و ج) الاتجاه الصحيح لخرطوشة المستشعر على لوحة الأداة المساعدة.
  3. اتبع الأوامر التي تظهر على الشاشة لبدء معايرة خرطوشة المستشعر.
    ملاحظة: الوقت المستغرق لإكمال المعايرة هو حوالي 10-20 دقيقة (للمقايسات عند 37 درجة مئوية).
  4. بعد معايرة خرطوشة المستشعر، قم بتحميل الصفيحة الدقيقة الكروية في المحلل باتباع الإرشادات التي تظهر على الشاشة على وحدة تحكم الموجة لبدء خطوة التوازن لمدة 12 دقيقة.
    ملاحظة: تشير المربعات الخضراء ذات العلامات البيضاء إلى معايرة "جيدة" لهذا البئر. إذا فشلت أي آبار في توفير معايرة "جيدة" ، الإشارة إليها بصندوق أحمر وصليب أبيض. يجب ملاحظة هذه الآبار واستبعادها من أي تحليل بعد اكتمال الفحص باستخدام علامة التبويب فحص التعديل .
  5. انتظر حتى يبدأ المحلل تلقائيا في الحصول على قياسات خط الأساس بعد أن يكمل الجهاز خطوة التوازن (كما هو موضح في بروتوكول الأداة).
  6. لإكمال التجربة، اتبع الأوامر التي تظهر على الشاشة على وحدة تحكم WAVE.
    ملاحظة: بمجرد إزالة الصفيحة الدقيقة الكروية من المحلل ، تخلص من خرطوشة المستشعر واترك اللوحة الكروية جانبا لمزيد من التحليل إذا لزم الأمر (على سبيل المثال ، تحديد كمية الحمض النووي المزدوج (ds). إذا لم تكن اللوحة الدقيقة مطلوبة لمزيد من التحليل ، فيمكن التخلص منها مع خرطوشة المستشعر.
  7. انتظر حتى يظهر مربع حوار الفحص وعرض النتائج أو العودة إلى طريقة عرض القوالب .

5. استراتيجيات تطبيع البيانات وتحليلها - تطبيع ما بعد الفحص والمقايسات النهائية (خطوات اختيارية)

  1. تطبيع البيانات
    1. لتطبيع البيانات الكروية، ارجع إلى سلسلة البروتوكولات ذات الصلة باستراتيجيات تطبيع البيانات لحساب حجم الكروية وحجمها وتحديد حجم dsDNA كميا في الفحوصات الكروية. وقد أدرجت هذه الملفات كملفات تكميلية؛ انظر الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2.
  2. تحليل البيانات
    1. لتصدير البيانات إلى أحد مولدات التحليل التلقائي، اتبع أوامر تصدير البيانات الموجودة على وحدة تحكم WAVE وحدد مولد التصدير الذي يطابق نوع المقايسة. بدلا من ذلك ، قم بتصدير ملف البيانات وتحميله إلى تحليلات Seahorse.
      ملاحظة: الجانب السلبي لمولدات التقارير وتحليلات Seahorse هو أن تحليل البيانات يقتصر على كيفية تصميم اختبار XF ولا يسمح بأخذ المتوسطات عبر دورات القياس. يسمح التصدير اليدوي لمجموعات البيانات من برنامج الأداة بتفضيل المستخدم في هذا الصدد. بالنظر إلى أن استراتيجية الحقن لتقييم التنفس الميتوكوندريا للكرويات 3D من المرجح أن تختلف عن تلك الخاصة باختبار "MitoStress" النموذجي ، فقد تم تطوير سلسلة من قوالب جداول البيانات للمساعدة في تحليل مجموعات البيانات هذه ، الخاصة بمزارع الخلايا 3D وسيتم توفيرها عند الطلب. ستوفر ملفات قوالب البيانات هذه بيانات عن المعلمات التنفسية الرئيسية للميتوكوندريا المفصلة والمفسرة في الشكل 2.
    2. لتحليل البيانات، قم بتصدير البيانات كتقرير جدول بيانات من برنامج وحدة تحكم WAVE واستخدم قالب جدول بيانات مستقل للتحليل.

Figure 2
الشكل 2: الواصفات التخطيطية للمعلمات المستمدة من تحليلات بيانات التدفق خارج الخلية. اختصار: OCR = معدل استهلاك الأكسجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للحصول على كرويات مدمجة جيدة التكوين ، تم تحسين كل خط خلية بشكل فردي لكثافة البذر ومدة الزراعة (الشكل 3). شكلت خطوط الخلايا A549 و HepG2 / C3A و SK-OV-3 في البداية مجاميع فضفاضة لم تتطور إلى كرويات مستديرة ذات محيط محدد بوضوح إلا بعد 7 أيام في الثقافة. على العكس من ذلك ، يمكن أن تشكل خلايا MCF-7 كرويات في غضون 3 أيام. كانت هناك علاقة واضحة بين كثافة بذر الخلايا الأولية وحجم كروي بعد فترة الاستزراع لجميع النماذج الكروية. تم تحسين حجم كروي ومورفولوجيا لكثافة البذر. بدأ المورفولوجيا والدائرية في الانخفاض مع زيادة حجم كروي في جميع النماذج. تم تحسين استراتيجيات البذر لخطوط الخلايا في 4 × 10 3 خلايا / بئر لخلايا A549 و SK-OV-3 ؛ تم تحسين خلايا HepG2 / C3A سابقا في أماكن أخرى إلى 1 × 10 3 خلايا / بئر ، وتم استخدام خلايا MCF-7 في 4 × 103 خلايا / بئر في جميع المقاييس. في استراتيجيات البذر المحسنة ، كان حجم الكروية بين 5.46 × 107 μm3 (SK-OV-3) و 1.45 × 108 μm3 (A549) (الشكل 3B). كان لجميع الأنواع الكروية علاقة خطية بين كثافة البذر الأولية والحجم الكروي حيث كان لدى A549 و HepG2 / C3A قيم R2 من 0.957 و 0.947 ، على التوالي. وجد أن كلا من أحجام MCF-7 و SK-OV-3 الكروية لها علاقة أكبر بكثافة البذر الأولية ، R2 = 0.977 (الشكل 3A).

تم حساب الدائرية الكروية باستخدام قياس مستوى الصورة داخل برنامج تحليل FIJI باستخدام الأقطار الكروية الطويلة والقصيرة. كان للتماثل الكروي المثالي دائرية = 1.0 ؛ يشير الانحراف عن 1.0 إلى فقدان الدائرية (الشكل 3C). كانت الدائرية أكبر في الكرويات MCF-7 من النماذج الأخرى حيث تم الحفاظ على الدائرية بين 0.83 و 0.9 في جميع كثافات البذر. وعلى سبيل المقارنة، لم يكن المحيط الخارجي للكرويات SK-OV-3 محددا بوضوح، وكان حجم الكروية أصغر بكثير حتى بعد 7 أيام في الثقافة، مما أسفر عن كرويات بحد أقصى دائري يبلغ 0.61 بكثافة بذر تبلغ 4 × 103/well. كما وجد أن خلايا HepG2/C3A تشكل كرويات ضيقة وجيدة التكوين مع مورفولوجيا متساوية عبر مساحة سطح جميع الكرويات، مع الحفاظ على الدائرية عند 0.79 للخلايا المزروعة في 1 × 103 خلايا/بئر. ويبدو أن خلايا A549 تتبع اتجاها حيث تم تعزيز الدوران الكروي والتشكل بكثافة البذر؛ ومع ذلك ، لم تكن الدائرية أكبر من 0.63 عند الكثافة المستخدمة في هذه التجارب.

تم حساب تنفس الميتوكوندريا القاعدية على أنه OCR تم قياسه من الكرويات البذرة في 1 × 10 3 أو 2 × 10 3 أو 4 × 10 3 أو 8 × 10 3 خلايا/بئر في الصفائح الدقيقة المستزرعة الكروية شديدة التعلق (الشكل 3D). بالنسبة لجميع أنواع الكرويات، زاد التعرف الضوئي على الحروف مع الحجم الكروي وكان مرتبطا خطيا بالحجم الكروي مع R2 الأعلى في الكرويات MCF-7 عند 0.988 والأدنى في الكرويات SK-OV-3 عند 0.744 (الشكل 3E). كان OCR المقاس مختلفا إحصائيا بين جميع المجموعات التجريبية. كان لدى A549 أدنى OCR ، حيث حقق 18 pmol / min / well فقط في أكبر حجم كروي (الشكل 3D). وعلى العكس من ذلك، أسفرت الكرويات MCF-7 عن التعرف الضوئي على الحروف مماثل عند أصغر حجم كروي بعد 3 أيام فقط في الثقافة، لتصل إلى الحد الأقصى للتمييز على الحروف الأساسي البالغ 53 pmol/min/well لأكبر حجم كروي (الشكل 3D). أسفرت HepG2 / C3A عن بيانات OCR متسقة للغاية مع حجم كروي ومورفولوجيا. في الكرويات HepG2/C3A المزروعة من 1 × 103 خلايا/بئر، بلغ معدل التعرف الضوئي على الحروف الأساسي 15 بمول/دقيقة/بئر، وزاد إلى 52 بمول/دقيقة/بئر كحد أقصى في أكبر الكرويات (الشكل 3D). كان التعرف الضوئي على الحروف في الكرويات SK-OV-3 معنويا فقط بين الكرويات المزروعة من 4 × 10 3 خلايا / بئر و 8 × 10 3 خلايا / بئر ، مع اختلاف ضئيل لوحظ في الكرويات المزروعة بين 1 × 10 3 أو 2 × 10 3 أو 4 × 10 3 خلايا. على الرغم من الاختلافات في الحجم ، كانت بيانات OCR متشابهة للغاية بين HepG2 / C3A و MCF-7 كروية في جميع نقاط الحجم. بالنسبة إلى الحجم الكروي (μm3) ، كان OCR الأساسي بواسطة MCF-7 كرويا مشابها لحجم الكرويات HepG2 / C3A المزروعة على مدار 7 أيام من 1000 خلية لكل بئر.

