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Cancer Research

बाह्य प्रवाह विश्लेषण का उपयोग करके एकल 3 डी माइक्रोटिशू स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की खोज करना

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63346
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3
1School of Biosciences, University of Birmingham, 2Nanomedicine, Drug Delivery & Nanotoxicology Lab, School of Pharmacy, University of Birmingham, 3Mitochondrial Profiling Centre, University of Birmingham

ERRATUM NOTICE

Summary

ये प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को सीहॉर्स बाह्य प्रवाह विश्लेषण का उपयोग करके 3 डी कैंसर सेल-लाइन-व्युत्पन्न स्फेरॉइड में माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की जांच करने में मदद करेंगे।

Abstract

त्रि-आयामी (3 डी) सेलुलर समुच्चय, जिसे स्फेरॉइड कहा जाता है, हाल के वर्षों में इन विट्रो सेल संस्कृति में सबसे आगे बन गया है। दो आयामी, एकल-कोशिका मोनोलेयर (2 डी संस्कृति) के रूप में संवर्धन कोशिकाओं के विपरीत, गोलाकार सेल संस्कृति शारीरिक सेलुलर वास्तुकला और विवो में मौजूद विशेषताओं को बढ़ावा देती है, नियंत्रित करती है और समर्थन करती है, जिसमें बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन, सेल सिग्नलिंग, जीन अभिव्यक्ति, प्रोटीन उत्पादन, भेदभाव और प्रसार की अभिव्यक्ति शामिल है। ऑन्कोलॉजी, मधुमेह, स्टेम सेल जीव विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग सहित कई शोध क्षेत्रों में 3 डी संस्कृति के महत्व को मान्यता दी गई है। पिछले दशक में, स्फेरॉइड का उत्पादन करने और उनके चयापचय कार्य और भाग्य का आकलन करने के लिए बेहतर तरीके विकसित किए गए हैं।

एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स (एक्सएफ) विश्लेषकों का उपयोग एक्सएफ 24 आइलेट कैप्चर प्लेट या एक्सएफई 96 स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट का उपयोग करके स्फेरॉइड जैसे 3 डी माइक्रोटिश्यू में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए किया गया है। हालांकि, अलग-अलग प्रोटोकॉल और एक्सएफ तकनीक का उपयोग करके स्फेरॉइड में माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की जांच के अनुकूलन का विस्तार से वर्णन नहीं किया गया है। यह पेपर एक्सएफई 96 एक्सएफ विश्लेषक के साथ गोलाकार माइक्रोप्लेट्स का उपयोग करके एकल 3 डी स्फेरॉइड में माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की जांच के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। विभिन्न कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करते हुए, एक्सएफ तकनीक को न केवल विभिन्न आकारों के 3 डी स्फेरॉइड में सेलुलर श्वसन के बीच अंतर करने में सक्षम होने के लिए प्रदर्शित किया जाता है, बल्कि विभिन्न संस्करणों, सेल नंबर, डीएनए सामग्री और प्रकार भी।

ओलिगोमाइसिन, बीएएम 15, रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए के इष्टतम माइटोकॉन्ड्रियल प्रभावक यौगिक सांद्रता का उपयोग 3 डी स्फेरॉइड में माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय के विशिष्ट मापदंडों की जांच करने के लिए किया जाता है। यह पत्र स्फेरॉइड से प्राप्त डेटा को सामान्य करने के तरीकों पर भी चर्चा करता है और कई विचारों को संबोधित करता है जिन्हें एक्सएफ तकनीक का उपयोग करके गोलाकार चयापचय की खोज करते समय विचार किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल उन्नत इन विट्रो स्फेरॉइड मॉडल में अनुसंधान चलाने में मदद करेगा।

Introduction

जैविक अनुसंधान में इन विट्रो मॉडल में प्रगति पिछले 20 वर्षों में तेजी से बढ़ी है। इस तरह के मॉडल में अब ऑर्गन-ऑन-ए-चिप तौर-तरीके, ऑर्गेनोइड और 3 डी माइक्रोटिशू स्फेरॉइड शामिल हैं, जिनमें से सभी इन विट्रो और इन विवो अध्ययनों के बीच अनुवाद में सुधार करने के लिए एक आम फोकस बन गए हैं। उन्नत इन विट्रो मॉडल, विशेष रूप से स्फेरॉइड का उपयोग, ऊतक इंजीनियरिंग, स्टेम सेल अनुसंधान, कैंसर और रोग जीव विज्ञान 1,2,3,4,5,6,7, और आनुवंशिक विष विज्ञान 8,9,10, नैनोमैटेरियल्सविष विज्ञान सहित सुरक्षा परीक्षण सहित कई अनुसंधान क्षेत्रों में फैला हुआहै। 12,13,14, और दवा सुरक्षा और प्रभावकारिता परीक्षण 8,15,16,17,18,19.

सामान्य कोशिका आकृति विज्ञान जैविक फेनोटाइप और गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है। 3 डी माइक्रोटिशू स्फेरॉइड में कोशिकाओं को संवर्धन कोशिकाओं को एक आकृति विज्ञान, फेनोटाइपिक फ़ंक्शन और वास्तुकला को अपनाने की अनुमति देता है, जो विवो में देखे गए समान है लेकिन शास्त्रीय मोनोलेयर सेल संस्कृति तकनीकों के साथ कब्जा करना मुश्किल है। विवो और इन विट्रो दोनों में, सेलुलर फ़ंक्शन सीधे सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट से प्रभावित होता है, जो सेलुलर संचार और प्रोग्रामिंग तक सीमित नहीं है (उदाहरण के लिए, सेल-सेल जंक्शन संरचनाएं, सेल निचे बनाने के अवसर); तत्काल वातावरण में हार्मोन और विकास कारकों के लिए सेल एक्सपोजर (उदाहरण के लिए, भड़काऊ प्रतिक्रिया के हिस्से के रूप में सेलुलर साइटोकिन एक्सपोजर); भौतिक और रासायनिक मैट्रिक्स की संरचना (उदाहरण के लिए, चाहे कोशिकाओं को कठोर ऊतक संस्कृति प्लास्टिक या लोचदार ऊतक वातावरण में उगाया जाता है); और सबसे महत्वपूर्ण बात, सेलुलर चयापचय पोषण और ऑक्सीजन तक पहुंच के साथ-साथ लैक्टिक एसिड जैसे चयापचय अपशिष्ट उत्पादों के प्रसंस्करण से कैसे प्रभावित होता है।

चयापचय प्रवाह विश्लेषण इन विट्रो सिस्टम में परिभाषित सेलुलर चयापचय की जांच करने का एक शक्तिशाली तरीका है। विशेष रूप से, एक्सएफ तकनीक बरकरार कोशिकाओं और ऊतकों के सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स में लाइव, वास्तविक समय के परिवर्तनों के विश्लेषण की अनुमति देती है। यह देखते हुए कि कई इंट्रासेल्युलर चयापचय घटनाएं सेकंड से मिनटों के क्रम में होती हैं, इन विट्रो में बरकरार कोशिकाओं और ऊतकों में सेलुलर चयापचय प्रवाह में वास्तविक समय के परिवर्तनों को समझने के लिए वास्तविक समय कार्यात्मक दृष्टिकोण सर्वोपरि हैं।

यह पेपर कैंसर-व्युत्पन्न सेल लाइनों ए 549 (फेफड़े एडेनोकार्सिनोमा), हेपजी 2 / सी 3 ए (हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा), एमसीएफ -7 (स्तन एडेनोकार्सिनोमा), और एसके-ओवी -3 (डिम्बग्रंथि एडेनोकार्सिनोमा) की खेती के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है क्योंकि इन विट्रो 3 डी स्फेरॉइड मॉडल मजबूर-एकत्रीकरण दृष्टिकोण (चित्रा 1) का उपयोग करते हैं। यह भी (i) विस्तार से वर्णन करता है कि चंचल एक्सएफई 96 एक्सएफ विश्लेषक का उपयोग करके एकल 3 डी स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की जांच कैसे करें, (ii) एकल 3 डी स्फेरॉइड का उपयोग करके एक्सएफ परख को अनुकूलित करने के तरीकों पर प्रकाश डाला गया है, और (iii) इस दृष्टिकोण का उपयोग करके 3 डी गोलाकार चयापचय की जांच के महत्वपूर्ण विचारों और सीमाओं पर चर्चा करता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, यह पेपर बताता है कि डेटासेट कैसे एकत्र किए जाते हैं जो ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) की गणना को ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन निर्धारित करने की अनुमति देते हैं और इस प्रकार सेलुलर स्फेरॉइड में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन। हालांकि इस प्रोटोकॉल के लिए विश्लेषण नहीं किया गया है, बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) एक और पैरामीटर है जिसे एक्सएफ प्रयोगों में ओसीआर डेटा के साथ मापा जाता है। हालांकि, ईसीएआर को अक्सर एक्सएफ डेटासेट से खराब या गलत तरीके से व्याख्या की जाती है। हम प्रौद्योगिकी निर्माता से बुनियादी दृष्टिकोण के बाद ईसीएआर की गणना की सीमाओं के रूप में एक टिप्पणी प्रदान करते हैं।

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Protocol

Figure 1
चित्रा 1: सेलुलर स्फेरॉइड, बाह्य प्रवाह विश्लेषण और डाउनस्ट्रीम परख की पीढ़ी के लिए ग्राफिकल वर्कफ़्लो। चार कैंसर सेल लाइनों को चुनिंदा रूप से मोनोलेयर (ए) के रूप में सुसंस्कृत किया गया था, टिशू कल्चर फ्लास्क से अलग किया गया था, और स्फेरॉइड (बी) बनाने के लिए अल्ट्रालो अटैचमेंट 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट्स में वरीयता दी गई थी। ए 549 फेफड़ों के कार्सिनोमा, हेपजी 2 / सी 3 ए यकृत कार्सिनोमा, एसके-ओवी -3 डिम्बग्रंथि एडेनोकार्सिनोमा, और एमसीएफ -7 स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं को 1 × 103-8 × 103 कोशिकाओं / अच्छी तरह से वरीयता दी गई थी और एकल स्फेरॉइड बनाने और निरंतर अवलोकन और प्लानिमेट्रिक माप द्वारा गोलाकार बीज घनत्व और खेती के समय को अनुकूलित करने के लिए 7 दिनों तक बढ़ाया गया था। एक बार बनने के बाद, एकल स्फेरॉइड को सीरम मुक्त एक्सएफ माध्यम में धोया गया था और सावधानीपूर्वक स्फेरॉइड परख माइक्रोप्लेट्स में वरीयता दी गई थी, पॉली-डी-लाइसिन (सी) के साथ प्रीकोटेड किया गया था। स्फेरॉइड को संबोधित करने के लिए कई प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक्सएफई 96 विश्लेषक का उपयोग करके बाह्य प्रवाह विश्लेषण के अधीन किया गया था: (1) बेसल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन प्रतिक्रिया के लिए इष्टतम गोलाकार आकार; (2) माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन अवरोधकों का अनुकूलित अनुमापन; (3) माइक्रोप्लेट कुओं के भीतर गोलाकार प्लेसमेंट का अनुकूलन। (डी) पोस्ट एक्सएफ विश्लेषण, चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी, और गोलाकार डीएनए परिमाणीकरण का उपयोग डेटा सामान्यीकरण और अन्य डाउनस्ट्रीम इन विट्रो परखों के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. इन विट्रो स्फेरॉइड में 3 डी के रूप में कैंसर सेल लाइनों की खेती