Figure 3
الشكل 3: تحدد بارامترات النمو الكروية تنفس الميتوكوندريا الأساسي. (A) A549 و HepG2/C3A و MCF-7 و SK-OV-3 الكروية تم تحسينها لكثافة البذر ورصد نموها عند 1 × 10 3 و 2 × 10 3 و 4 × 10 3 و 8 × 10 3 خلايا/بئر في كل من الصور المجهرية الضوئية، من أعلى اليسار إلى أسفل اليمين، على التوالي؛ أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) تم حساب الحجم الكروي باستخدام بيانات مستوية من الصور المجهرية المجمعة ومقارنتها باستخدام إحصائية بيرسون للارتباط؛ تمثل الخطوط المنقطة توزيع فاصل الثقة بنسبة 95٪. (ج) تمت مقارنة المورفولوجيا الكروية بحساب الدائرية. (D) تم قياس OCR 5x ، وبعد ذلك تمت إضافة rotenone-antimycin A لحساب معدل التنفس غير الميتوكوندريا باستخدام محلل Agilent Seahorse XFe96. تمت مقارنة OCR القاعدية المقاسة على أنهاOCR - OCR rr / a بين كثافة البذر (D) والحجم الكروي (E). البيانات هي متوسطات ± SEM من 5-8 نسخ متماثلة للبئر لكل نوع كروي وكثافة بذر الخلايا. الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين; OCRالقاعدية = التنفس الميتوكوندريا القاعدية. OCR rr / a = OCR بعد إضافة rotenone-antimycin A. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يعد التركيز والدورة الزمنية للتعرض لمعدلات الجهاز التنفسي في تحليل XF خطوة حاسمة في تحسين المقايسة. تم حقن مركبات المغير التنفسي - أوليغوميسين ، BAM15 ، وهو خليط من الروتينون - أنتيميسين A - أو التحكم في مركبة DMSO بالتتابع من خلال منافذ حقن خرطوشة الاستشعار في آبار الصفائح الدقيقة التي تحتوي على الكرويات MCF-7 (الشكل 4A). تم الانتهاء من أربع دورات قياس لتحديد متوسط التعرف الضوئي على الحروف القاعدي من 30-40 pmol / min / well لجميع مجموعات العينات. وخلال الفترة المتبقية من مدة الفحص، أضيفت معدلات الجهاز التنفسي بالتتابع كل 5 دورات قياس لتحقيق تركيزات نهائية للبئر تبلغ 0.5 ميكرومتر (0.5 ميكروغرام/مل أوليغومايسين) بعد الحقن 1؛ 2.0 ميكرومتر (2 ميكروغرام / مل أوليغومايسين) بعد الحقن 2 ؛ 5 ميكرومتر (5 ميكروغرام / مل أوليغومايسين) بعد الحقن 3 ؛ وأخيرا ، أقصى تركيز بئر يبلغ 11 ميكرومتر (11 ميكروغرام / مل أوليغومايسين) بعد الإضافة التسلسلية الرابعة. لم تستجب الكرويات MCF-7 لتحكم السيارة طوال التجربة (الشكل 4A). تغير التعرف الضوئي على الحروف القاعدي على الفور بعد الحقن الأول لكل مركب على حدة بأقل تركيز قدره 0.5 ميكرومتر أو 0.5 ميكروغرام / مل أوليغوميسين (الشكل 4B). تم تخفيض OCR في الكرويات MCF-7 مع oligomycin من 41 pmol / min / well إلى 23 pmol / min / well بعد 5 دورات قياس بعد الحقن الأول من 0.5 ميكروغرام / مل (الشكل 4B).

استجابة ل 0.5 ميكرومتر BAM15 ، تمت زيادة OCR من 33 إلى 41 pmol / min / well قبل الحقن الثاني (الشكل 4C). وبالمقارنة ، فإن مزيج من الروتينون بالإضافة إلى antimycin A خفض OCR من 37 إلى 13 pmol / min / well قبل الحقن الثاني (الشكل 4D). كشفت الآثار الحركية أيضا عن انخفاض خطي ثابت (oligomycin و rotenone-antimycin A) أو زيادة (BAM15) في OCR. بالنسبة لجميع أنظمة الجرعات المركبة، تم تحقيق التعرف الضوئي على الحروف في حالة ثابتة خلال 10-12 دورة قياس كاملة (60-72 دقيقة) بتركيز بئر إجمالي قدره 2 ميكرومتر BAM15، و 2 ميكرومتر روتينون، و 2 ميكرومتر مضاد للمايسين A، و 2 ميكروغرام/مل أوليغوميسين (الشكل 4A). وصل معدل استهلاك الأكسجين إلى هضبة ثابتة عند ~ 19 pmol / min / well (oligomycin) ، و 52 pmol / min / well (BAM15) ، و 10 pmol / min / well (rotenone-antimycin A) (الشكل 4A). زيادة تركيز مركب من oligomycin، BAM15، أو الروتينون بالإضافة إلى antimycin A كذلك لم يكن له تأثير واضح على OCR، والتي ظلت ثابتة طوال ما تبقى من الفحص. توضح هذه البيانات أنه ينبغي النظر في كل من تركيز المركبات والمسار الزمني للتعرض لمركبات المغير التنفسي لتحسين المقايسة عند استخدام كرويات 3D.

Figure 4
الشكل 4: معايرة مركبات المغير التنفسي كخطوة مهمة لتحسين تحليل التدفق خارج الخلية. (أ) تم زرع الكرويات MCF-7 في 4 × 10 3 خلايا / بئر وزرعت على مدى3 أيام قبل وضعها في آبار صفيحة دقيقة كروية تحتوي على XF RPMI وتم فحصها بحثا عن معدلات التعرف الضوئي على الحروف ± الميتوكوندريا باستخدام محلل XFe96. تم قياس OCR 5x ، وبعد ذلك تمت إضافة معايرة إما التحكم في السيارة ، oligomycin (B) ، BAM15 (C) ، أو rotenone-antimycin A (D) لتثبيط سينثاز ATP الميتوكوندريا ، وتحديد القدرة التنفسية القصوى ، أو تحديد معدل التنفس غير الميتوكوندريا ، على التوالي. تمت زيادة تركيز كل معدل ميتوكوندريا على 4 استراتيجيات حقن معايرة فردية (0.5 ميكرومتر و 1.5 ميكرومتر و 3 ميكرومتر و 6 ميكرومتر ؛ وحدات أوليغوميسين هي ميكروغرام / مل) لتحديد الحد الأقصى من التعرف الضوئي على الحروف في الحالة الثابتة استجابة للتركيز المركب الأمثل. تم قياس OCR لمدة 5 دورات قياس بين كل حقنة. البيانات هي متوسطات ± SEM من 5-8 نسخ متماثلة فردية للبئر. اختصار: OCR = معدل استهلاك الأكسجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية لتقنية XF في القدرة على فحص وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا والأنسجة السليمة. لفحص جوانب محددة من وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا والأنسجة، تضاف معدلات الميتوكوندريا بالتتابع إلى آبار العينة الدقيقة من خلال 4 منافذ حقن متاحة على خرطوشة المستشعر. التسلسل النموذجي للمعدلات المستخدمة لفحص معلمات الميتوكوندريا في اختبارات XF هي oligomycin، وهو بروتونوفور (على سبيل المثال، FCCP أو BAM15)، ومزيج من الروتينون بالإضافة إلى Antimycin A، والتي تضاف بالتتابع لتثبيط سينثاز ATP الميتوكوندريا، وتحديد القدرة التنفسية القصوى، وتصحيح معدل التنفس غير الميتوكوندريا، على التوالي. يطلق على هذا التسلسل النموذجي لإضافات المغير اختبار MitoStress من قبل الشركة المصنعة لتقنية المقايسة. بالنظر إلى أن oligomycin يمكن أن يمنع التنفس غير المحفز في بعض الخلايا أحادية الطبقات20 ، فقد فحصنا هذا مع الكرويات ثلاثية الأبعاد المشتقة من السرطان عن طريق قياس OCR غير المقترن (OCRmax) قبل (مفرد) وبعد (تسلسلي) حقن oligomycin (الشكل 5A-D). لم يكنالحد الأقصى للالتعرف الضوئي على الحروف محدودا بشكل كبير بإضافة الأوليغوميسين في الكرويات التي تشكلت من HEPG2 / C3A أو SK-OV-3 (الشكل 5E والشكل 5G). ومع ذلك ، تم تخفيضالحد الأقصى للتمييز الضوئي على الحروف بشكل كبير في الكرويات A549 و MCF-7 بعد الحقن المتسلسل ل BAM15 بعد oligomycin مقارنةبالحد الأقصى للتمييز الضوئي على الحروف المحقق من حقنة واحدة من BAM15 (الشكل 5F والشكل 5H). ما لم يكن معروفا خلاف ذلك ، فمن المستحسن استخدام آبار منفصلة لعلاج oligomycin و uncoupler ، مع إضافة نهائية من rotenone و antimycin A عند استكشاف استقلاب طاقة الميتوكوندريا من الكرويات 3D. لا يزال هذا النهج يسمح بحساب جميع معلمات الميتوكوندريا كما هو الحال مع اختبار MitoStress النموذجي حيث تتم إضافة المركبات بالتتابع.