सेल लाइन वर्णन संस्कृति का माध्यम स्रोत
ए 549 फेफड़े के कार्सिनोमा सेल लाइन आरपीएमआई 1640 प्रमाणीकृत सेल संस्कृतियों का यूरोपीय संग्रह (ईसीएसीसी)
सोडियम पाइरूवेट (1 एमएम)
पेनिसिलिन- स्ट्रेप्टोमाइसिन - (100 यू / एमएल - 100 मिलीग्राम / एमएल)
10% (वी /वी) एफबीएस
हेपजी 2/ यकृत कार्सिनोमा सेल लाइन, मूल हेपजी 2 सेल लाइन का एक क्लोनल व्युत्पन्न डीएमईएम अमेरिकन टिशू कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी)
पेनिसिलिन- स्ट्रेप्टोमाइसिन - (100 यू / एमएल - 100 मिलीग्राम / एमएल)
10% (वी /वी) एफबीएस
एमसीएफ 7 स्तन एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन आरपीएमआई 1640 प्रमाणीकृत सेल संस्कृतियों का यूरोपीय संग्रह (ईसीएसीसी)
सोडियम पाइरूवेट (1 एमएम)
पेनिसिलिन- स्ट्रेप्टोमाइसिन - (100 यू / एमएल - 100 मिलीग्राम / एमएल)
10% (वी /वी) एफबीएस
एसके-ओवी -3 डिम्बग्रंथि एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन आरपीएमआई 1640 प्रमाणीकृत सेल संस्कृतियों का यूरोपीय संग्रह (ईसीएसीसी)
सोडियम पाइरूवेट (1 एमएम)
पेनिसिलिन- स्ट्रेप्टोमाइसिन - (100 यू / एमएल - 100 मिलीग्राम / एमएल)
10% (वी /वी) एफबीएस
घटक आरपीएमआई परख मध्यम (50 एमएल अंतिम मात्रा)
बेस मीडियम फुर्तीला सीहॉर्स एक्सएफ आरपीएमआई, पीएच 7.4
ग्लूकोज (1 एम बाँझ स्टॉक) 11 एमएम (0.55 एमएल स्टॉक समाधान)
एल-ग्लूटामाइन (200 एमएम बाँझ स्टॉक) 2 एमएम (स्टॉक समाधान का 0.5 एमएल)
सोडियम पाइरूवेट (100 एमएम बाँझ स्टॉक) 1 एमएम (स्टॉक समाधान का 0.5 एमएल)

तालिका 1: कैंसर सेल लाइन मीडिया और एक्सएफ मीडिया रचनाएं।

  1. मानक सड़न रोकनेवाला ऊतक संस्कृति तकनीक का उपयोग करसभी सेल लाइनों संस्कृति और पुष्टि करते हैं कि वे एक उपयुक्त परख किट का उपयोग करमाइकोप्लाज्मा से मुक्त हैं।
  2. अनुशंसित माध्यम (तालिका 1) का उपयोग करके टी 75 टिशू कल्चर फ्लास्क या समकक्ष में सेल लाइनों को संस्कृति करें। सेल लाइनों को 65-80% संगम तक संस्कृति दें और उन्हें नियमित रूप से अधिकतम 25 मार्ग तक पारित करें।
  3. डलबेको के संशोधित फॉस्फेट-बफर खारा (डीबीपीएस) में सेल संस्कृति फ्लास्क को दो बार कुल्लाएं।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेल पृथक्करण अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) के 3 एमएल के साथ फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करें और माइक्रोस्कोपी द्वारा टुकड़ी की पुष्टि करें।
  5. एक एकल-कोशिका निलंबन सुनिश्चित करने और पूर्ण ऊतक संस्कृति माध्यम के 7 मिलीलीटर के साथ सेल पृथक्करण अभिकर्मक को निष्क्रिय करने के लिए धीरे-धीरे अलग सेल निलंबन की आकांक्षा करें।
  6. 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और पूर्ण माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  7. एक हेमोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और बोने के लिए आवश्यक वांछित सेल घनत्व के लिए टिट्रेट करें।
    नोट: 4 × 103 कोशिकाओं /अच्छी तरह से पर 100 μL/अच्छी तरह से एक पूरे 96-अच्छी तरह से प्लेट बीज करने के लिए, कोशिकाओं को 12 एमएल की अनुशंसित मात्रा में 4 × 104 कोशिकाओं / एमएल तक शीर्षक दिया जाना चाहिए।
  8. एक बाँझ जलाशय में सेल निलंबन डिकेंट और एक मल्टीचैनल पिपेटर का उपयोग कर एक सेल विकर्षक माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 100 μL वितरित करें।
    नोट: माइक्रोप्लेट के केवल आंतरिक 60 कुओं को वरीयता दी जानी चाहिए और शेष डीपीबीएस से भरा होना चाहिए। यह एक वाष्पीकरण बाधा बनाएगा, प्लेट में गोलाकार एकरूपता सुनिश्चित करेगा, और प्लेट किनारे के प्रभाव को कम करेगा।
  9. ढीले समुच्चय में कोशिकाओं को मजबूर करने के लिए 15 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र गोलाकार माइक्रोप्लेट्स।
  10. गोलाकार गठन सुनिश्चित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर प्लेटों को कम से कम 3 दिनों के लिए सेते हैं।
  11. स्फेरॉइड के विकास की निगरानी के लिए मानकीकृत प्रयोगशाला प्रथाओं का उपयोग करके चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी करें। आधा वॉल्यूम मध्यम विनिमय करके हर 3 दिनों या दो बार साप्ताहिक सेल संस्कृति माध्यम को फिर से भरें।

2. बाह्य प्रवाह (एक्सएफ) प्रौद्योगिकी का उपयोग करके एकल स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की जांच करना

  1. परख की तैयारी (एक दिन पहले)
    1. नमूनों के बीच बरकरार गोलाकार संरचना, आकृति विज्ञान और समग्र एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए 4x आवर्धन पर चरण विपरीत के साथ एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गोलाकार व्यवहार्यता की जांच करें।
    2. सेंसर कारतूस को हाइड्रेट करें।
      1. एक शंक्वाकार ट्यूब में कैलिब्रेंट के विभाज्य ~ 20 मिलीलीटर।
      2. रात भर एक गैर सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कैलिब्रेंट युक्त शंक्वाकार ट्यूब रखें।
      3. परख किट से सामग्री निकालें.
      4. उपयोगिता प्लेट से सेंसर कारतूस निकालें और इसे उपयोगिता प्लेट के बगल में वर्कटॉप पर उल्टा रखें।
      5. एक मल्टीचैनल पी 300 पिपेट का उपयोग कर सेंसर कारतूस उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं में बाँझ डीडीएच 2 ओ के पिपेट200μL।
      6. उपयोगिता प्लेट के शीर्ष पर सेंसर कारतूस रखें।
      7. जांचें कि प्रत्येक कुएं में पानी का स्तर सेंसर जांच को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त है।
      8. इकट्ठे सेंसर कारतूस को एक गैर-सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और इसे रात भर छोड़ दें।
        नोट: यह कदम परख शुरू होने से पहले 12-72 घंटे किया जा सकता है।
  2. कोट गोलाकार परख माइक्रोप्लेट
    1. सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करके, गोलाकार माइक्रोप्लेट में बाँझ पॉली-डी-लाइसिन (0.1 मिलीग्राम / एमएल) समाधान के 30 μL / अच्छी तरह से जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इसे सेते हैं।
    2. गोलाकार माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं से समाधान की आकांक्षा करें, प्लेट को उलट दें, और किसी भी अवशिष्ट समाधान को हटाने के लिए इसे टिशू पेपर पर दृढ़ता से टैप करें।
    3. बाँझडीडीएच 2ओ के 200 μL / अच्छी तरह से के साथ प्लेट को दो बार धो लें।
    4. अंतिम धोने के बाद, माइक्रोप्लेट को उल्टा करें और किसी भी अवशिष्ट पानी को हटाने के लिए इसे टिशू पेपर पर दृढ़ता से टैप करें।
    5. भविष्य में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इसका उपयोग करने या संग्रहीत करने से पहले प्लेट को 30 मिनट के लिए हवा में सूखने दें।
      नोट: गोलाकार परख माइक्रोप्लेट को आणविक चिपकने वाला के साथ लेपित किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट के तल पर तय किए गए हैं। आणविक चिपकने वाला के बिना, स्फेरॉइड विस्थापित हो सकते हैं और परख परिणामों में हस्तक्षेप कर सकते हैं। अन्य आणविक चिपकने वाले का उपयोग प्रीकोटिंग प्लेटों के लिए पॉली-डी-लाइसिन के विकल्प के रूप में भी किया जा सकता है। प्रीकोटेड प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है लेकिन परख शुरू होने से पहले कमरे के तापमान को संतुलित करने के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए।
  3. एक्सएफ परख माध्यम तैयार करें
    1. एक्सएफ आरपीएमआई माध्यम तैयार करें, जैसा कि तालिका 1 में विस्तृत है, और 0.22 μm सिरिंज फिल्टर के साथ बाँझ-फ़िल्टर
  4. परख तैयारी (परख से पहले 1 घंटे)
    1. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूरक एक्सएफ आरपीएमआई परख मध्यम प्रीवार्म करें।
    2. एक गैर सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर या शुष्क स्नान में लेपित गोलाकार परख माइक्रोप्लेट प्रीवार्म करें।
    3. सेंसर कारतूस तैयार करें।
      1. एयर इनक्यूबेटर से कैलिब्रेंट और सेंसर कारतूस युक्त शंक्वाकार ट्यूब को बाहर निकालें।
      2. उपयोगिता प्लेट से सेंसर कारतूस निकालें और इसे काम की सतह पर उल्टा रखें।
      3. पी 300 मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, उपयोगिता प्लेट से पानी की आकांक्षा करें और इसे त्याग दें।
      4. एक बाँझ अभिकर्मक जलाशय में कैलिब्रेंट समाधान डालो और एक पी 300 मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर उपयोगिता प्लेट के लिए प्रीवॉर्ड कैलिब्रेंट के 200 μL /
      5. सेंसर कारतूस उठाओ और इसे उपयोगिता प्लेट के शीर्ष पर वापस रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सेंसर कैलिब्रेंट में अच्छी तरह से डूबे हुए हैं।
      6. पोर्ट इंजेक्शन समाधान लोड करने के लिए तैयार होने तक इकट्ठे सेंसर कारतूस को गैर-सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें।
  5. परख माध्यम के साथ स्फेरॉइड धो लें।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर से गोलाकार संस्कृति प्लेट निकालें और गोलाकार हस्तांतरण चरणों से पहले उनकी अखंडता सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत स्फेरॉइड का निरीक्षण करें।
    2. किसी भी पृष्ठभूमि सुधार कुओं सहित प्रीवॉर्फ्ड परख माध्यम के 180 μL/अच्छी तरह से के साथ गोलाकार प्लेट के सभी कुओं को लोड करें।
    3. आंशिक रूप से परख माध्यम के 3 एमएल के साथ एक 7 सेमी पेट्री डिश भरें।
    4. विस्तृत छिद्र पिपेट युक्तियों के साथ भरी हुई एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, 10-50 μL की आकांक्षा मात्रा में पिपेटर सेट करके 96-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट से 7 सेमी पेट्री व्यंजनों में स्फेरॉइड स्थानांतरित करें।
  6. पूर्व-लेपित गोलाकार परख माइक्रोप्लेट में बीज स्फेरॉइड।
    1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप और एक लाइटबॉक्स उपकरण का उपयोग करके, पेट्री डिश से स्फेरॉइड को गोलाकार परख माइक्रोप्लेट में स्थानांतरित करें जैसा कि नीचे विस्तृत है।
      1. 20 μL करने के लिए एक विस्तृत छिद्र पिपेट टिप के साथ फिट एक एकल चैनल पिपेटर की मात्रा सेट करें और ध्यान से एक एकल गोलाकार आकांक्षा। टिप सीधे गोलाकार परख माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं के केंद्र में रखें और गुरुत्वाकर्षण को प्रत्येक कुएं के केंद्र में एक एकल गोलाकार को हटाने की अनुमति दें, यानी, पिपेट टिप से किसी भी माध्यम को निष्कासित न करें और केशिका कार्रवाई को पिपेट टिप से स्फेरॉइड वापस लेने की अनुमति दें। क्षालन की पुष्टि करने के लिए, पिपेटर की सामग्री को माइक्रोस्कोप के तहत 7 सेमी पेट्री डिश में वापस पाइप किया जा सकता है।
        नोट: एक एकल गोलाकार का गुरुत्वाकर्षण क्षालन आमतौर पर गोलाकार आकार / घनत्व के आधार पर 15-30 एस लेता है। इस दौरान पिपेटर को नहीं हटाना चाहिए। किसी भी पृष्ठभूमि सुधार कुओं गोलाकार से मुक्त होना चाहिए और केवल परख माध्यम होते हैं। माइक्रोस्कोप के तहत, प्रत्येक गोलाकार की स्थिति की पुष्टि करें। प्रत्येक गोलाकार आदर्श रूप से प्रत्येक कुएं के केंद्र के भीतर तैनात किया जाना चाहिए।
      2. एक बार जब सभी स्फेरॉइड को गोलाकार परख माइक्रोप्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया है, तो प्लेट को परख से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गैर-सीओ2 इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।

3. एक्सएफ परख के लिए सेंसर कारतूस में यौगिकों की तैयारी और लोडिंग

इंजेक्शन रणनीति कंपाउंड (बंदरगाह) XFe96 माइक्रोवेल प्रारंभ मात्रा (μL) वांछित अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता पोर्ट वॉल्यूम (μL) अंतिम XFe96 माइक्रोवेल वॉल्यूम पोस्ट इंजेक्शन (μL) काम कर रहे स्टॉक एकाग्रता
1 ओलिगोमाइसिन (ए) 180 3 यूजी/एमएल 20 200 30 μg/एमएल
रोटेनोन (बी) 200 2 μM 20 220 22 μM
एंटीमाइसिन ए (बी) 200 2 μM 20 220 22 μM
2 बीएएम 15 (ए) 180 5 μM 20 200 50 μM
रोटेनोन (बी) 200 2 μM 20 220 22 μM
एंटीमाइसिन ए (बी) 200 2 μM 20 220 22 μM

तालिका 2: एक्सएफई 96 विश्लेषक का उपयोग करके एकल 3 डी स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की जांच के लिए माइटोकॉन्ड्रियल यौगिक सांद्रता।

  1. पूरी तरह से पूरक, प्रीवॉर्स्टेड एक्सएफ आरपीएमआई परख माध्यम का उपयोग करके तालिका 2 में उल्लेख के रूप में प्रत्येक यौगिक के काम स्टॉक सांद्रता तैयार करें।
  2. कारतूस प्लेट (उपयोगिता प्लेट के लिए युग्मित) कॉलम-वार, 1-12 को बाएं से दाएं उन्मुख करें।
  3. यदि लोडिंग गाइड का उपयोग कर रहे हैं, तो इसे अच्छी तरह से लोडिंग प्रक्रिया के अनुसार कारतूस प्लेट के ऊपर रखें, उदाहरण के लिए, यदि पोर्ट ए को पहले लोड किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि ए गाइड के ऊपरी-बाएं कोने में दिखाई दे रहा है।
  4. प्रत्येक यौगिक के कामकाजी समाधान को एक उपयुक्त जलाशय में स्थानांतरित करें और, एक कैलिब्रेटेड पी 100 मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, सभी संबंधित बंदरगाहों में 20 μL वितरित करें। शेष बंदरगाहों में प्रत्येक यौगिक के लिए दोहराएं।
    नोट: यदि सेंसर कारतूस प्लेट पर किसी भी बंदरगाह का उपयोग नहीं किया जाता है, तो इन्हें खाली छोड़दिया जा सकता है या परख माध्यम से भरा जा सकता है। यदि केवल एक विशिष्ट बंदरगाह पत्र का चयन किया जा रहा है, तो सुनिश्चित करें कि उस पत्र के अनुरूप अन्य बंदरगाह परख माध्यम से लोड किए गए हैं; अन्यथा, हवा को कुएं में इंजेक्ट किया जाएगा, उन कुओं में परिणामों से समझौता किया जाएगा।
  5. पोर्ट लोडिंग के बाद, प्लेट-लोडिंग गाइड (यदि उपयोग किया जाता है) को हटा दें और सेंसर कारतूस लोड करने के लिए विश्लेषक तैयार करें।
    नोट: यदि बंदरगाहों को लोड करने के तुरंत बाद परख नहीं चलाई जा रही है, तो ढक्कन को सेंसर कारतूस पर वापस रखें और मशीन में लोड करने के लिए तैयार होने तक प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस एयर इनक्यूबेटर में वापस रखें।

4. परख डिजाइन, इंजेक्शन रणनीतियों, और डेटा अधिग्रहण

  1. परख चल रहा है
    1. विश्लेषक पर पावर और नियंत्रक (कंप्यूटर) से कनेक्ट करें।
      नोट: यह वेव नियंत्रक सॉफ्टवेयर के विजेट पैनल में साधन कनेक्शन स्थिति द्वारा सत्यापित किया जा सकता है।
    2. WAVE सॉफ्टवेयर में टेम्पलेट्स पृष्ठ पर नेविगेट करें, प्रयोग के लिए परख टेम्पलेट फ़ाइल ढूंढें और इसे खोलने के लिए डबल-क्लिक करें।
      नोट:: यदि परख टेम्पलेट टेम्पलेट दृश्य पर प्रकट नहीं होता है, तो टेम्पलेट फ़ाइल को साझा नेटवर्क ड्राइव या USB फ़्लैश ड्राइव से टेम्पलेट फ़ोल्डर में आयात करें.
    3. परख शुरू करने के लिए, परख चलाएँ टैब क्लिक करें.
      नोट: यदि समूह परिभाषाओं को प्लेट मानचित्र के भीतर सही ढंग से आवंटित किया गया है, तो परख पृष्ठ के दाईं ओर हरे रंग की टिक द्वारा इंगित के रूप में चलाने के लिए तैयार होगी। इस स्तर पर, किसी भी अतिरिक्त जानकारी परख सारांश पृष्ठ या खाली छोड़ दिया पृष्ठ पर इनपुट किया जा सकता है; अगले चरण पर आगे बढ़ें। 3 डी माइक्रोटिशू स्फेरॉइड (चित्रा 2) में माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर के विलंबित प्रवेश के कारण, तालिका 3 में वर्णित माप प्रोटोकॉल जानकारी का उपयोग करें।
मापन अवधि इंजेक्शन नंबर और पोर्ट मापन विवरण अवधि अवधि (एच: मिनट: एस)
अंशांकन लागू नहीं है। एक्सएफ विश्लेषक हमेशा यह अंशांकन करते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि माप सटीक हैं 00: 20: 00 (यह एक औसत है और मशीनों के बीच भिन्न हो सकता है)
समतुल्यता लागू नहीं है। संतुलन अंशांकन के बाद होता है और इसकी सिफारिश की जाती है। 00:10:00
बेसल लागू नहीं है। चक्र = 5 00:30:00
मिश्रण = 3:00
प्रतीक्षा करें = 0:00
माप = 3:00
ओलिगोमाइसिन / इंजेक्शन 1 (पोर्ट ए) चक्र = 10 01:00:00
मिश्रण = 3:00
प्रतीक्षा करें = 0:00
माप = 3:00
रोटेनोन + एंटीमाइसिन ए इंजेक्शन 2 (पोर्ट बी) चक्र = 10 01:00:00
मिश्रण = 3:00
प्रतीक्षा करें = 0:00
माप = 3:00
कुल समय: 03:00:00

तालिका 3: एक्सएफई 96 विश्लेषक का उपयोग करके एकल 3 डी स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की जांच के लिए प्रोटोकॉल सेटअप।

  1. स्थान सहेजें संवाद बॉक्स लाने के लिए चलाएँ प्रारंभ करें क्लिक करें.
  2. परिणाम फ़ाइल के लिए सहेजें स्थान दर्ज करें, और इकट्ठे सेंसर कारतूस को थर्मल ट्रे पर रखें जो विश्लेषक के किनारे दरवाजे से दिखाई देता है। थर्मल ट्रे स्वचालित रूप से खुलने के लिए और लोड कैलिब्रेंट उपयोगिता प्लेट संदेश प्रदर्शित करने के लिए स्क्रीन की प्रतीक्षा करें। ऑन-स्क्रीन संकेतों का पालन करने से पहले, सुनिश्चित करें कि i) उपयोगिता प्लेट पर सेंसर कारतूस का उचित फिट, ii) ढक्कन सेंसर कारतूस से हटा दिया जाता है, और iii) उपयोगिता प्लेट पर सेंसर कारतूस का सही अभिविन्यास।
  3. सेंसर कारतूस अंशांकन शुरू करने के लिए ऑन-स्क्रीन कमांड का पालन करें।
    नोट: अंशांकन को पूरा करने के लिए लिया गया समय लगभग 10-20 मिनट (37 डिग्री सेल्सियस पर परख के लिए) है।
  4. सेंसर कारतूस अंशांकन के बाद, 12 मिनट संतुलन चरण शुरू करने के लिए वेव नियंत्रक पर ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करके विश्लेषक में गोलाकार माइक्रोप्लेट लोड करें।
    नोट: सफेद टिक्स के साथ हरे रंग के बक्से उस अच्छी तरह से के लिए एक 'अच्छा' अंशांकन इंगित करते हैं। यदि कोई भी कुएं 'अच्छा' अंशांकन प्रदान करने में विफल रहते हैं, तो उन्हें लाल बॉक्स और सफेद क्रॉस के साथ इंगित किया जाएगा। इस तरह के कुओं को नोट किया जाना चाहिए और संशोधन परख टैब का उपयोग करके परख पूरा होने के बाद किसी भी विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।
  5. मशीन संतुलन चरण (साधन प्रोटोकॉल में उल्लिखित के रूप में) पूरा करने के बाद विश्लेषक स्वचालित रूप से आधारभूत माप प्राप्त करना शुरू करने के लिए प्रतीक्षा करें।
  6. प्रयोग को पूरा करने के लिए, वेव नियंत्रक पर ऑन-स्क्रीन कमांड का पालन करें।
    नोट: एक बार जब स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट को विश्लेषक से हटा दिया जाता है, तो सेंसर कारतूस को त्याग दें और यदि आवश्यक हो तो आगे के विश्लेषण के लिए स्फेरॉइड प्लेट को अलग रखें (उदाहरण के लिए, डबल-फंसे (डीएस) डीएनए परिमाणीकरण)। यदि आगे के विश्लेषण के लिए माइक्रोप्लेट की आवश्यकता नहीं है, तो इसे सेंसर कारतूस के साथ त्याग दिया जा सकता है।
  7. परख संवाद के लिए प्रतीक्षा करें प्रकट करने के लिए और परिणाम देखने के लिए या टेम्पलेट्स दृश्य पर लौटने के लिए.