Figure 5
الشكل 5: الحقن الفردي أو المتسلسل لمركبات الجهاز التنفسي الميتوكوندريا. تم وضع الكرويات المشتقة من الخلايا السرطانية من MCF-7 و HEPG2 / C3A و SK-ov-3 و A549 في آبار صفيحة كروية XFe96 في XF RPMI وتم فحصها بحثا عن التعرف الضوئي على الحروف باستخدام محلل Agilent Seahorse XFe96. تم قياس OCR 5x ، وبعد ذلك 2 ميكروغرام / مل oligomycin (حقن المنفذ A: التتبع الأخضر) أو 5 μM BAM15 (حقن المنفذ A: التتبع الأزرق أو منفذ الحقن B: التتبع الأخضر) لتثبيط سينثاز ATP الميتوكوندريا وتحديد القدرة التنفسية القصوى ، على التوالي. يتم التعبير عن بيانات التعرف الضوئي على الحروف الحركية كنسبة مئوية قاعدية (A-D). تم حساب القدرة التنفسية القصوى (OCR max) كعامل من عوامل التعرف الضوئي على الحروف القاعدية بواسطة المعادلة: OCRmax = OCRBAM15 / OCRالقاعدي. تم الحصول علىOCR max من متوسطات OCR عبر دورات القياس 8-10 بعد حقن BAM15 مع (القضبان الخضراء) وبدون (القضبان الزرقاء) oligomycin. البيانات هي متوسطات ± SEM من 3-8 تكرارات فردية بشكل جيد عبر الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي. الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

باستخدام كثافات بذر الخلايا المثلى ، وتركيزات المركبات ، واستراتيجية الحقن ، وفترة دورة القياس المحددة في تجارب التحسين هذه (الجدول 3) ، قمنا بتطوير بروتوكول مفصل للتحقيق بدقة في تنفس الميتوكوندريا القاعدية: OCRالقاعدي (الشكل 6A) ، تنفس الفسفرة ADP: OCRADP (الشكل 6B) ، تنفس التسرب: OCRomy (الشكل 6C) ، كفاءة الاقتران (الشكل 6D) ، والقدرة التنفسية القصوى: OCRmax (الشكل 6E)، والقدرة التنفسية الاحتياطية:OCR spare (الشكل 6F) باستخدام كرويات ثلاثية الأبعاد مشتقة من السرطان.

Figure 6
الشكل 6: فحص التعرف الضوئي على الحروف باستخدام تقنية XF لإنشاء استقلاب طاقة الميتوكوندريا للكرويات المشتقة من السرطان. تم وضع الكرويات المشتقة من الخلايا السرطانية من MCF-7 و HEPG2 / C3A و SK-OV-3 و A549 في آبار صفيحة دقيقة كروية في XF RPMI وتم فحصها بحثا عن التعرف الضوئي على الحروف باستخدام محلل Agilent Seahorse XFe96. تم قياس OCR 5x ، وبعد ذلك 2 ميكروغرام / مل oligomycin ، أو 5 μM BAM15 ، وتمت إضافة RA لتثبيط سينثاز ATP الميتوكوندريا ، وتحديد القدرة التنفسية القصوى ، وحساب معدل التنفس غير الميتوكوندريا ، على التوالي. (أ) تم حساب تنفس الميتوكوندريا القاعدية (OCRالقاعدية) كمتوسط التعرف الضوئي على الحروف من دورات القياس 3 قبل حقن المنفذ A. (ب) تم تقريب كفاءة اقتران الفسفرة التأكسدية عن طريق التعبير عن OCRADP (تسرب OCR القاعدي - OCR) كنسبة مئوية من OCRالقاعدي. (ج) تم قياس التنفس الفسفري ADP (OCRADP) على أنه OCR حساس للقلة ، محسوبا من متوسط OCR عبر دورات القياس 11-13 قبل حقن BAM15. (د) تم قياس التنفس العيني للتسرب (تسرب OCR) على أنه OCR غير حساس للأوليغوميسين ، محسوبا من متوسطOCR المتوسط عبر دورات القياس 11-13. (هاء) تم قياس القدرة التنفسية القصوى (OCRmax) كمتوسط الحد الأقصى للالتعرف الضوئي على الحروف الذي تم قياسه بعد حقن BAM15. (و) تم حساب القدرة التنفسية الاحتياطية عن طريق التعبير عن OCR الاحتياطي (OCRmax - OCRbasal) كنسبة مئوية من OCRالقاعدي. تم طرح OCR بعد حقن الروتينون-أنتيمايسين A (OCRr r / a) من جميع المعدلات لتصحيح OCR غير الميتوكوندريا. البيانات هي متوسطات ± SEM من 3-8 نسخ متماثلة فردية عبر اللوحة الكروية XFe96. الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين; RA = 2 μM rotenone-2 μM antimycin A. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم استخدام الكرويات MCF-7 المزروعة من 4 × 103 خلايا / أكثر من 3 أيام كنموذج لتحديد النقل الأمثل والوضع والتحليل داخل الصفائح الدقيقة للفحص الكروي. باستخدام الأبعاد المقدمة للصفيحة الكروية الدقيقة من الشركة المصنعة ، تم تقسيم سطح البئر إلى ثلاث مناطق منطقة لوضع كروي مثالي (الشكل 7A) ، حيث تم تسليط الضوء على المنطقة 1 باعتبارها المنطقة المثلى في وسط البئر. مع السحب الدقيق باستخدام أطراف ماصة واسعة الفتحة ، تم نقل الكرويات إلى الألواح الكروية وتوزيعها عشوائيا عبر أسطح الآبار عن طريق إزالة الجاذبية (الشكل 7B). وحيثما تم نقل الكرويات بعناية باستخدام إزالة الجاذبية، يمكن عادة العثور على معظم الكرويات في المناطق 1-2 من الصفيحة الدقيقة، باستخدام تقنيات النقل الموصى بها من الشركة المصنعة. وحيثما أجبرت الكرويات على الخروج من طرف الماصة عن طريق الشفط، غالبا ما كانت الكرويات توضع خارج هذه المناطق ولا يمكن رؤيتها باستخدام الفحص المجهري.

ولمقارنة مواضع وضع الكروية، نقلت الكرويات MCF-7 إلى الصفائح الدقيقة للفحص الكروي في المناطق المعينة 1-3 أو خارج المنطقة (الشكل 7 ألف). تم تتبع هذه الآبار الأربعة من خلال تجربة حركية OCR عند خط الأساس وبعد إضافة oligomycin، BAM15، أو rotenone-antimycin A (الشكل 7C). تم حساب OCR من متوسط ثلاث قراءات دورة قبل كل حقنة (الشكل 7B). تم قياس التعرف الضوئي على الحروف بشكل حركي على مدى 200 دقيقة في 4 آبار مختارة (الشكل 7C) وتم تصحيح خط الأساس (الشكل 7D). وحيثما وضعت الكرويات في المنطقة 3 أو خارج المنطقة، كانت عمليات التعرف الضوئي على الحروف الأساسية أقل بكثير من الكرويات الموضوعة في المنطقتين 1 و2 (الشكل 7 جيم). كما اختلفت آثار المركبات التنفسية oligomycin، BAM15، و rotenone-antimycin A اختلافا كبيرا بين الكرويات الموضوعة في المناطق 1 و 2 مقارنة بالمنطقة 3 والمناطق خارج المنطقة. ولوحظت زيادة في التعرف الضوئي على الحروف مع الأوليغوميسين في الكرويات الموضوعة في المنطقة 3 أو خارج المنطقة (الشكل 7E). وعلاوة على ذلك، شهدت الكرويات الموضوعة في المنطقة 3 أو خارج المنطقة استجابة عالية بشكل مفرط ل BAM15 مع التعرف الضوئي على الحروف أعلى من خط الأساس بعد حقن الروتينون - أنتيميسين A (الشكل 7E). على الرغم من الزيادة بمقدار الضعف تقريبا في التعرف الضوئي على الحروف القاعدي (الشكل 7C) مع وضع الكرويات في المنطقة 2 مقابل المنطقة 1 ، كانت التغيرات الطية استجابة لجميع المركبات التنفسية متشابهة جدا (الشكل 7E) ، مما يشير إلى أن الاختلافات في التعرف الضوئي على الحروف القاعدية بين الكرويات الموضوعة في المناطق 1 أو 2 من غير المرجح أن تكون نتيجة لوضعها داخل البئر.

Figure 7
الشكل 7: وضع الكرويات داخل الصفائح الدقيقة للفحص الكروي يملي تأثيرات OCR القاعدية والميتوكوندريا المعدلة باستخدام تقنية XF. تم زرع الكرويات MCF-7 في 4 × 10 3 خلايا / بئر واستزراعها على مدى3 أيام قبل وضعها في آبار الصفيحة الدقيقة الكروية التي تحتوي على XF RPMI وفحصها بحثا عن معدلات التعرف الضوئي على الحروف ± الميتوكوندريا باستخدام محلل Agilent Seahorse XFe96. (أ) صور مجهرية لمواقع المنطقة الكروية في الصفائح الدقيقة للمقايسة الكروية بعد مدة الفحص؛ شريط المقياس = 500 ميكرومتر والتعرف الضوئي على الحروف الملتقطة من الآبار المقابلة بمرور الوقت معبرا عنه إما ب pmol / min-1 / well-1 (B) أو ٪ قاعدي (C). (د) آثار معدل الميتوكوندريا للكرويات MCF-7 الموضوعة في مناطق مختلفة داخل الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي؛ البيانات المعبر عنها كتغيير أضعاف من القاعدية. (ه) مثال على التتبع الحركي الذي يبرز قياسات بيانات التعرف الضوئي على الحروف (الدوائر الحمراء) المستخدمة لحساب استجابة كل معدل ميتوكوندريا للبيانات المقدمة في هاء. البيانات المعروضة هي من استجابات الآبار الفردية. اختصار: OCR = معدل استهلاك الأكسجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وتتسم معايير اختيار الخلفية بأهمية عالية؛ إن استخدام الآبار الخارجية لتصحيح الخلفية لا يمثل جميع الآبار ذات الصفائح الدقيقة ، مما قد يؤدي إلى افتراضات بيانات غير صحيحة يتم استخلاصها واستنتاجات بيانات خاطئة بسبب تأثيرات الحافة عبر الصفيحة الدقيقة الكروية. لتقييم هذه الملاحظة ، تم استخدام الكرويات MCF-7 لمقارنة إجراءات تصحيح الفحص لاشتقاق قيم OCR استجابة لإضافة عنصر تحكم في السيارة ، oligomycin، BAM15 ، أو rotenone-antimycin A (الشكل 8). وأسفرت جميع المركبات التنفسية عن الملامح الحركية المتوقعة للتعرف الضوئي على الحروف للمركبات المختارة، مما كشف عن متوسط معدل ثابت للتنفس القاعدي يتراوح بين 20 و 30 بمول/دقيقة/بئر (الشكل 8 ألف). ومع ذلك ، حيث تم تحليل بيانات الفحص باستخدام الآبار الخارجية لتصحيح درجة حرارة الخلفية (A1 و A12 و H1 و H12) ، كانت القيم التي تم الكشف عنها للتعرف الضوئي على الحروف بعد إضافة مركبات الجهاز التنفسي منخفضة بشكل خاص ؛ أسفر OCR عن قيم سالبة للروتينون-أنتيميسين A. واستجابة لهذه الملاحظات، أجري تحليل بديل باستخدام سلسلة من الآبار الفارغة، موزعة عشوائيا عبر الصفيحة الكروية المتناهية الصغر، كآبار لتصحيح درجة حرارة الخلفية (الشكل 8 ب). وحيثما طبق تصحيح بديل للخلفية، كانت جميع الآثار المركبة النسبية على التعرف الضوئي على الحروف هي نفسها في مجموعتي التحليل؛ ومع ذلك ، زادت قيم OCR المطلقة بحوالي 10 pmol / min / well (الشكل 8). تسلط هذه البيانات الضوء على قوة وأهمية تصحيح درجة حرارة الخلفية على الصفائح الدقيقة للفحص الكروي وتؤكد على أهمية تحسين المستخدم لتحليل XF.