5. डेटा सामान्यीकरण और विश्लेषण रणनीतियों - पोस्ट परख सामान्यीकरण और डाउनस्ट्रीम परख (वैकल्पिक कदम)

  1. डेटा सामान्यीकरण
    1. गोलाकार डेटा को सामान्य करने के लिए, गोलाकार आकार और मात्रा की गणना करने और गोलाकार परख में डीएसडीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए डेटा सामान्यीकरण रणनीतियों से संबंधित प्रोटोकॉल की श्रृंखला देखें। इन्हें पूरक फ़ाइलों के रूप में शामिल किया गया है; पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 देखें।
  2. डेटा विश्लेषण
    1. स्वचालित विश्लेषण जनरेटर में से एक में डेटा निर्यात करने के लिए, WAVE नियंत्रक पर डेटा निर्यात आदेशों का पालन करें और निर्यात जनरेटर का चयन करें जो परख प्रकार से मेल खाता है। वैकल्पिक रूप से, डेटा फ़ाइल निर्यात करें और इसे सीहॉर्स एनालिटिक्स में अपलोड करें।
      नोट: रिपोर्ट जनरेटर और सीहॉर्स एनालिटिक्स का नकारात्मक पक्ष यह है कि डेटा विश्लेषण इस बात तक सीमित है कि एक्सएफ परख कैसे डिज़ाइन की गई है और माप चक्रों में औसत लेने की अनुमति नहीं देती है। इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर से डेटासेट का मैनुअल निर्यात इस संबंध में उपयोगकर्ता वरीयता की अनुमति देता है। यह देखते हुए कि 3 डी स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का आकलन करने के लिए इंजेक्शन रणनीति संभवतः एक विशिष्ट 'माइटोस्ट्रेस' परीक्षण से भिन्न होगी, इन डेटासेट का विश्लेषण करने में मदद करने के लिए स्प्रेडशीट टेम्पलेट्स की एक श्रृंखला विकसित की गई है, जो 3 डी सेल संस्कृतियों के लिए विशिष्ट है और अनुरोध पर प्रदान की जाएगी। ये डेटा टेम्पलेट फ़ाइलें चित्रा 2 में विस्तृत और समझाए गए प्रमुख माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन मापदंडों पर डेटा प्रदान करेंगी।
    2. डेटा का विश्लेषण करने के लिए, वेव नियंत्रक सॉफ़्टवेयर से स्प्रेडशीट रिपोर्ट के रूप में डेटा निर्यात करें और विश्लेषण के लिए एक स्वतंत्र स्प्रेडशीट टेम्पलेट का उपयोग करें।

Figure 2
चित्रा 2: बाह्य प्रवाह डेटा विश्लेषण से प्राप्त मापदंडों के लिए योजनाबद्ध वर्णनकर्ता। संक्षिप्त नाम: ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

अच्छी तरह से गठित, कॉम्पैक्ट स्फेरॉइड प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक सेल लाइन को बोने के घनत्व और खेती की अवधि (चित्रा 3) के लिए व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित किया गया था। सी 3 ए, और एसके-ओवी -3 सेल लाइनों ने शुरू में ढीले समुच्चय का गठन किया जो संस्कृति में 7 दिनों के बाद तक स्पष्ट रूप से परिभाषित परिधि के साथ गोलाकारों में प्रगति नहीं करता था। इसके विपरीत, एमसीएफ -7 कोशिकाएं 3 दिनों के भीतर स्फेरॉइड बना सकती हैं। सभी गोलाकार मॉडल के लिए संस्कृति अवधि के बाद प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व और गोलाकार मात्रा के बीच एक स्पष्ट सहसंबंध था। गोलाकार आकार और आकृति विज्ञान को बोने के घनत्व के लिए अनुकूलित किया गया था। सभी मॉडलों में बढ़े हुए गोलाकार आकार के साथ आकृति विज्ञान और परिपत्रता में गिरावट शुरू हो गई। सेल लाइनों के लिए बीजारोपण रणनीतियों को ए 549 और एसके-ओवी -3 कोशिकाओं के लिए 4 × 10 3 कोशिकाओं / सी 3 ए कोशिकाओं को पहले कहीं और 1 × 103 कोशिकाओं / अच्छी तरह से अनुकूलित किया गया है, और एमसीएफ -7 कोशिकाओं का उपयोग सभी परखों में 4 × 103 कोशिकाओं / अनुकूलित बीजारोपण रणनीतियों पर, गोलाकार मात्रा 5.46 × 107 μm3 (SK-OV-3) और 1.45 × 108 μm 3 (A549) (चित्रा 3B) के बीच थी। सभी गोलाकार प्रकारों में प्रारंभिक बीजारोपण घनत्व और गोलाकार मात्रा के बीच एक रैखिक सहसंबंध था जहां ए 549 और हेपजी 2 / सी 3 ए में क्रमशः 0.957 और 0.947 के आर2 मान थे। एमसीएफ -7 और एसके-ओवी -3 गोलाकार मात्रा दोनों को प्रारंभिक बीजारोपण घनत्व, आर2 = 0.977 (चित्रा 3 ए) के साथ अधिक सहसंबंध पाया गया था।

लंबे और छोटे गोलाकार व्यास का उपयोग करके फिजी विश्लेषण सॉफ्टवेयर के भीतर छवि प्लैनिमेट्री का उपयोग करके गोलाकार परिपत्रता की गणना की गई थी। परफेक्ट गोलाकार समरूपता में परिपत्रता = 1.0 थी; 1.0 से विचलन ने परिपत्रता की हानि का संकेत दिया (चित्रा 3 सी)। अन्य मॉडलों की तुलना में एमसीएफ -7 स्फेरॉइड में परिपत्रता अधिक थी जहां सभी बोने के घनत्व पर 0.83 और 0.9 के बीच परिपत्रता बनाए रखी गई थी। तुलनात्मक रूप से, एसके-ओवी -3 स्फेरॉइड की बाहरी परिधि स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं थी, और संस्कृति में 7 दिनों के बाद भी गोलाकार मात्रा काफी छोटी थी, जो 4 × 103 / सी 3 ए कोशिकाओं को सभी स्फेरॉइड के सतह क्षेत्र में एक समान आकृति विज्ञान के साथ तंग, अच्छी तरह से गठित स्फेरॉइड बनाने के लिए भी पाया गया था, जिसमें 1 × 103 कोशिकाओं / अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के लिए 0.79 पर परिपत्रता बनाए रखी गई थी। ए 549 कोशिकाएं एक प्रवृत्ति का पालन करने के लिए दिखाई दीं जिसमें गोलाकार परिपत्रता और आकृति विज्ञान को बोने के घनत्व के साथ बढ़ाया गया था; हालाँकि, इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले घनत्व पर परिपत्रता 0.63 से अधिक नहीं थी।

बेसल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की गणना ओसीआर के रूप में की गई थी जिसे अल्ट्रालो अटैचमेंट स्फेरॉइड कल्चर माइक्रोप्लेट्स (चित्रा 3 डी) में 1 × 103, 2 × × 10 3, या 8 × 103 कोशिकाओं / सभी गोलाकार प्रकारों के लिए, ओसीआर गोलाकार आकार के साथ बढ़ गया और रैखिक रूप से 0.988 पर एमसीएफ -7 स्फेरॉइड में आर2 उच्चतम के साथ गोलाकार मात्रा से सहसंबद्ध था और 0.744 (चित्रा 3 ई) पर एसके-ओवी -3 स्फेरॉइड में सबसे कम था। मापा ओसीआर सभी प्रयोगात्मक समूहों के बीच सांख्यिकीय रूप से अलग था। ए 54 9 में सबसे कम ओसीआर था, जो सबसे बड़े गोलाकार आकार (चित्रा 3 डी) पर केवल 18 पीएमओएल / इसके विपरीत, एमसीएफ -7 स्फेरॉइड ने संस्कृति में केवल 3 दिनों के बाद सबसे छोटे गोलाकार आकार में एक समान ओसीआर का उत्पादन किया, जो सबसे बड़े गोलाकार आकार (चित्रा 3 डी) के लिए 53 पीएमओएल / सी 3 ए ने ओसीआर डेटा को गोलाकार आकार और आकृति विज्ञान के साथ अत्यधिक संगत किया। 1 से ×10 3 कोशिकाओं / अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त हेपजी 2 / सी3 ए स्फेरॉइड में, बेसलाइन ओसीआर औसतन 15 पीएमओएल / मिनट / अच्छी तरह से पहुंच गया, जो सबसे बड़े स्फेरॉइड (चित्रा 3 डी) में अधिकतम 52 पीएमओएल / मिनट / अच्छी तरह से बढ़ रहा है। एसके-ओवी -3 स्फेरॉइड में ओसीआर केवल ×4 से 10 3 कोशिकाओं / अच्छी तरह से और ×8 से 103 कोशिकाओं / अच्छी तरह से उगाए गए स्फेरॉइड के बीच महत्वपूर्ण था, जिसमें 1 से 103, 2 × × 103, या 4 × 103 कोशिकाओं के बीच उगाए गए स्फेरॉइड में थोड़ा अंतर देखा गया था। आकार के अंतर के बावजूद, ओसीआर डेटा सभी आकार बिंदुओं पर हेपजी 2 / सी 3 ए और एमसीएफ -7 स्फेरॉइड के बीच अत्यधिक समान थे। गोलाकार आकार (μm3) के सापेक्ष, एमसीएफ -7 स्फेरॉइड द्वारा बेसलाइन ओसीआर प्रति अच्छी तरह से 1,000 कोशिकाओं से 7 दिनों में उगाए गए हेपजी 2 /

Figure 3
चित्रा 3: गोलाकार विकास पैरामीटर आधारभूत माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन निर्धारित करते हैं( ए) ए 549, हेपजी 2 / सी 3 ए, एमसीएफ -7, और एसके-ओवी -3 स्फेरॉइड को बोने के घनत्व के लिए अनुकूलित किया गया था और उनकी वृद्धि की निगरानी 1 × 103, 2 × 10 3, 4 × 10 3, और 8 × 103 कोशिकाओं / स्केल बार = 500 μm। (बी) स्फेरॉइड आकार की गणना एकत्र किए गए फोटोमाइक्रोग्राफ से प्लैनिमेट्रिक डेटा का उपयोग करके की गई थी और पियर्सन के सहसंबंध आँकड़े का उपयोग करके तुलना की गई थी; बिंदीदार रेखाएं 95% आत्मविश्वास अंतराल के वितरण का प्रतिनिधित्व करती हैं। (सी) गोलाकार आकृति विज्ञान की तुलना परिपत्रता की गणना से की गई थी। (डी) ओसीआर को 5 एक्स मापा गया था, जिसके बाद रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए को फुर्तीले सीहॉर्स एक्सएफई 96 विश्लेषक का उपयोग करके नॉनमाइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर के लिए खाते में जोड़ा गया था। ओसीआरबेसल को ओसीआर के रूप में मापा जाता है - ओसीआरआर / ए की तुलना बीजारोपण घनत्व (डी) और गोलाकार मात्रा (ई) के बीच की गई थी। डेटा एसईएम ± औसत 5-8 अच्छी तरह से प्रति गोलाकार प्रकार और सेल सीडिंग घनत्व की प्रतिकृति है। संक्षिप्त नाम: ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर; ओसीआरबेसल = बेसल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन; ओसीआरआर/ए = ओसीआर रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए के अलावा के बाद कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक्सएफ विश्लेषण में श्वसन मॉड्यूलेटर के संपर्क में आने के लिए एकाग्रता और समय पाठ्यक्रम परख अनुकूलन में एक महत्वपूर्ण कदम है। श्वसन मॉड्यूलेटर यौगिकों-ओलिगोमाइसिन, बीएएम 15, रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए-या डीएमएसओ वाहन नियंत्रण का मिश्रण क्रमिक रूप से सेंसर कारतूस इंजेक्शन बंदरगाहों के माध्यम से एमसीएफ -7 स्फेरॉइड (चित्रा 4 ए) युक्त माइक्रोप्लेट कुओं में इंजेक्ट किया गया था। सभी नमूना समूहों के लिए 30-40 पीएमओएल / मिनट / अच्छी तरह से औसत बेसल ओसीआर निर्धारित करने के लिए चार माप चक्र पूरे किए गए थे। शेष परख अवधि के लिए, श्वसन मॉड्यूलेटर क्रमिक रूप से इंजेक्शन 1 के बाद 0.5 μM (0.5 μg / एमएल ओलिगोमाइसिन) की अंतिम अच्छी तरह से सांद्रता प्राप्त करने के लिए हर 5 माप चक्र जोड़े गए थे; इंजेक्शन 2 के बाद 2.0 μM (2 μg /एमएल ओलिगोमाइसिन); इंजेक्शन के बाद 5 μM (5 μg / एमएल ओलिगोमाइसिन) 3; और अंत में, चौथे अनुक्रमिक जोड़ के बाद 11 μM (11 μg / एमएल ओलिगोमाइसिन) की अधिकतम अच्छी तरह से एकाग्रता। एमसीएफ -7 स्फेरॉइड ने पूरे प्रयोग (चित्रा 4 ए) में वाहन नियंत्रण का जवाब नहीं दिया। बेसल ओसीआर तुरंत 0.5 μM या 0.5 μg / एमएल ओलिगोमाइसिन (चित्रा 4 बी) की सबसे कम एकाग्रता पर प्रत्येक संबंधित यौगिक के पहले इंजेक्शन के बाद बदल गया। एमसीएफ -7 स्फेरॉइड में ओसीआर को 0.5 μg / एमएल (चित्रा 4 बी) के पहले इंजेक्शन के बाद 5 माप चक्रों के बाद 41 पीएमओएल / मिनट / अच्छी तरह से 23 पीएमओएल / मिनट / अच्छी तरह से ओलिगोमाइसिन के साथ कम किया गया था।

0.5 μm BAM15 के जवाब में, ओसीआर 33 से 41 पीएमओएल / मिनट / अच्छी तरह से दूसरे इंजेक्शन (चित्रा 4 सी) से पहले बढ़ाया गया था। तुलनात्मक रूप से, रोटेनोन प्लस एंटीमाइसिन ए के संयोजन ने दूसरे इंजेक्शन (चित्रा 4 डी) से पहले ओसीआर को 37 से 13 पीएमओएल / काइनेटिक निशान ने ओसीआर में एक स्थिर रैखिक कमी (ओलिगोमाइसिन और रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए) या वृद्धि (बीएएम 15) का खुलासा किया। सभी यौगिक खुराक आहार के लिए, 2 μM BAM15, 2 μM रोटेनोन, 2 μM एंटीमाइसिन ए, और 2 μg / एमएल ओलिगोमाइसिन (चित्रा 4 ए) की कुल अच्छी तरह से एकाग्रता पर 10-12 पूर्ण माप चक्र (60-72 मिनट) के भीतर एक स्थिर राज्य ओसीआर प्राप्त किया गया था। ऑक्सीजन की खपत दर ~ 19 पीएमओएल / मिनट / अच्छी तरह से (ओलिगोमाइसिन), 52 पीएमओएल / मिनट / अच्छी तरह से (बीएएम 15), और 10 पीएमओएल / मिनट / अच्छी तरह से (रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए) (चित्रा 4 ए) पर एक स्थिर-राज्य पठार तक पहुंच गई। ओलिगोमाइसिन, बीएएम 15, या रोटेनोन प्लस एंटीमाइसिन ए की यौगिक एकाग्रता में वृद्धि का ओसीआर पर कोई स्पष्ट प्रभाव नहीं पड़ा, जो शेष परख में स्थिर रहा। ये डेटा प्रदर्शित करते हैं कि 3 डी स्फेरॉइड का उपयोग करते समय श्वसन मॉड्यूलेटर यौगिकों के संपर्क में यौगिक एकाग्रता और समय पाठ्यक्रम दोनों को परख अनुकूलन के लिए माना जाना चाहिए।

Figure 4
चित्रा 4: बाह्य प्रवाह विश्लेषण को अनुकूलित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में श्वसन मॉड्यूलेटर यौगिकों का अनुमापन। (ए) एमसीएफ -7 स्फेरॉइड को एक्सएफ आरपीएमआई युक्त गोलाकार परख माइक्रोप्लेट के कुओं में रखे जाने से पहले 4 × 103 कोशिकाओं / अच्छी तरह से वरीयता दी गई थी और एक्सएफ आरपीएमआई युक्त स्फेरॉइड परख माइक्रोप्लेट के कुओं में रखे जाने से पहले 3 दिनों में सुसंस्कृत किया गया था और एक्सएफई 96 विश्लेषक का उपयोग करके ओसीआर ± माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर के लिए जांच की गई थी। ओसीआर को 5x मापा गया था, जिसके बाद माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी सिंथेज़ को बाधित करने, अधिकतम श्वसन क्षमता निर्धारित करने या क्रमशः नॉनमाइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर स्थापित करने के लिए वाहन नियंत्रण, ओलिगोमाइसिन (बी), बीएएम 15 (सी), या रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए (डी) के अनुमापन जोड़े गए थे। इष्टतम यौगिक एकाग्रता के जवाब में अधिकतम स्थिर-राज्य ओसीआर निर्धारित करने के लिए प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर की एकाग्रता 4 व्यक्तिगत अनुमापन इंजेक्शन रणनीतियों (0.5 μM, 1.5 μM, 3 μM, और 6 μM; ओलिगोमाइसिन के लिए इकाइयाँ μg / प्रत्येक इंजेक्शन के बीच 5 माप चक्रों के लिए ओसीआर को मापा गया था। डेटा 5-8 व्यक्तिगत अच्छी तरह से प्रतिकृतियों से एसईएम ± औसत है। संक्षिप्त नाम: ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक्सएफ प्रौद्योगिकी के मुख्य लाभों में से एक बरकरार कोशिकाओं और ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की जांच करने की क्षमता है। कोशिकाओं और ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के विशिष्ट पहलुओं की जांच करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर को सेंसर कारतूस पर 4 उपलब्ध इंजेक्शन बंदरगाहों के माध्यम से नमूना माइक्रोप्लेट के कुओं में क्रमिक रूप से जोड़ा जाता है। एक्सएफ परख में माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों की जांच करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मॉड्यूलेटर के विशिष्ट अनुक्रम ओलिगोमाइसिन, एक प्रोटोनोफोर (जैसे, एफसीसीपी या बीएएम 15), और रोटेनोन प्लस एंटीमाइसिन ए का संयोजन हैं, जिन्हें माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी सिंथेज़ को बाधित करने के लिए क्रमिक रूप से जोड़ा जाता है, अधिकतम श्वसन क्षमता निर्धारित करता है, और क्रमशः नॉनमाइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर के लिए सही होता है। मॉड्यूलेटर परिवर्धन के इस विशिष्ट अनुक्रम को परख प्रौद्योगिकी निर्माता द्वारा माइटोस्ट्रेस परीक्षण कहा जाता है। यह देखते हुए कि ओलिगोमाइसिन कुछ सेल मोनोलेयर20 में अनकपलर-उत्तेजित श्वसन को रोक सकता है, हमने कैंसर-व्युत्पन्न 3 डी स्फेरॉइड के साथ इसकी जांच की, जिसमें (एकल) से पहले और बाद में (अनुक्रमिक) ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन (चित्रा 5 ए-डी) को मापने के द्वारा अनियंत्रित-उत्तेजित ओसीआर (ओसीआरअधिकतम) को मापा गया। सी 3 ए या एसके-ओवी -3 (चित्रा 5 ई और चित्रा 5 जी) से गठित स्फेरॉइड में ओलिगोमाइसिन के अलावा ओसीआरअधिकतम काफी सीमित नहीं था। हालांकि, बीएएम 15 (चित्रा 5 एफ और चित्रा 5 एच) के एक इंजेक्शन से प्राप्त ओसीआरअधिकतम की तुलना में ओलिगोमाइसिन के बाद बीएएम 15 के अनुक्रमिक इंजेक्शन के बाद ए 54 9 और एमसीएफ -7 स्फेरॉइड में ओसीआरअधिकतम काफी कम हो गया था। जब तक अन्यथा ज्ञात नहीं होता है, इसलिए 3 डी स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की खोज करते समय रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए के अंतिम जोड़ के साथ ओलिगोमाइसिन और अनकपलर के साथ इलाज करने के लिए अलग-अलग कुओं का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यह दृष्टिकोण अभी भी सभी माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों की गणना के लिए एक विशिष्ट माइटोस्ट्रेस परीक्षण के साथ अनुमति देता है जहां यौगिकों को क्रमिक रूप से जोड़ा जाता है।

Figure 5
चित्रा 5: माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन यौगिकों का एकल या अनुक्रमिक इंजेक्शन। सी 3 ए, एसके-ओवी -3, और ए 54 9 के कैंसर-सेल-व्युत्पन्न स्फेरॉइड को एक्सएफ आरपीएमआई में एक्सएफई 96 स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट के कुओं में रखा गया था और एगिलेंट सीहॉर्स एक्सएफई 96 विश्लेषक का उपयोग करके ओसीआर के लिए जांच की गई थी। एमएल ओलिगोमाइसिन (इंजेक्शन पोर्ट ए: ग्रीन ट्रेस) या 5 μM BAM15 (इंजेक्शन पोर्ट ए: ब्लू ट्रेस या इंजेक्शन पोर्ट बी: ग्रीन ट्रेस) माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी सिंथेज़ को बाधित करने और क्रमशः अधिकतम श्वसन क्षमता निर्धारित करने के लिए। काइनेटिक ओसीआर डेटा% बेसल (ए-डी) के रूप में व्यक्त किया जाता है। अधिकतम श्वसन क्षमता (ओसीआरअधिकतम) की गणना समीकरण द्वारा बेसल ओसीआर के कारक के रूप में की गई थी:ओसीआर अधिकतम = ओसीआरबीएएम 15 / ओसीआरअधिकतम माप चक्र 8-10 पोस्ट बीएएम 15 इंजेक्शन (हरी सलाखों) और बिना (नीली सलाखों) ओलिगोमाइसिन में ओसीआर औसत से प्राप्त किया गया था। डेटा 3-8 व्यक्तिगत अच्छी तरह से गोलाकार परख माइक्रोप्लेट भर में प्रतिकृति से एसईएम ± औसत हैं। संक्षिप्त नाम: ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इष्टतम सेल सीडिंग घनत्व, यौगिक सांद्रता, इंजेक्शन रणनीति, और इन अनुकूलन प्रयोगों (तालिका 3) में निर्धारित माप चक्र अवधि का उपयोग करते हुए, हमने बेसल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की सटीक जांच के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल विकसित किया है: ओसीआरबेसल (चित्रा 6 ए), एडीपी फॉस्फोराइलेशन श्वसन: ओसीआरएडीपी (चित्रा 6 बी), रिसाव श्वसन: ओसीआरओमी (चित्रा 6 सी), युग्मन दक्षता (चित्रा 6 डी) ), अधिकतम श्वसन क्षमता: ओसीआरअधिकतम (चित्रा 6 ई), और अतिरिक्त श्वसन क्षमता: कैंसर-व्युत्पन्न 3 डी स्फेरॉइड का उपयोग करके ओसीआरस्पेयर (चित्रा 6 एफ)।