Figure 8
الشكل 8: اختيار عشوائي للآبار لتصحيح الخلفية لتحسين التحكم في تدرجات الحرارة عبر الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي. بيانات التعرف الضوئي على الحروف المستنبطة من الشكل 2A باستخدام الآبار الموصى بها لتصحيح الخلفية (A) مقابل الآبار المخصصة عشوائيا لتصحيح الخلفية (B). اختصار: OCR = معدل استهلاك الأكسجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

على عكس الطبقات الأحادية للخلايا ، تمثل الكرويات تجميعا غير متجانس للخلايا في مساحة 3D ، وبالتالي تتطلب دراسة شاملة فيما يتعلق بالتحليل ، خاصة عند تطبيع هذه البيانات. تقدم هذه الورقة ثلاثة مناهج لتطبيع بيانات XF التي تم الحصول عليها من الكرويات MCF-7 (الشكل 9). عند عدم التطبيع ، يرتبط OCR بشكل إيجابي (R2 = 0.98) مع حجم كروي (تحدده كثافة بذر الخلايا الأولية) بشكل كبير عند مقارنته إحصائيا بمعامل ارتباط بيرسون ، P = 0.0057 (الشكل 9A). يتم تخفيض هذه العلاقة الخطية عندما يتم تطبيع OCR إلى كثافة بذر الخلايا الأولية (R2 = 0.78) ولم تعد ترتبط بشكل كبير بحجم كروي (P = 0.117 ، الشكل 9B). هذا هو الحال أيضا عند التطبيع إلى حجم كروي (R2 = 0.77; معامل ارتباط بيرسون P = 0.120 ، الشكل 9C) ومحتوى dsDNA النووي (R2 = 0.58 ؛ معامل ارتباط بيرسون P = 0.233، الشكل 9D). تسلط هذه البيانات الضوء على أهمية تطبيع بيانات XF عند فحص استقلاب الميتوكوندريا للكرويات، خاصة إذا كانت ذات أحجام مختلفة.

Figure 9
الشكل 9: تطبيع بيانات التدفق خارج الخلية التي تم الحصول عليها من الكرويات الخلوية. (أ) تم الحصول على بيانات التعرف الضوئي على الحروف الخام من MCF-7 المستزرعة على مدى 3 أيام ورسمت باستخدام نموذج بيرسون للحصول على معامل ارتباط بين كثافة البذر الكروية والتعرف الضوئي على الحروف؛ (ب) تم الحصول على بيانات التعرف الضوئي على الحروف الخام من MCF-7 المستزرعة على مدى 3 أيام ورسمت باستخدام نموذج بيرسون للحصول على معامل ارتباط بين كثافة البذر الكروي والتعرف الضوئي على الحروف؛ (ب) تم الحصول على بيانات التعرف الضوئي على الحروف الخام من MCF-7 المستزرعة على مدى 3 أيام ورسمت باستخدام نموذج بيرسون للحصول على معامل ارتباط بين كثافة البذر الكروي والتعرف الضوئي على الحروف؛ (ب) تم الحصول على بيانات التعرف الضوئي على الحروف الخام من MCF-7 المستزرعة على مدى 3 أيام وتم رسمها باستخدام نموذج بير تم تعيين قيمة P عند 0.05. (ب) تم تطبيع بيانات التعرف الضوئي على الحروف الخام مقابل كثافة البذر الكروية الأولية؛ (ج) الحجم الكروي MCF-7 الذي تم الحصول عليه من القياس المجهري؛ و (D) محتوى الحمض النووي ds النووي مقارنة باستخدام معامل ارتباط بيرسون. الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين; ds DNA = الحمض النووي المزدوج العالق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خط الخلية كثافة البذر (بئر) النمو الكروي (أيام) الحجم الكروي النهائي (μM3) التعرف الضوئي على الحروف القاعدية (pmolO2 / دقيقة / بئر) تلبية حساسية التعرف الضوئي على الحروف القاعدية (نعم / لا)
سكوف 1000 5 9.52E+06 28 ± 3.5 نعم
سكوف 2000 5 2.38E+07 26 ± 1.4 نعم
سكوف 4000 5 4.92E+07 36 ± 3.1 نعم
سكوف 8000 5 1.11E+08 50 ± 7.9 نعم
HepG2 1000 5 1.11E+07 15 ± 0.7 لا
HepG2 2000 5 2.88E+07 23 ± 1.8 نعم
HepG2 4000 5 5.46E+07 31 ± 1.7 نعم
HepG2 8000 5 1.21E+08 52 ± 2.8 نعم
إيه 549 1000 5 2.11E+07 30 ± 2.5 نعم
إيه 549 2000 5 3.57E+07 41 ± 1.6 نعم
إيه 549 4000 5 6.93E+07 53 ± 7.2 نعم
إيه 549 8000 5 1.44E+08 65 ± 8.4 نعم
MCF-7 1000 3 1.60E+07 29 ± 0.8 نعم
MCF-7 2000 3 2.52E+07 37 ± 1.7 نعم
MCF-7 4000 3 6.00E+07 46 ± 1.7 نعم
MCF-7 8000 3 1.06E+08 66 ± 2.9 نعم

الجدول 4: المعلمات المحسنة لتحديد قياسات OCR القاعدية في كرويات 3D واحدة. اختصار: OCR = معدل استهلاك الأكسجين.

الملف التكميلي 1: تحليل حجم الكروية وحجمها. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: القياس الكمي للحمض النووي المزدوج من الكرويات في الصفيحة الكروية الدقيقة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: توصيات بشأن عدد النسخ المتماثلة المطلوبة للحصول على مجموعات بيانات موثوقة لفحص XF. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ثالثا - النتائج والنواتج الرئيسية
توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للتحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا للكرويات المفردة 3D باستخدام سلسلة من خطوط الخلايا المشتقة من السرطان مع محلل XFe96 XF. تم تطوير ووصف طريقة للزراعة السريعة للكرويات الخلوية A549 و HepG2 / C3A و MCF7 و SK-OV-3 باستخدام تقنيات طاردة للخلايا للتجميع القسري. يعالج هذا البروتوكول العديد من الاعتبارات المتعلقة بفحص التمثيل الغذائي الكروي باستخدام تقنية XF ، بما في ذلك (1) تحسين بروتوكولات الاستزراع الكروي والتعامل مع الكرويات ونقلها إلى صفائح دقيقة كروية محددة من الشركة المصنعة للتكنولوجيا من أوعية الاستزراع الأصلية الخاصة بها ؛ (2) تركيز المركبات التنفسية التي سيتم استخدامها والاعتماد على الوقت لاختراق المركبات ؛ (3) استراتيجيات الحقن التي سيتم استخدامها؛ و (4) طرق لتطبيع البيانات بين المجموعات التجريبية. وقد درست جميع هذه الاعتبارات في هذه الورقة وتناقش بمزيد من التفصيل أدناه. يتم تقديم هذه الطرق كطرق مبسطة لتوليد بيانات تدفق الأكسجين الأيضية المتسقة باستخدام كرويات 3D واحدة مع محلل تدفق XFe96. يمكن استخدام هذا النهج التجريبي كنقطة انطلاق وعنوان للاستخدام في النماذج الكروية الأخرى التي يمكن تنفيذها بسهولة في بيئة مختبرية أساسية.

الاعتبارات
النمو الكروي لتقنية XF وحجمها وحساسيتها
لإنشاء بيانات قابلة للتكرار باستخدام تقنية XF، من الضروري توصيف الفحص وتحسينه للطراز المحدد. هذا النهج بسيط نسبيا في طبقة أحادية أساسية من الخلايا. ومع ذلك ، فإن هذا يمثل تحديات إضافية عند زراعة الخلايا كرويات 3D. خلال التجارب المعروضة هنا ، تم استكمال وسيط RPMI من الشركة المصنعة عند الاستخدام. في حين يلاحظ أن بعض خطوط الخلايا ، وهي HepG2 / C3A ، تم استزراعها في وسط نمو DMEM ، خلال هذه الفحوصات القصيرة نسبيا (~ 3-5 h) ، كان للاستبدال بتركيبات RPMI-DMEM تأثير محدود على تحليل XF. صياغة الوسائطين متشابهة جدا ، ويمكن للمستخدمين "ضبط" وسائط Seahorse RPMI لتتناسب مع مصفوفة وسائط زراعة الخلايا الخاصة بهم من خلال المكملات الغذائية ، على سبيل المثال ، زيادة الجلوكوز ، وإضافة المزيد من مصادر الكربوهيدرات. من الأهمية بمكان للصياغة النهائية لجميع المخازن المؤقتة والوسائط XF غياب الفينول الأحمر ، والذي من المحتمل أن يتداخل مع مجسات الفلورسنت داخل لوحة خرطوشة مسبار XF ، وبيكربونات الصوديوم ، مما سيؤدي إلى القلوية بسبب عدم وجود التخزين المؤقت لثاني أكسيد الكربون2 الموجود في حاضنات زراعة الخلايا. يمكن شراء الوسائط والمخازن المؤقتة الأخرى و / أو صنعها داخليا. على سبيل المثال ، Krebs Ringer HEPES buffer هو مخزن مؤقت بسيط يمكن استخدامه لتقييم التنفس في العديد من الخلايا المختلفة ، بما في ذلك النماذج الكروية. ومع ذلك، يجب على مستخدمي مقايسات XF ملاحظة أن التغيير في الوسيط/المخزن المؤقت وتكملاته قد يغير قدرته الإجمالية على التخزين المؤقت. ويثير هذا الأمر قلقا خاصا عندما يكون المستخدمون مهتمين بقياس ECAR ، حيث يجب تقييم عامل المخزن المؤقت للوسط للسماح بتحويل ECAR إلى معدل تدفق البروتون (PER).

نظرا لأن التعرف الضوئي على الحروف الخلوي الذي تم قياسه بواسطة تقنية XF يتناسب مع كثافة الخلايا عندما يكون رقم الخلية في البئر ضمن حساسية النظام ، فقد كان من المهم التحقيق في هذه العلاقة باستخدام كرويات 3D واحدة. من خلال فحص التعرف الضوئي على الحروف من كرويات ثلاثية الأبعاد واحدة مستزرعة من 4 خطوط مختلفة من الخلايا السرطانية المزروعة بكثافات 1000 أو 2000 أو 4000 أو 8000 خلية لكل بئر ، نظهر أن محلل XFe96 حساس بما يكفي لالتقاط التغيرات في معدل التنفس الميتوكوندريا بين الكرويات ثلاثية الأبعاد المزروعة من كثافات بذر الخلايا المختلفة (الشكل 3). نظهر أن النطاق الأمثل لكثافة بذر الخلايا ، وبالتالي الحجم الكروي لتشكيل كرويات 3D للتحقيق في التعرف الضوئي على الحروف ، يختلف اعتمادا على نوع الخلية. ويظهر ذلك من خلال العلاقة الخطية بين التعرف الضوئي على الحروف وكثافة البذر أو الحجم الكروي (الشكل 3). بالنسبة لخلايا A549 و HepG2 / C3A ، كانت كثافة البذر المثلى لحساسية التعرف الضوئي على الحروف تتراوح بين 1000 و 8000 خلية / بئر ؛ كان 2000-8000 خلية / بئر ل MCF-7 و 4000-8000 خلية / بئر لخلايا SK-OV-3. توضح هذه البيانات أن تحسين حجم الكروية له أهمية خاصة عند تقييم التعرف الضوئي على الحروف باستخدام تقنية XF.

اعتبارات حول الحد الأدنى والحد الأقصى من الأحجام الكروية والتعرف الضوئي على الحروف القاعدي
بشكل عام ، سيكون هناك دائما عتبات دنيا وقصوى لمعلمات التعرف الضوئي على الحروف القابلة للقياس الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لهذه التجارب. بالنسبة لمحلل XFe96 ، فإن التعرف الضوئي على الحروف القاعدي بين 20 pmol O 2 / min / well و 200 pmol O2 / min / well هما الحدان الأدنى والأعلى ، على التوالي. هذا هو الحال مع الخلايا أحادية الطبقة والكروية ، وحيث يقع النموذج التجريبي ضمن نطاق OCR الديناميكي هذا سيعتمد على كمية المواد البيولوجية المتاحة ، على سبيل المثال ، عدد الخلايا كطبقة واحدة أو حجم الكرويات. انظر الجدول 4 للحصول على مثال على كيفية تحقيق عتبات التعرف الضوئي على الحروف بواسطة النماذج الكروية المستخدمة هنا. قد يكون من الحكمة التحقق من مستوى الأكسجين داخل البئر الذي تتوفر له هذه البيانات أيضا من هذه القياسات كبيانات المستوى. يجب النظر إلى هذا بشكل روتيني من كل تجربة لأغراض مراقبة الجودة. إذا كان هناك استنفاد للأكسجين في البئر ، توضيح ذلك في البيانات. وإذا كان الأمر كذلك، فقد يكون من الضروري تعديل دورات القياس داخل التجربة؛ على سبيل المثال ، زيادة خطوة الخلط بحيث يتم استرداد مستوى الأكسجين في البئر قبل فترة القياس التالية خلال دورة القياس. على الرغم من أنه ممكن ، فقد وجدنا أن هذا غير مرجح للغاية بالنسبة للتجارب الكروية المفردة باستخدام خطوط الخلايا الموصوفة.

اختيار مقرنات الميتوكوندريا لمقايسات التدفق خارج الخلية
الأيونات البروتونية ، مثل سيانيد الكربونيل 4-(ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) 21 ، سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) 22 أو BAM15 23 ، هي مواد كيميائية جزيئية صغيرة قوية قادرة على تعطيل تدرج البروتون الكهروكيميائي عبر أغشية الميتوكوندريا ، وتثبيط إنتاج ATP ، وفي النهاية فصل تنفس الميتوكوندريا 24 . يستمر تطوير جزيئات صغيرة جديدة لهذه الأغراض ، لا سيما في علاج أمراض التمثيل الغذائي 25،26،27 ؛ الرجوع إلى اثنين من الاستعراضات الممتازة28,29. وعلى العكس من ذلك، تم ربط فك ارتباط التنفس التأكسدي بسمية غير مرغوب فيها خارج الهدف30. ومع ذلك ، داخل الفحوصات الخلوية في المختبر ، يقوم الجزيء FCCP بإزالة الاستقطاب عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا ويمارس تأثيرات خارج الهدف مثل إزالة الاستقطاب من غشاء البلازما ، مما يعطل تدفق أيون NA + 31 ؛ التدخل في معالجة البروتين الخلوي32 ، وحتى تحفيز الشيخوخة الخلوية33. تم تقديم BAM15 في الأصل في عام 2013 كمقرن ميتوكوندريا مع تأثير ضئيل على أغشية البلازما 23 ، مع نشاط بروتونوفوري في نطاق الميكرومولار في الخلايا الكاملة ونطاق نانومولار في الميتوكوندريا المعزولة23,34.

بالنظر إلى فعالية FCCP على إزالة الاستقطاب من غشاء البلازما ، فإن BAM15 هو بروتونوفور أكثر موثوقية لفك الارتباط بالتنفس في الخلايا الكاملة السليمة في اختبارات التدفق خارج الخلية. على الرغم من أن FCCP ونظيره ، CCCP ، قد استخدما لأكثر من 50 عاما لفحص القدرات التنفسية القصوى ولا يزالان يستخدمان على نطاق واسع في دراسات XF ، فإن استخدام هذه الجزيئات الصغيرة غالبا ما يقلل من قدرة الميتوكوندريا والتمثيل الغذائي الخلوي. ويرتبط هذا جزئيا بالسبب في وقوع العديد من المنشورات التي تستخدم تقنية XF في فخ الإبلاغ عن قدرات تنفسية احتياطية سلبية أو التقليل من شأن القدرات التنفسية الحقيقية للميتوكوندريا عند استخدام FCCP. غالبا ما تؤدي الفعالية الإضافية ل FCCP في الخلايا والأنسجة السليمة إلى ضعف وظيفة الميتوكوندريا ، ويمكن أن تكافح الخلايا للعمل بشكل مناسب للحفاظ على أقصى قدرة تنفسية عبر دورات قياس متعددة بعد إضافتها ، حتى عند تركيزات منخفضة جدا35. لذلك ، يمكن العثور على استجابة الخلايا ل FCCP في العديد من الدراسات للانخفاض بعد فترة دورة القياس الأولية. في حين تم استخدام FCCP بشكل روتيني لتحليل XF ، يتم استخدام BAM15 بشكل تفضيلي في الحالات التي تنطوي على خلايا كاملة أو نماذج كروية ، نظرا لأنه يمكن أن يحافظ على قدرة تنفسية قصوى في الميتوكوندريا غير المستقطبة بالكامل بتركيزات تصل إلى 10 ميكرومتر 3. علاوة على ذلك ، يحفز BAM15 تأثيرات على التحمض خارج الخلية ، والذي يتزامن مع أكسدة المغذيات من خلال ترطيب CO2 لتشكيل HCO 3- و H + إلى حد أكبر من FCCP3. ومع ذلك ، في حالة الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المتخلل ، يجب أن يؤدي أي من هذه غير المقترنات مثل BAM15 لفك ارتباط الميتوكوندريا إذا تمت معايرته بالتركيز الصحيح.

حركية اختراق المركبات وفحص الدراجات
التركيزات والاختراق والملامح الحركية للمركبات الكيميائية المستخدمة لإجراء اختبار MitoStress نموذجي مع كرويات 3D باستخدام محلل XF هي أكثر تعقيدا لمعالجتها. بالنظر إلى أن الكرويات موجودة بنية 3D ، فإن تغلغل الجزيئات عبر قطر الكروي هو عملية أكثر تعقيدا بشكل لا نهائي من عبر الطبقات الأحادية للخلية. على سبيل المثال ، تم تحديد الاختراق الحركي ، وبالتالي الحساسية للعلاج الكيميائي sorafenib حسب العمر الكروي ، وبالتالي الحجم في نموذج HepG2 الكروي36. تعتمد قدرة المواد الكيميائية ذات الجزيئات الصغيرة (مثل الأدوية والجسيمات النانوية) على الوصول إلى هدف بيولوجي على العديد من العوامل الأساسية ، بما في ذلك تعقيد النظام ليتم اختراقه ونشره ديناميكيا من خلال37,38. هذا ينطبق بشكل خاص على الأدوية التي تستهدف أنسجة الورم39. على غرار استهداف الورم في سياق كروي 3D ، يمكن أن يحكم الحجم والاكتناز والاستجابات الظاهرية الأخرى مثل التعبير عن البروتينات الناقلة للأدوية وقت الاختراق وتركيز المركب المطلوب لإثارة استجابة بيولوجية.