Figure 6
चित्रा 6: कैंसर व्युत्पन्न स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय को स्थापित करने के लिए एक्सएफ तकनीक के साथ ओसीआर की जांच करना। सी 3 ए, एसके-ओवी -3, और ए 54 9 के कैंसर-सेल-व्युत्पन्न स्फेरॉइड को एक्सएफ आरपीएमआई में एक गोलाकार परख माइक्रोप्लेट के कुओं में रखा गया था और फुर्तीला सीहॉर्स एक्सएफई 9 6 विश्लेषक का उपयोग करके ओसीआर के लिए जांच की गई थी। एमएल ओलिगोमाइसिन, या 5 μM BAM15, और आरए को माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी सिंथेज़ को बाधित करने, अधिकतम श्वसन क्षमता निर्धारित करने और क्रमशः नॉनमाइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर की गणना करने के लिए जोड़ा गया था। (ए) बेसल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन (ओसीआरबेसल) की गणना पोर्ट ए इंजेक्शन से पहले 3 माप चक्रों से ओसीआर के औसत के रूप में की गई थी। (बी) ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन की युग्मन दक्षता ओसीआर बेसल के प्रतिशत के रूप में ओसीआरएडीपी (ओसीआरबेसल- ओसीआररिसाव) को व्यक्त करके अनुमानित की गईथी। (सी) एडीपी फॉस्फोराइलेशन श्वसन (ओसीआरएडीपी) को ओलिगोमाइसिन-संवेदनशील ओसीआर के रूप में मापा गया था, जिसकी गणना बीएएम 15 इंजेक्शन से पहले माप चक्र 11-13 में औसत ओसीआर से की गई थी। (डी) रिसावओमी श्वसन (ओसीआररिसाव) को ओलिगोमाइसिन के प्रति असंवेदनशील ओसीआर के रूप में मापा गया था, जिसकी गणना माप चक्र 11-13 में औसत औसत ओसीआर से की गई थी। (ई) अधिकतम श्वसन क्षमता (ओसीआरअधिकतम) को बीएएम 15 इंजेक्शन के बाद मापा गया औसत अधिकतम ओसीआर के रूप में मापा गया था। (एफ) ओसीआर बेसल के प्रतिशत के रूप में ओसीआरस्पेयर (ओसीआरअधिकतम - ओसीआरबेसल) को व्यक्त करके अतिरिक्त श्वसन क्षमता की गणना की गई थी। रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए इंजेक्शन (ओसीआरआर / ए) के बाद ओसीआर को नॉनमाइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर के लिए सही करने के लिए सभी दरों से घटाया गया था। डेटा एक्सएफई 96 स्फेरॉइड प्लेट में 3-8 व्यक्तिगत अच्छी तरह से प्रतिकृतियों से एसईएम ± औसत है। संक्षिप्त नाम: ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर; आरए = 2 μM रोटेनोन-2 μM एंटीमाइसिन ए कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

×3 दिनों में 4 से 103 कोशिकाओं / अच्छी तरह से उगाए गए एमसीएफ -7 स्फेरॉइड का उपयोग स्फेरॉइड परख माइक्रोप्लेट्स के भीतर इष्टतम हस्तांतरण, प्लेसमेंट और विश्लेषण निर्धारित करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया गया था। निर्माता से गोलाकार माइक्रोप्लेट के लिए प्रदान किए गए आयामों का उपयोग करते हुए, अच्छी तरह से सतह को इष्टतम गोलाकार प्लेसमेंट (चित्रा 7 ए) के लिए तीन क्षेत्र-क्षेत्रों में विभाजित किया गया था, जहां ज़ोन 1 को कुएं के केंद्र में इष्टतम क्षेत्र के रूप में हाइलाइट किया गया था। व्यापक छिद्र विंदुक युक्तियों का उपयोग कर सावधान पाइपिंग के साथ, स्फेरॉइड को गोलाकार प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया गया था और गुरुत्वाकर्षण क्षालन (चित्रा 7 बी) द्वारा अच्छी तरह से सतहों पर बेतरतीब ढंग से वितरित किया गया था। जहां गुरुत्वाकर्षण क्षालन का उपयोग करके स्फेरॉइड को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित किया गया था, अधिकांश स्फेरॉइड आमतौर पर निर्माता से अनुशंसित हस्तांतरण तकनीकों का उपयोग करके माइक्रोप्लेट के जोन 1-2 में पाए जा सकते हैं। जहां आकांक्षा द्वारा पिपेट टिप से स्फेरॉइड को मजबूर किया गया था, स्फेरॉइड को अक्सर इन क्षेत्रों से परे रखा जाता था और माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नहीं देखा जा सकता था।

गोलाकार प्लेसमेंट पदों की तुलना करने के लिए, एमसीएफ -7 स्फेरॉइड को निर्दिष्ट क्षेत्रों 1-3 या क्षेत्र (चित्रा 7 ए) से बाहर गोलाकार परख माइक्रोप्लेट्स में स्थानांतरित किया गया था। इन 4 कुओं को बेसलाइन पर एक गतिज प्रयोग ओसीआर के माध्यम से ट्रैक किया गया था और ओलिगोमाइसिन, बीएएम 15, या रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए (चित्रा 7 सी) के अलावा के बाद। ओसीआर प्रत्येक इंजेक्शन (चित्रा 7 बी) से पहले तीन चक्र रीडिंग के मतलब से गणना की गई थी। ओसीआर 4 चयनित कुओं (चित्रा 7 सी) और आधारभूत-सही (चित्रा 7 डी) में 200 मिनट से अधिक मापा गया था। जहां स्फेरॉइड को ज़ोन 3 या ज़ोन से बाहर रखा गया था, बेसलाइन ओसीआर ज़ोन 1 और 2 (चित्रा 7 सी) में रखे गए स्फेरॉइड की तुलना में काफी कम थे। श्वसन यौगिकों ओलिगोमाइसिन, बीएएम 15 और रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए के प्रभाव भी ज़ोन 3 और आउट-ऑफ-ज़ोन क्षेत्रों की तुलना में ज़ोन 1 और 2 में रखे गए स्फेरॉइड के बीच नाटकीय रूप से भिन्न थे। ओसीआर में वृद्धि जोन 3 या ज़ोन (चित्रा 7 ई) से बाहर रखे गए स्फेरॉइड में ओलिगोमाइसिन के साथ देखी गई थी। इसके अलावा, ज़ोन 3 या ज़ोन से बाहर रखे गए स्फेरॉइड ने रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए इंजेक्शन (चित्रा 7 ई) के बाद बेसलाइन से अधिक ओसीआर के साथ बीएएम 15 के लिए अत्यधिक उच्च प्रतिक्रिया का अनुभव किया। ज़ोन 2 बनाम ज़ोन 1 में रखे गए स्फेरॉइड के साथ बेसल ओसीआर (चित्रा 7 सी) में लगभग दो गुना वृद्धि के बावजूद, सभी श्वसन यौगिकों के जवाब में गुना-परिवर्तन बहुत समान थे (चित्रा 7 ई), यह सुझाव देते हुए कि जोन 1 या 2 में रखे गए स्फेरॉइड के बीच बेसल ओसीआर में अंतर कुएं के भीतर प्लेसमेंट का परिणाम होने की संभावना नहीं है।

Figure 7
चित्रा 7: गोलाकार परख माइक्रोप्लेट के भीतर स्फेरॉइड की नियुक्ति एक्सएफ तकनीक का उपयोग करके बेसल ओसीआर और माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर प्रभाव निर्धारित करती है। एमसीएफ -7 स्फेरॉइड को 4 × 103 कोशिकाओं / अच्छी तरह से वरीयता दी गई थी और एक्सएफ आरपीएमआई युक्त गोलाकार माइक्रोप्लेट के कुओं में रखे जाने से पहले 3 दिनों में सुसंस्कृत किया गया था और ओसीआर ± माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर के लिए जांच की गई थी। (ए) परख अवधि के बाद गोलाकार परख माइक्रोप्लेट्स में गोलाकार क्षेत्र पदों के फोटोमाइक्रोग्राफ; स्केल बार = 500 μm और ओसीआर समय के साथ संबंधित कुओं से कब्जा कर लिया या तो पीएमओएल / मिनट -1 / अच्छी तरह से -1 (बी) या% बेसल (सी) के रूप में व्यक्त किया गया। (डी) एमसीएफ -7 स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर प्रभाव गोलाकार परख माइक्रोप्लेट के भीतर विभिन्न क्षेत्रों में रखे गए; बेसल से गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त डेटा। (ई) उदाहरण गतिज ट्रेस हाइलाइटिंग जो ओसीआर डेटा माप (लाल हलकों) का उपयोग ई में प्रस्तुत डेटा के लिए प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर की प्रतिक्रिया की गणना करने के लिए किया जाता है। दिखाए गए डेटा व्यक्तिगत अच्छी तरह से प्रतिक्रियाओं से हैं। संक्षिप्त नाम: ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पृष्ठभूमि के लिए चयन मानदंड उच्च महत्व के हैं; पृष्ठभूमि सुधार के लिए सबसे बाहरी कुओं का उपयोग सभी माइक्रोप्लेट कुओं का प्रतिनिधि नहीं है, जिससे गलत डेटा मान्यताओं को खींचा जा सकता है और गोलाकार माइक्रोप्लेट में किनारे के प्रभाव के कारण गलत डेटा निष्कर्ष निकाले जा सकते हैं। इस अवलोकन का आकलन करने के लिए, एमसीएफ -7 स्फेरॉइड का उपयोग वाहन नियंत्रण, ओलिगोमाइसिन, बीएएम 15, या रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए (चित्रा 8) के अलावा ओसीआर मूल्यों को प्राप्त करने के लिए परख सुधार प्रक्रियाओं की तुलना करने के लिए किया गया था। सभी श्वसन यौगिकों ने चयनित यौगिकों के लिए अपेक्षित गतिज ओसीआर प्रोफाइल का उत्पादन किया, जो 20-30 पीएमओएल / मिनट / अच्छी तरह से (चित्रा 8 ए) की औसत स्थिर बेसल श्वसन दर का खुलासा करता है। हालांकि, जहां पृष्ठभूमि तापमान सुधार (ए 1, ए 12, एच 1 और एच 12) के लिए सबसे बाहरी कुओं का उपयोग करके परख डेटा का विश्लेषण किया गया था, श्वसन यौगिकों के अलावा ओसीआर के लिए प्रकट मूल्य विशेष रूप से कम थे; ओसीआर ने रोटेनोन-एंटीमाइसिन ए के लिए नकारात्मक मूल्य प्राप्त किए। इन टिप्पणियों के जवाब में, वैकल्पिक विश्लेषण खाली कुओं की एक श्रृंखला का उपयोग करके किया गया था, बेतरतीब ढंग से गोलाकार माइक्रोप्लेट में वितरित किया गया था, पृष्ठभूमि तापमान सुधार कुओं (चित्रा 8 बी) के रूप में। जहां वैकल्पिक पृष्ठभूमि सुधार लागू किया गया था, ओसीआर पर सभी सापेक्ष यौगिक प्रभाव दोनों विश्लेषण सेटों में समान थे; हालांकि, निरपेक्ष ओसीआर मूल्यों में लगभग 10 पीएमओएल / मिनट / अच्छी तरह से वृद्धि हुई (चित्रा 8)। ये डेटा स्फेरॉइड परख माइक्रोप्लेट्स पर पृष्ठभूमि तापमान सुधार की शक्ति और महत्व को उजागर करते हैं और एक्सएफ विश्लेषण के लिए उपयोगकर्ता अनुकूलन के महत्व पर जोर देते हैं।