في هذا البروتوكول ، عالجنا المشكلة المتعلقة بوقت الاختراق وتركيز الجزيئات الصغيرة استجابة لمثبط سينثاز ATP oligomycin، و protonophore و mitochondrial uncoupler BAM15 ، والجمع بين مثبطات Complex I و Complex III rotenone و antimycin A. من خلال فحص التعرف الضوئي على الحروف للكرويات المفردة MCF-7 المعرضة لمعايرة متعددة لهذه المركبات التنفسية الشائعة ، نثبت أن التركيز الأمثل لكل مركب مطلوب للحث على معدل تنفسي ثابت يقع ضمن نطاق مماثل لنطاق الخلايا أحادية الطبقة (الشكل 4). الأهم من ذلك ، وتختلف عن نظرائهم أحاديي الطبقة ، تبين أن زيادة عدد دورات القياس بين الحقن هو المفتاح لتحقيق OCR ثابت الحالة في كرويات 3D واحدة. تسلط هذه البيانات الضوء على أهمية اختراق المركبات وخصائصها الحركية عند استكشاف معلمات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا للكرويات 3D باستخدام هذه الأساليب. باستخدام خصائص التحسين الكروي ، وتركيزات المركبات ، وأوقات دورة القياس المستنيرة بالبيانات المقدمة في الشكل 3 والشكل 4 والشكل 5 ، تم إنشاء اختبار MitoStress تم التحقق منه للتحقق من صحة معلمات محددة من التمثيل الغذائي التأكسدي للميتوكوندريا في مجموعة من الكرويات ثلاثية الأبعاد المشتقة من السرطان (الشكل 6). من الأهمية بمكان ، ومثل بعض خطوط الخلايا السرطانية أحادية الطبقة40 ، تم تثبيط القدرة التنفسية القصوى (معدل التنفس غير المقترن) لبعض الكرويات ثلاثية الأبعاد المشتقة من السرطان بواسطة oligomycin (الشكل 5). على وجه التحديد ، أظهرت الكرويات ثلاثية الأبعاد المزروعة من خلايا A549 أو MCF-7 معدلا أقصى للتنفس أقل بكثير عند عدم إقرانها ب BAM15 بعد حقن oligomycin مقارنة بكونها غير مقترنة ب BAM15 بدون oligomycin (الشكل 5F والشكل 5H). بالنظر إلى أن هذا التأثير قد يكون موجودا داخل الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد الأخرى ، فإننا نقترح أنه ما لم يتم استخدام بروتوكول تم التحقق منه مسبقا ، يجب تقدير القدرة التنفسية القصوى في الكرويات ثلاثية الأبعاد بدون oligomycin.

الجمع المتزامن لبيانات ECAR كمقياس للتدفق المحلل للسكر في الكرويات الخلوية
كما هو موضح عادة في الأدبيات أو المعلومات من الشركة المصنعة للتكنولوجيا ، فإن معدل تحلل السكر في الكرويات ، الذي يقاس باسم ECAR ، هو معلمة ثانوية يمكن التقاطها إلى جانب OCR. حساب ECAR وحده ليس معلمة مفيدة أو ذات مغزى في أي تجربة XF لأنه لا يتم تصحيحه لسعة التخزين المؤقت للمخزن المؤقت لفحص XF أو إضافة تحمض الميتوكوندريا ، والذي ينشأ من ترطيب CO2 إلى HCO3- و H +. ECAR هو فقط ثاقب بمجرد تطبيق تصحيحات البيانات هذه ، وبعد ذلك يصبح من الممكن تقديم استنتاجات أكثر دقة حول تدفق تحلل السكر. لتصحيح قدرة التخزين المؤقت لتوليد بيانات PER أكثر أهمية ، يجب على المرء أن يعرف حجم الغرفة الدقيقة للصفيحة الدقيقة الكروية. لم تتمكن الشركة المصنعة من توفير وحدة تخزين حقيقية لهذا مع اللوحة الدقيقة الكروية ، وبالتالي ، لا يمكن تحديد بيانات PER بسهولة. في الواقع، على الرغم من أن هذه القياسات يمكن تحقيقها تجريبيا، إلا أن هذا كان خارج نطاق هذه المخطوطة. ومع ذلك ، مع التصحيحات المناسبة ومعرفة حجم الغرفة الدقيقة لحجم كروي معين موجود (على سبيل المثال ، الحصول على مقياس للكثافة الكروية) في البئر ، ستصبح بيانات ECAR ذات مغزى ، ويمكن إجراء حسابات PER المحللة للسكر. وبالتالي ، يمكن أن تكون بيانات XF أكثر إفادة للتحقيق في التمثيل الغذائي المحلل للسكر والتأكسدي في الكرويات ، ولكن فقط إذا تم النظر في هذه المعلمات بعمق.

تشكيل كروي ، مناولة ، نقل ، وحركة
بعض خطوط الخلايا أكثر ملاءمة لتشكيل الكرويات من غيرها وقد لا تشكل كرويات على الإطلاق ، على سبيل المثال ، تشكل خلايا سرطان المبيض MCF-741,42 كرويات دائرية للغاية مقارنة بخطوط الخلايا الأخرى (الشكل 3). وكمثال آخر، تبين أن خلايا سرطان البنكرياس Capan-1 تشكل كرويات أفضل من Panc-1 أو BxPC343. وبالمثل ، من المعروف أن خطوط خلايا سرطان الكبد لديها قدرات متغيرة لتشكيل كرويات مدمجة 5,44 ، مع تغير ملحوظ في النمط الظاهري مثل تحسين استقلاب الدواء أو إنتاج الألبومين ، كما هو الحال بالنسبة ل HepG2 مقابل HepG2 / C3A9,45,46 أو HepaRG كرويات 17,47,48 . لذلك ، يجب على المستخدمين تحسين تقنيات زراعة الكروية وفقا لذلك وإجراء تجارب المعايرة بالتحليل الحجمي لتحديد كثافة البذر المثلى ومسار وقت الزراعة. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن صياغة وتكوين وسائط الفحص تؤثر على التركيبة الكروية ، بما في ذلك إضافة ميثيل السليلوز ، الذي غالبا ما يضاف إلى الوسائط لزيادة لزوجة المصفوفة43،49،50. وبالتالي ، يجب تحديد التركيب الأمثل لوسط الخلية تجريبيا لجميع خطوط الخلايا المستخدمة.

يتم تحديد عدد التبادلات المتوسطة في جميع أنحاء الثقافة الكروية من خلال خط الخلية المستخدم. ومع ذلك ، عادة ما تكون التبادلات المتوسطة نصف الحجم كل 2-3 أيام قابلة للتطبيق في معظم الحالات لتجديد العناصر الغذائية. استخدمنا نهج التجميع القسري لتوليد كرويات 3D باستخدام لوحات دقيقة طاردة للخلايا من المصادر المتاحة تجاريا للتطوير السريع ونشر النماذج الكروية في دراسات تحليلات XF. ومع ذلك ، قد تكون المنصات البديلة أكثر ملاءمة لتوليد كرويات من أنواع الخلايا الأخرى ، على سبيل المثال ، النهج المعلقة أو المضمنة في المصفوفة. في المختبرات المحدودة الموارد ، قد يرغب المستخدمون في النظر إلى تقنية تراكب سائل الأغاروز لتشكيل أسطح الصفائح الدقيقة الطاردة للخلايا51,52 لتقليل التكاليف الاقتصادية لخطوات تطوير الطريقة الكروية الأولية بشكل كبير. تعد حركة الكرويات بين أوعية الاستزراع ضرورية لإجراء تحليل XF وفحوصات أخرى في المصب. عادة ما تملي سهولة النقل الحجم الكروي والكثافة الكلية. نوصي باستخدام طرف ماصة P200 أو P1000 عريض الفتحة للحفاظ على سلامة الكروية. تخاطر أطراف الماصة ذات التجويف الأصغر حجما بالتعطيل الميكانيكي للكروية ، والتي يمكن شراؤها من مصادر تجارية أو ، بعناية ، يتم إجراؤها ببساطة عن طريق تقليم نهاية طرف الماصة لزيادة الفتحة. ومع ذلك ، قد يكون هذا النهج عرضة لإدخال الفراء إلى البلاستيك حول نهاية الطرف ، مما قد يسبب اضطرابا ميكانيكيا أثناء المناولة. يعد استخدام الإضاءة الخلفية أو صندوق الإضاءة مفيدا أيضا للتعامل مع الكروية ومراقبتها تحت مجهر التشريح كخطوة أساسية لضمان النقل الناجح للكرويات إلى الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي. علاوة على ذلك ، فإن الموقع الكروي داخل بئر الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي له أهمية خاصة ويؤثر بشكل مباشر على OCR والتأثير المركب خلال اختبار MitoStress النموذجي (الشكل 7) ، على الأرجح بسبب العلاقة بين الموقع الكروي وفلوروفورات مسبار الاستشعار.

تصحيح الخلفية والتحكم في درجة الحرارة الآبار
استخدام المقايسات القائمة على الصفائح الدقيقة هو نهج يستخدم على نطاق واسع في العديد من مجالات البحث. ومع ذلك ، فإن استخدامها يمثل العديد من التحديات العملية. وكما هو الحال في المناهج التجريبية الأخرى، وخاصة تلك التي تستخدم تنسيق الصفيف 96 (أو أكبر)، يمكن أن تؤثر هندسة الصفائح الدقيقة وتحديد المواقع على درجة الحرارة وتدرجات تبادل الغاز عبر الصفيحة بمرور الوقت، وغالبا ما يشار إليها باسم "تأثيرات الحافة"53,54. وجدنا أن الشيء نفسه ينطبق على الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي. بموجب إرشادات وبروتوكولات الشركة المصنعة ، يتم دائما تعيين آبار الزاوية الخارجية: A1 و A12 و H1 و H12 كآبار لتصحيح الخلفية والتحكم في درجة الحرارة لمحلل XFe96. على العكس من ذلك ، مع تنسيق الصفيف المكون من 24 بئرا ، يتم تعيين A1 و D6 كآبار تحكم ، إلى جانب بئرين آخرين منتشرين بالتساوي عبر منتصف اللوحة عند B4 و C3. عند إجراء تحليل كروي XF، وجدنا انحرافا كبيرا في البيانات التي تم جمعها في البداية باستخدام إرشادات الشركة المصنعة. وكان ذلك على الرغم من إدراج الخطوات اللازمة لضمان التوازن المسبق للفحص لدرجة الحرارة ومحتوى ثاني أكسيد الكربون2 قبل البدء في الحصول على البيانات، مما أدى في كثير من الأحيان إلى قيم سلبية للتعرف الضوئي على الحروف بعد حقن بعض مثبطات الجهاز التنفسي (الشكل 8).