Figure 8
चित्रा 8: गोलाकार परख माइक्रोप्लेट भर में तापमान ढाल के लिए नियंत्रण में सुधार करने के लिए पृष्ठभूमि सुधार के लिए कुओं का यादृच्छिक चयन। पृष्ठभूमि सुधार (ए) बनाम पृष्ठभूमि सुधार (बी) के लिए बेतरतीब ढंग से असाइन किए गए कुओं के लिए अनुशंसित कुओं का उपयोग करके चित्रा 2 ए से ओसीआर डेटा एक्सट्रपलेशन किया गया है। संक्षिप्त नाम: ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल मोनोलेयर के विपरीत, स्फेरॉइड 3 डी स्पेस में कोशिकाओं के विषम एकत्रीकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं और इसलिए विश्लेषण के संबंध में पूरी तरह से विचार करने की आवश्यकता होती है, खासकर जब इन आंकड़ों को सामान्य करते हैं। यह पेपर एमसीएफ -7 स्फेरॉइड (चित्रा 9) से प्राप्त एक्सएफ डेटा को सामान्य करने के लिए तीन दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। जब असामान्यीकृत किया जाता है, तो ओसीआर सकारात्मक रूप से सहसंबंध (आर2 = 0.98) स्फेरॉइड आकार (प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व द्वारा निर्धारित) के साथ काफी हद तक सहसंबंधित होता है जब पियर्सन सहसंबंध गुणांक, पी = 0.0057 (चित्रा 9 ए) के साथ सांख्यिकीय रूप से तुलना की जाती है। यह रैखिक संबंध कम हो जाता है जब ओसीआर को प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व (आर2 = 0.78) के लिए सामान्यीकृत किया जाता है और अब गोलाकार आकार (पी = 0.117, चित्रा 9 बी) के साथ महत्वपूर्ण रूप से सहसंबंध नहीं है। यह भी मामला है जब गोलाकार मात्रा (आर2 = 0.77) के लिए सामान्यीकृत किया जाता है; पियर्सन सहसंबंध गुणांक पी = 0.120, चित्रा 9 सी) और परमाणु डीएसडीएनए सामग्री (आर2 = 0.58; पियर्सन सहसंबंध गुणांक पी = 0.233, चित्रा 9 डी)। ये डेटा स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय की जांच करते समय एक्सएफ डेटा को सामान्य करने के महत्व को उजागर करते हैं, खासकर यदि वे विभिन्न आकारों के हैं।

Figure 9
चित्रा 9: सेलुलर स्फेरॉइड से प्राप्त बाह्य प्रवाह डेटा का सामान्यीकरण( ए) कच्चे ओसीआर डेटा को एमसीएफ -7 से 3 दिनों में सुसंस्कृत किया गया था और स्फेरॉइड सीडिंग घनत्व और ओसीआर के बीच सहसंबंध गुणांक प्राप्त करने के लिए पियर्सन के मॉडल का उपयोग करके प्लॉट किया गया था; पी मान 0.05 पर सेट है। (बी) कच्चे ओसीआर डेटा को प्रारंभिक गोलाकार बीजारोपण घनत्व के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था; (सी) माइक्रोस्कोपी प्लैनिमेट्री से प्राप्त एमसीएफ -7 गोलाकार मात्रा; और (डी) पियर्सन के सहसंबंध गुणांक का उपयोग करने की तुलना में परमाणु डीएस डीएनए सामग्री। संक्षिप्त नाम: ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर; डीएस डीएनए = डबल-फंसे डीएनए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल लाइन बीजारोपण घनत्व (अच्छी तरह से) गोलाकार वृद्धि (दिन) अंतिम गोलाकार आयतन (μM3) बेसल ओसीआर (पीएमओ2/ बेसल ओसीआर के लिए संवेदनशीलता (हाँ /
एसकेओवी 1000 5 9.52ई +06 28 ± 3.5 हाँ
एसकेओवी 2000 5 2.38ई +07 26 ± 1.4 हाँ
एसकेओवी 4000 5 4.92ई +07 36 ± 3.1 हाँ
एसकेओवी 8000 5 1.11ई +08 50 ± 7.9 हाँ
हेपजी 2 1000 5 1.11ई +07 15 ± 0.7 नहीं
हेपजी 2 2000 5 2.88ई +07 23 ± 1.8 हाँ
हेपजी 2 4000 5 5.46ई +07 31 ± 1.7 हाँ
हेपजी 2 8000 5 1.21ई +08 52 ± 2.8 हाँ
ए 549 1000 5 2.11ई +07 30 ± 2.5 हाँ
ए 549 2000 5 3.57E+07 41 ± 1.6 हाँ
ए 549 4000 5 6.93ई +07 53 ± 7.2 हाँ
ए 549 8000 5 1.44ई +08 65 ± 8.4 हाँ
एमसीएफ -7 1000 3 1.60E +07 29 ± 0.8 हाँ
एमसीएफ -7 2000 3 2.52ई +07 37 ± 1.7 हाँ
एमसीएफ -7 4000 3 6.00E +07 46 ± 1.7 हाँ
एमसीएफ -7 8000 3 1.06ई +08 66 ± 2.9 हाँ

तालिका 4: एकल 3 डी स्फेरॉइड में बेसल ओसीआर माप का निर्धारण करने के लिए अनुकूलित पैरामीटर। संक्षिप्त नाम: ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत दर।

पूरक फ़ाइल 1: गोलाकार आकार और मात्रा का विश्लेषण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: गोलाकार माइक्रोप्लेट में स्फेरॉइड से डबल-फंसे डीएनए का परिमाणीकरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: विश्वसनीय एक्सएफ परख डेटासेट प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रतिकृतियों की संख्या के लिए सिफारिशें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मुख्य निष्कर्ष और आउटपुट
यह पत्र एक्सएफई 96 एक्सएफ विश्लेषक के साथ कैंसर-व्युत्पन्न सेल लाइनों की एक श्रृंखला का उपयोग करके एकल 3 डी स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की जांच करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। सी 3 ए, एमसीएफ 7, और एसके-ओवी -3 सेलुलर स्फेरॉइड की तेजी से खेती के लिए एक विधि विकसित और वर्णित है, जो मजबूर एकत्रीकरण के लिए सेल-विकर्षक प्रौद्योगिकियों का उपयोग करती है। यह प्रोटोकॉल एक्सएफ प्रौद्योगिकी के साथ गोलाकार चयापचय की जांच के कई विचारों को संबोधित करता है, जिसमें (1) गोलाकार संस्कृति प्रोटोकॉल का अनुकूलन और उनके मूल संवर्धन जहाजों से प्रौद्योगिकी निर्माता से विशिष्ट गोलाकार परख माइक्रोप्लेट्स में स्फेरॉइड के हैंडलिंग और हस्तांतरण शामिल हैं; (2) उपयोग किए जाने वाले श्वसन यौगिकों की एकाग्रता और यौगिक प्रवेश की समय-निर्भरता; (3) इंजेक्शन रणनीतियों का उपयोग किया जाना है; और (4) प्रयोगात्मक समूहों के बीच डेटा को सामान्य करने के तरीके। इन सभी विचारों की वर्तमान पेपर में जांच की गई है और नीचे विस्तार से चर्चा की गई है। इन विधियों को XFe96 फ्लक्स विश्लेषक के साथ एकल 3 डी स्फेरॉइड का उपयोग करके लगातार चयापचय ऑक्सीजन प्रवाह डेटा उत्पन्न करने के लिए सरलीकृत दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग अन्य गोलाकार मॉडल में उपयोग के लिए एक प्रारंभिक बिंदु और रूब्रिक के रूप में किया जा सकता है जो आसानी से एक बुनियादी प्रयोगशाला सेटिंग के भीतर लागू किए जाते हैं।

विचार
एक्सएफ प्रौद्योगिकी की गोलाकार वृद्धि, आकार और संवेदनशीलता
एक्सएफ प्रौद्योगिकी के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा स्थापित करने के लिए, विशिष्ट मॉडल के लिए परख को चिह्नित और अनुकूलित करना आवश्यक है। यह दृष्टिकोण कोशिकाओं के एक बुनियादी मोनोलेयर में अपेक्षाकृत सरल है; हालाँकि, यह 3 डी स्फेरॉइड के रूप में कोशिकाओं की खेती करते समय अतिरिक्त चुनौतियां प्रस्तुत करता है। यहां प्रस्तुत प्रयोगों के दौरान, निर्माता से आरपीएमआई माध्यम को उपयोग पर पूरक किया गया था। हालांकि यह ध्यान दिया जाता है कि कुछ सेल लाइनें, अर्थात् हेपजी 2 / सी 3 ए, डीएमईएम विकास माध्यम में सुसंस्कृत थीं, इन अपेक्षाकृत कम परखों (~ 3-5 घंटे) के दौरान, आरपीएमआई-डीएमईएम योगों के साथ प्रतिस्थापन का एक्सएफ विश्लेषण पर सीमित प्रभाव पड़ा। दो मीडिया का निर्माण बहुत समान है, और उपयोगकर्ता पूरकता के माध्यम से अपने सेल संस्कृति माध्यमों के मैट्रिक्स से मेल खाने के लिए सीहॉर्स आरपीएमआई मीडिया को 'ट्यून' कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, ग्लूकोज में वृद्धि, कार्बोहाइड्रेट स्रोतों के अलावा। सभी एक्सएफ बफर और माध्यमों के अंतिम सूत्रीकरण के लिए महत्वपूर्ण फिनोल-लाल की अनुपस्थिति है, जो एक्सएफ जांच कारतूस प्लेट के भीतर फ्लोरोसेंट जांच में हस्तक्षेप करने की संभावना है, और सोडियम बाइकार्बोनेट, जो सेल संस्कृति इनक्यूबेटरों में मौजूद सीओ2 बफरिंग की कमी के कारण क्षारीयता का कारण बनेगा। अन्य मीडिया और बफ़र्स खरीदे जा सकते हैं और / या घर में बनाए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, क्रेब्स रिंगर एचईपीईएस बफर एक सरल बफर है जिसका उपयोग स्फेरॉइड मॉडल सहित कई अलग-अलग कोशिकाओं में श्वसन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, एक्सएफ परख के उपयोगकर्ताओं को ध्यान देना चाहिए कि मध्यम / बफर में बदलाव और इसके पूरक इसकी समग्र बफरिंग क्षमता को बदल सकते हैं। यह विशेष रूप से चिंता का विषय है जब उपयोगकर्ताओं को ईसीएआर को मापने में रुचि हो सकती है, जिसमें प्रोटॉन प्रवाह दर (पीईआर) में ईसीएआर परिवर्तन की अनुमति देने के लिए माध्यम के बफर कारक का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है।

चूंकि एक्सएफ तकनीक द्वारा मापा गया सेलुलर ओसीआर सेल घनत्व के आनुपातिक होता है जब कुएं में सेल नंबर सिस्टम की संवेदनशीलता के भीतर होता है, इसलिए एकल 3 डी स्फेरॉइड का उपयोग करके इस संबंध की जांच करना महत्वपूर्ण था। 1,000, 2,000, 4,000, या 8,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से घनत्व पर वरीयता प्राप्त 4 अलग-अलग कैंसर सेल लाइनों से सुसंस्कृत एकल 3 डी स्फेरॉइड के ओसीआर की जांच करके, हम दिखाते हैं कि एक्सएफई 96 विश्लेषक विभिन्न सेल सीडिंग घनत्व (चित्रा 3) से उगाए गए 3 डी स्फेरॉइड के बीच माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की दर में परिवर्तन लेने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है। हम दिखाते हैं कि सेल सीडिंग घनत्व की इष्टतम सीमा, और इस प्रकार ओसीआर की जांच के लिए 3 डी स्फेरॉइड बनाने के लिए गोलाकार मात्रा, सेल प्रकार के आधार पर भिन्न होती है। यह ओसीआर और बोने घनत्व या गोलाकार मात्रा (चित्रा 3) के बीच रैखिक संबंध द्वारा दिखाया गया है। ए 54 9 और हेपजी 2 / सी 3 ए कोशिकाओं के लिए, ओसीआर संवेदनशीलता के लिए इष्टतम बीजारोपण घनत्व 1,000 और 8,000 कोशिकाओं / यह एमसीएफ -7 के लिए 2,000-8,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से और एसके-ओवी -3 कोशिकाओं के लिए 4,000-8,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से था। ये आंकड़े दर्शाते हैं कि एक्सएफ तकनीक का उपयोग करके ओसीआर का आकलन करते समय गोलाकार आकार का अनुकूलन विशेष महत्व का है।

न्यूनतम और अधिकतम गोलाकार मात्रा और बेसल ओसीआर पर विचार
सामान्य तौर पर, इन प्रयोगों के लिए निर्माण द्वारा अनुशंसित औसत दर्जे का ओसीआर मापदंडों के लिए हमेशा न्यूनतम और अधिकतम थ्रेसहोल्ड होगा। एक्सएफई 96 विश्लेषक के लिए, 20 पीएमओएल ओ 2/मिनट/अच्छी तरह से और200 पीएमओएल ओ2/मिनट/अच्छी तरह से के बीच बेसल ओसीआर क्रमशः निचली और ऊपरी सीमाएं हैं। यह मोनोलेयर कोशिकाओं और स्फेरॉइड के साथ मामला है, और जहां प्रयोगात्मक मॉडल इस गतिशील ओसीआर रेंज के भीतर बैठता है, उपलब्ध जैविक सामग्री की मात्रा पर निर्भर करेगा, उदाहरण के लिए, मोनोलेयर के रूप में कोशिकाओं की संख्या या स्फेरॉइड का आकार। यहां उपयोग किए गए गोलाकार मॉडल द्वारा ओसीआर थ्रेसहोल्ड कैसे प्राप्त किए गए थे, इसके उदाहरण के लिए तालिका 4 देखें। कुएं के भीतर ऑक्सीजन स्तर की जांच करना विवेकपूर्ण हो सकता है जिसके लिए ये डेटा स्तर डेटा के रूप में इन मापों से भी उपलब्ध हैं। यह गुणवत्ता नियंत्रण उद्देश्यों के लिए प्रत्येक प्रयोग से नियमित रूप से देखा जाना चाहिए। यदि कुएं में ऑक्सीजन की कमी है, तो यह डेटा के भीतर स्पष्ट हो जाएगा। क्या यह मामला होना चाहिए, प्रयोग के भीतर माप चक्रों को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है; उदाहरण के लिए, मिश्रण चरण को बढ़ाना जैसे कि कुएं में ऑक्सीजन का स्तर माप चक्र के भीतर अगली माप अवधि से पहले पुनर्प्राप्त किया जाता है। यद्यपि संभव हो, हमने वर्णित सेल लाइनों का उपयोग करके एकल-गोलाकार प्रयोगों के लिए यह बहुत संभावना नहीं पाई है।

बाह्य प्रवाह परख के लिए माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर की पसंद
प्रोटॉन आयनोफोरस, जैसे कार्बोनिल साइनाइड 4- (ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी)21, कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफेनिल हाइड्राज़ोन (सीसीसीपी) 22 या बीएएम 1523, शक्तिशाली छोटे अणु रसायन हैं जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में विद्युत रासायनिक प्रोटॉन ढाल को बाधित करने में सक्षम हैं, एटीपी के उत्पादन को बाधित करते हैं, और अंततः माइटोकॉन्ड्रियल श्वसनको अनकपल करते हैं। . इन उद्देश्यों के लिए नए छोटे अणुविकसित किए जा रहे हैं, विशेष रूप से चयापचय रोग 25,26,27 के उपचार में; दो उत्कृष्ट समीक्षा28,29 का संदर्भ लें। इसके विपरीत, ऑक्सीडेटिव श्वसन के अनकपलिंग को अवांछनीय ऑफ-टारगेट विषाक्तता30 के साथ जोड़ा गया है। हालांकि, इन विट्रो सेलुलर परख के भीतर, अणु एफसीसीपी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता को विध्रुवण करता है और प्लाज्मा झिल्ली विध्रुवण जैसे ऑफ-टारगेट प्रभाव डालता है, एनए + आयन प्रवाह31 को बाधित करता है; सेलुलर प्रोटीन प्रसंस्करण32 के साथ हस्तक्षेप, और यहां तक कि सेलुलर सेनेसेंस33 को प्रेरित करना। बीएएम 15 को मूल रूप से 2013 में प्लाज्मा झिल्ली23 पर न्यूनतम प्रभाव के साथ माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर के रूप में पेश किया गया था, जिसमें पूरी कोशिकाओं में माइक्रोमोलर रेंज में प्रोटोनोफोरिक गतिविधि और पृथक माइटोकॉन्ड्रिया23,34 में नैनोमोलर रेंज थी।

प्लाज्मा झिल्ली विध्रुवण पर एफसीसीपी की शक्ति को देखते हुए, बीएएम 15 बाह्य प्रवाह परख में बरकरार पूरी कोशिकाओं में अनकपलिंग श्वसन के लिए एक अधिक विश्वसनीय प्रोटोनोफोर है। यद्यपि एफसीसीपी और इसके समकक्ष, सीसीसीपी का उपयोग अधिकतम श्वसन क्षमताओं को परखने के लिए 50 से अधिक वर्षों से किया गया है और एक्सएफ अध्ययनों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाना जारी है, इन छोटे अणुओं का उपयोग अक्सर माइटोकॉन्ड्रियल और सेलुलर चयापचय क्षमता को कम करके आंका जाता है। यह आंशिक रूप से जुड़ा हुआ है कि एक्सएफ तकनीक का उपयोग करने वाले इतने सारे प्रकाशन नकारात्मक अतिरिक्त श्वसन क्षमताओं की रिपोर्ट करने के जाल में क्यों पड़ते हैं या एफसीसीपी का उपयोग किए जाने पर सच्ची माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमताओं को कम करके आंकते हैं। बरकरार कोशिकाओं और ऊतकों में एफसीसीपी की अतिरिक्त शक्ति अक्सर समझौता माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की ओर ले जाती है, और कोशिकाएं अपने अतिरिक्त के बाद कई माप चक्रों में अधिकतम श्वसन क्षमता को बनाए रखने के लिए उचित रूप से संचालित करने के लिए संघर्ष कर सकती हैं, यहां तक कि बहुत कम सांद्रता35 पर भी। इसलिए, एफसीसीपी के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया प्रारंभिक माप चक्र अवधि के बाद छोड़ने के लिए कई अध्ययनों में पाई जा सकती है। जबकि एफसीसीपी का उपयोग नियमित रूप से एक्सएफ विश्लेषण के लिए किया जाता है, बीएएम 15 का उपयोग पूरी कोशिकाओं या गोलाकार मॉडल से जुड़े मामलों में अधिमानतः किया जाता है, यह देखते हुए कि यह पूरी तरह से विध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया में अधिकतम श्वसन क्षमता को 10 μM 3 जितनी अधिक सांद्रता में बनाए रख सकता है। इसके अलावा, बीएएम 15 बाह्य अम्लीकरण पर प्रभाव डालता है, जो एफसीसीपी 3 की तुलना में अधिक हद तक एचसीओ 3- और एच + बनाने के लिए सीओ2 केजलयोजन के माध्यम से पोषक तत्वऑक्सीकरण के साथ मेल खाता है। फिर भी, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया और पारगम्य कोशिकाओं के मामले में, इनमें से किसी भी अनकपलर को माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग के लिए बीएएम 15 के साथ-साथ प्रदर्शन करना चाहिए यदि सही एकाग्रता पर शीर्षक दिया जाए।

यौगिक प्रवेश और परख साइकिल चलाना के कैनेटीक्स
एक्सएफ विश्लेषक का उपयोग करके 3 डी स्फेरॉइड के साथ एक विशिष्ट माइटोस्ट्रेस परीक्षण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रासायनिक यौगिकों की सांद्रता, प्रवेश और गतिज प्रोफाइल को संबोधित करना अधिक जटिल है। यह देखते हुए कि स्फेरॉइड 3 डी संरचना पेश करते हैं, गोलाकार के व्यास में अणुओं का प्रवेश सेल मोनोलेयर की तुलना में एक असीम रूप से अधिक जटिल प्रक्रिया है। उदाहरण के लिए, गतिज प्रवेश और, इसलिए, कीमोथेरेप्यूटिक सोराफेनिब के प्रति संवेदनशीलता गोलाकार उम्र द्वारा निर्धारित की गई थी और इसलिए, हेपजी 2 स्फेरॉइड मॉडल36 में आकार। जैविक लक्ष्य तक पहुंचने के लिए छोटे अणु रसायनों (जैसे, ड्रग्स, नैनोकणों) की क्षमता कई अंतर्निहित कारकों पर निर्भर करती है, जिसमें सिस्टम की जटिलता को गतिशील रूप से प्रवेश करने और37,38 के माध्यम से फैलाने के लिए शामिल किया जाता है। यह ट्यूमर ऊतक39 को लक्षित करने वाली दवाओं के लिए विशेष रूप से सच है। 3 डी स्फेरॉइड, आकार, कॉम्पैक्टनेस और अन्य फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाओं जैसे ड्रग ट्रांसपोर्टर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के संदर्भ में ट्यूमर लक्ष्यीकरण के समान जैविक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए आवश्यक यौगिक के प्रवेश समय और एकाग्रता को नियंत्रित कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हमने एटीपी सिंथेज़ अवरोधक ओलिगोमाइसिन, प्रोटोनोफोर और माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलर बीएएम 15 के जवाब में प्रवेश समय और छोटे अणु एकाग्रता के आसपास के मुद्दे को संबोधित किया, और कॉम्प्लेक्स I और कॉम्प्लेक्स III अवरोधक रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए के संयोजन को संबोधित किया। इन सामान्य श्वसन यौगिकों के कई अनुमापनों के संपर्क में एकल एमसीएफ -7 स्फेरॉइड के ओसीआर की जांच करके, हम प्रदर्शित करते हैं कि स्थिर-राज्य श्वसन दर को प्रेरित करने के लिए आवश्यक प्रत्येक यौगिक की इष्टतम एकाग्रता मोनोलेयर कोशिकाओं (चित्रा 4) के समान सीमा के भीतर आती है। महत्वपूर्ण रूप से, और उनके मोनोलेयर समकक्षों से अलग, यह दिखाया गया है कि इंजेक्शन के बीच माप चक्रों की संख्