وجدنا أن هذه الملاحظات من المحتمل أن تكون بسبب تأثيرات الحافة عبر الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي. في الشكل 8 ، وجدنا أن إعادة توزيع آبار التحكم في الخلفية عبر الصفائح الدقيقة ، تم تعديل بيانات XF حوالي 2 ضعف. هناك سببان أكثر ترجيحا هما (1) بسبب تأثيرات التبخر في الآبار الطرفية مما يؤدي إلى غرفة حجم إجمالية أصغر لمسبار XFe96 لأخذ عينات منه ، و (2) بسبب عدم كفاية توازن درجة الحرارة بين تلك الآبار المخصصة لتصحيح الخلفية وآبار العينات ، مما يؤدي إلى مجموعات بيانات إما تخفي OCR أو تضخمها بشكل مفرط. ولتجنب مثل هذه النتائج، يوصى بالتالي، خاصة في سياق التحليل الكروي، بأن يعيد المستخدمون توزيع الآبار المخصصة لتصحيح الخلفية عبر كامل صفيحة الفحص الكروية واتخاذ الخطوات اللازمة لتحقيق التوازن المسبق لفحصهم قبل الحصول على بيانات XF.

تطبيع البيانات
بالإضافة إلى توفير بروتوكول مفصل للتحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا للكرويات ثلاثية الأبعاد المفردة باستخدام تقنية XF ، تقدم هذه الورقة أيضا طرقا ممكنة لتطبيع بيانات معدل التنفس الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها باستخدام كرويات ثلاثية الأبعاد. باستخدام بيانات معدل التنفس التي تم الحصول عليها باستخدام كرويات MCF-7 المستزرعة بكثافات بذر الخلايا المختلفة (الشكل 3) ، نقدم معدلات تنفس الميتوكوندريا القاعدية من كرويات MCF-7 ذات الحجم والقطر المتزايدين عند تطبيعها إلى كثافة بذر الخلايا الأولية ، والحجم الكروي ، ومحتوى dsDNA (الشكل 9). تعد طريقة التطبيع المناسبة أمرا بالغ الأهمية للتفسير الدقيق لمجموعات بيانات XF ، خاصة عند مقارنة النماذج الكروية 3D في المختبر وأنواع الخلايا المختلفة. يمكن أن يؤدي التطبيع الضعيف إلى نتائج خاطئة لا يمكن مقارنتها ببساطة بين مجموعات البيانات. لا يفضل محتوى البروتين لتطبيع بيانات XF الكروية ، حيث قد تؤثر المعالجات المسبقة على معدلات تخليق البروتين دون تأثير كبير على معدل التنفس. علاوة على ذلك ، يمكن أن ترتبط كميات كبيرة وغير متناسقة من البروتين بألواح كروية صغيرة عند تحلل الخلايا ، مما يؤدي إلى اختلاف في محتوى البروتين بين الآبار. قد يكون هذا الأمر أكثر تعقيدا في تحليلات XF باستخدام الكرويات أو الخلايا غير الملتصقة التي تتطلب مواد لاصقة جزيئية حيوية للارتباط بها ، والتي قد تحتوي على البروتين.

وخلافا لمحتوى البروتين داخل الخلايا، فإن محتوى الحمض النووي النووي مستقل عن نوع الخلية ويتناسب مع عدد الخلايا (الشكل 9D) - وهو نهج أكثر دقة وأقل استهلاكا للوقت من تصنيف الكرويات لتحديد عدد الخلايا كميا. وعلى العكس من ذلك، وجد Yepéz et al.55، الذي أجرى تحليلات XF في الطبقات الأحادية من خلايا الخلايا الليفية أن تطبيع بيانات XF إلى رقم الخلية أدى إلى تشتت أكبر للبيانات مما كان عليه قبل التطبيع. محتوى الحمض النووي النووي مستقل عن الحالة المتباينة أو النمط الظاهري ، وبالتالي فهو أكثر دقة لتطبيع البيانات الكروية في مقايسات XF من محتوى البروتين. كان محتوى الحمض النووي أيضا استراتيجية مثبتة لتحليل مجموعات البيانات الأخرى المرتبطة بالتمثيل الغذائي56. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن محتوى الحمض النووي النووي يتم تحديده كميا من جميع الخلايا الموجودة داخل الكروية. لذلك ، لا ينصح بالتطبيع مع محتوى الحمض النووي لمجموعات بيانات XF حيث تخضع الكرويات لعلاجات قد تؤدي إلى فقدان كبير لصلاحية الخلايا. وبالنسبة لمجموعات البيانات هذه، يفضل التطبيع مع صلاحية الخلايا، إن أمكن، أو يمكن تصحيح البيانات على أساس التنفس القاعدي.

استخدام القدرة التنفسية الاحتياطية كنموذج لأهمية تطبيع البيانات
القدرة التنفسية الاحتياطية هي مقياس لمعدل القدرة التنفسية القصوى للميتوكوندريا مطروحا منها معدل التنفس الميتوكوندريا القاعدي (الشكل 6). ومع ذلك ، فإن المشكلة في الإبلاغ عن البيانات من هذا النوع كمعدل ، أي pmolO2 / دقيقة / بئر في تجارب معينة ، هي أن البيانات خالية من التطبيع. حتى لو قام المرء بتطبيع البيانات الكروية إلى كثافة الخلية / محتوى الحمض النووي ، فإن هذا غالبا ما يستبعد المعلمة الرئيسية التي تحتاج إلى تطبيع كثافة الميتوكوندريا داخل الخلايا. وبالنظر إلى أن التغير في كثافة الميتوكوندريا سيؤدي إلى تغيير متناسب في التنفس القاعدي والحد الأقصى، فإن الطاقة الاحتياطية ستزداد أيضا. على سبيل المثال ، إذا كانOCR القاعدي الكروي هو 200 والحدالأقصى للالتعرف الضوئي على الحروف هو 400 ، يتم الإبلاغ عن السعة الاحتياطية على أنها 200 ؛ إذا كان OCR القاعدي هو 100 و OCRكحد أقصى ، فإن الطاقةالاحتياطية هي أيضا 100 ؛ ومع ذلك ، كنسبة مئوية ، كلاهما 50 ٪ من الحد الأقصى (أو 100 ٪ من القاعدية). لذلك ، لا يتم تغيير الطاقة الاحتياطية بين هذين المثالين ، على الرغم من الاختلافات في معدلات 200 و 100 عند حسابها على أنها pmols O2 / دقيقة / بئر. تعد القيم الطبيعية داخليا أكثر موثوقية وبصيرة لجعل بيانات XF أكثر قابلية للمقارنة عبر الدراسات والمشاريع. للقيام بذلك من أجل القدرة التنفسية الاحتياطية ، اخترنا تقديم هذا كنسبة مئوية من التنفس الأقصى بدلا من المعدل المطلق. ويمكن أيضا تقديم هذا كنسبة مئوية من التنفس القاعدي. سيكون هذا هو الحال إذا كان العمل مع الخلايا أو الكروية. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن موقع الكروية في صفيحة microwell قد يغير OCR المطلق ولكن ليس التغييرات النسبية مع المثبطات أو غير المقترنات ، فمن الأهم النظر إلى الاستجابات الطبيعية داخليا في الكرويات كتغيير أضعاف أو نسب مئوية.

تقدم النماذج الكروية التي تم إنشاؤها هنا مجموعة من أنواع الخلايا والهندسة المعمارية التي لا يمكن التقاطها في نماذج 2D الكلاسيكية. وتشمل هذه العوامل الترتيب المكاني غير المتجانس للخلايا في ثلاثة أبعاد، واتصالات الخلايا المعززة (على سبيل المثال، تشكيل تقاطعات الفجوة والمصفوفات خارج الخلية)، والتدرجات البيوكيميائية عبر القطر الكروي (على سبيل المثال، تدرجات الأس الهيدروجيني، ووصول الأكسجين إلى العناصر الغذائية). إن استخدام التدفق خارج الخلية لدراسة البيولوجيا الكروية في المختبر يمكن أن يسمح بتحديد الأهداف المثلى للعلاجات الدوائية من خلال ملاحظات اضطراب التمثيل الغذائي. يمكن استقراء هذه من الكرويات في المختبر إلى الأورام في الجسم الحي وتحديد المسارات التي قد تستهدف استقلاب الورم الكروي ، على سبيل المثال ، استخدام الكربوهيدرات أثناء النمو الكروي. قد تكون الطرائق العلاجية فعالة في استهداف الكرويات في مراحل النمو المبكرة ولكنها تثبت أنها أقل فعالية في المراحل اللاحقة من النمو الكروي مع نضوج تعقيد شبكة التمثيل الغذائي. في الختام ، سيظل تطوير نماذج زراعة الخلايا 3D وتقنيات التحليل المتطورة في البحوث البيولوجية مجالا ديناميكيا وسريع التغير مع إمكانات غير مسبوقة. يمكن استخدام تحليل التدفق خارج الخلية للكرويات المستزرعة في المختبر كطريقة بحثية متطورة لتعزيز نتائج البحوث التي يمكن استقرائها لفهم البيولوجيا ذات الصلة بالإنسان بشكل أفضل ، والحد من استخدام النماذج الحيوانية في البحث ، وتعزيز البحوث التي تركز على المريض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgments

تم دعم N.J.C بجائزة قضية BBSRC MIBTP مع Sygnature Discovery Ltd (BB / M01116X / 1 ، 1940003)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 ECACC  #86012804 Lung carcinoma cell line
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 Agilent Technologies Inc. 103576-100 XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer Agilent Technologies Inc. - Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids
Antimycin A Merck Life Science A8674 Mitochondrial respiratory complex III inhibitor
BAM15 TOCRIS bio-techne 5737 Mitochondrial protnophore uncoupler
Black-walled microplate Greiner Bio-One 655076 For fluorescence-based assays
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates Greiner Bio-One 650970 Microplates for generating spheroids
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681 Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids
Cultrex Poly-D-Lysine R&D Systems a biotechne brand 3439-100-01 Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids
D-(+)-Glucose Merck Life Sciences G8270 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885084 Culture medium for HepG2/C3A spheroids
EVOS XL Core Imaging System Thermo Fisher Scientific AMEX1000 Phase-contrast imaging microscope
EZ-PCR Mycoplasma test kit Biological Industries 20-700-20 Mycoplasma screening in cell cultures
FIJI Is Just Image J Analysis of collated images
Foetal bovine serum Merck Life Science F7524 Supplement for cell culture medium
HepG2/C3A ATCC  #CRL-10741 Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line
Lactate-Glo Promega J5021 Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium
L-glutamine (200 mM solution) Merk Life Sciences G7513 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
M50 Stereo microscope Leica Microsytems LEICAM50 Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling
MCF-7 ECACC #86012803 Breast adenocarcinoma cell line
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes Merck Life Science O4876 ATP Synthase Inhibitor
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140122 Antibiotics added to cell culture medium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Initrogen P7589 Analysis of dsDNA in spehroids
Rotenone Merck Life Science R8875 Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor
RPMI 1640 Gibco 21875091 Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids
Seahorse Analytics Agilent Technologies Inc. Build 421 https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak Agilent Technologies Inc. 102905-100 Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL Greiner Bio-One 606107; 607107; 760107 Consumables for cell culture
SK-OV-3 ECACC  #HTB-77 Ovarian adenocarcinoma cell line
Sodium pyruvate (100 mM solution) Merck Life Science S8636 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
T75 cm2 cell culture flask Greiner Bio-One 658175 Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures
TrypLExpress Gibco 12604-021 Cell dissociation reagent
Wave controller software Agilent Technologies Inc. -
Wide orifice tip STARLAB International GmbH E1011-8400 Pipette tips with wide opening for spheroid handling

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).
  2. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour-stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), 92511 (2014).
  3. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
  4. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
  5. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental and Clinica Cancer Research. 37 (1), 109 (2018).
  6. Courau, T., et al. Cocultures of human colorectal tumor spheroids with immune cells reveal the therapeutic potential of MICA/B and NKG2A targeting for cancer treatment. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 74 (2019).
  7. Ivanova, E., et al. Use of ex vivo patient-derived tumor organotypic spheroids to identify combination therapies for HER2 mutant non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (10), 2393-2403 (2020).
  8. Mandon, M., Huet, S., Dubreil, E., Fessard, V., Le Hegarat, L. Three-dimensional HepaRG spheroids as a liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports. 9 (1), 10548 (2019).
  9. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2020).
  10. Coltman, N. J., et al. Application of HepG2/C3A liver spheroids as a model system for genotoxicity studies. Toxicology Letters. 345, 34-45 (2021).
  11. Tchoryk, A., et al. Penetration and uptake of nanoparticles in 3D tumor spheroids. Bioconjugate Chemistry. 30 (5), 1371-1384 (2019).
  12. Leite, P. E. C., et al. Suitability of 3D human brain spheroid models to distinguish toxic effects of gold and poly-lactic acid nanoparticles to assess biocompatibility for brain drug delivery. Partical Fibre Toxicology. 16 (1), 22 (2019).
  13. Elje, E., et al. Hepato(Geno)toxicity assessment of nanoparticles in a HepG2 liver spheroid model. Nanomaterials. 10 (3), 545 (2020).
  14. Conway, G. E., et al. Adaptation of the in vitro micronucleus assay for genotoxicity testing using 3D liver models supporting longer-term exposure durations. Mutagenesis. 35 (4), 319-330 (2020).
  15. Wang, Z., et al. HepaRG culture in tethered spheroids as an in vitro three-dimensional model for drug safety screening. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 909-917 (2015).
  16. Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
  17. Basharat, A., Rollison, H. E., Williams, D. P., Ivanov, D. P. HepG2 (C3A) spheroids show higher sensitivity compared to HepaRG spheroids for drug-induced liver injury (DILI). Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 115279 (2020).
  18. Benning, L., Peintner, A., Finkenzeller, G., Peintner, L. Automated spheroid generation, drug application and efficacy screening using a deep learning classification: a feasibility study. Scientific Reports. 10 (1), 11071 (2020).
  19. Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
  20. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  21. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  22. Kasianowicz, J., Benz, R., McLaughlin, S. The kinetic mechanism by which CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) transports protons across membranes. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 179-190 (1984).
  23. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  24. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  25. Alexopoulos, S. J., et al. Mitochondrial uncoupler BAM15 reverses diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Communications. 11 (1), 2397 (2020).
  26. Chen, S. -Y., et al. Mitochondrial uncoupler SHC517 reverses obesity in mice without affecting food intake. Metabolism - Clinical and Experimental. 117, 154724 (2021).
  27. Goedeke, L., Shulman, G. I. Therapeutic potential of mitochondrial uncouplers for the treatment of metabolic associated fatty liver disease and NASH. Molecular Metabolism. 46, 101178 (2021).
  28. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biological chemistry. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  29. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  30. Wang, J., et al. Uncoupling effect of F16 is responsible for its mitochondrial toxicity and anticancer activity. Toxicological Sciences. 161 (2), 431-442 (2018).
  31. Tretter, L., Chinopoulos, C., Adam-Vizi, V. Plasma membrane depolarization and disturbed Na+ homeostasis induced by the protonophore carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazon in isolated nerve terminals. Molecular Pharmacology. 53 (4), 734-741 (1998).
  32. Connop, B. P., Thies, R. L., Beyreuther, K., Ida, N., Reiner, P. B. Novel effects of FCCP [carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone] on amyloid precursor protein processing. Journal of neurochemistry. 72 (4), 1457-1465 (1999).
  33. Stöckl, P., et al. Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells. Free Radical Biology and Medicine. 43 (6), 947-958 (2007).
  34. Firsov, A. M., et al. Protonophoric action of BAM15 on planar bilayers, liposomes, mitochondria, bacteria and neurons. Bioelectrochemistry. 137, 107673 (2021).
  35. Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 48 (7), 905-914 (2010).
  36. Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. K., Ertl, P., Kupcu, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D HepG2 spheroid model. Scientific Reports. 9 (1), 4863 (2019).
  37. vanden Brand, D., Veelken, C., Massuger, L., Brock, R. Penetration in 3D tumor spheroids and explants: Adding a further dimension to the structure-activity relationship of cell-penetrating peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (6), 1342-1349 (2018).
  38. Niora, M., et al. Head-to-head comparison of the penetration efficiency of lipid-based nanoparticles into tumor spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21162-21171 (2020).
  39. Millard, M., et al. Drug delivery to solid tumors: the predictive value of the multicellular tumor spheroid model for nanomedicine screening. International Journal of Nanomedicine. 12, 7993-8007 (2017).
  40. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
  41. Benton, G., DeGray, G., Kleinman, H. K., George, J., Arnaoutova, I. In vitro microtumors provide a physiologically predictive tool for breast cancer therapeutic screening. PLoS One. 10 (4), 0123312 (2015).
  42. Hirpara, J., et al. Metabolic reprogramming of oncogene-addicted cancer cells to OXPHOS as a mechanism of drug resistance. Redox Biology. 25, 101076 (2019).
  43. Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
  44. Song, Y., et al. TGF-β-independent CTGF induction regulates cell adhesion mediated drug resistance by increasing collagen I in HCC. Oncotarget. 8 (13), 21650-21662 (2017).
  45. Wrzesinski, K., et al. HepG2/C3A 3D spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
  46. Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5 (4), 1053-1065 (2016).
  47. Takahashi, Y., et al. 3D spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00208 (2015).
  48. Hendriks, D. F. G., Puigvert, L. F., Messner, S., Mortiz, W., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic 3D spheroid models for the detection and study of compounds with cholestatic liability. Scientific Reports. 6, 35434 (2016).
  49. Leung, B. M., Lesher-Perez, S. C., Matsuoka, T., Moraes, C., Takayama, S. Media additives to promote spheroid circularity and compactness in hanging drop platform. Biomaterials Science. 3 (2), 336-344 (2015).
  50. Cavo, M., et al. A synergic approach to enhance long-term culture and manipulation of MiaPaCa-2 pancreatic cancer spheroids. Scientific Reports. 10 (1), 10192 (2020).
  51. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Recent Results in Cancer Research. 95, 1-23 (1984).
  52. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnology and Bioengineering. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  53. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  54. Zhang, X. D., et al. The use of strictly standardized mean difference for hit selection in primary RNA interference high-throughput screening experiments. Journal of Biomolecular Screening. 12 (4), 497-509 (2007).
  55. Yepez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), 0199938 (2018).
  56. Silva, L. P., et al. Measurement of DNA concentration as a normalization strategy for metabolomic data from adherent cell lines. Analytical Chemistry. 85 (20), 9536-9542 (2013).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 180،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 03/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.

Figure 5 was updated from:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

استكشاف استقلاب طاقة الميتوكوندريا من كرويات الأنسجة الدقيقة 3D واحدة باستخدام تحليل التدفق خارج الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coltman, N. J., Rochford, G.,… More

Coltman, N. J., Rochford, G., Hodges, N. J., Ali-Boucetta, H., Barlow, J. P. Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (180), e63346, doi:10.3791/63346 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter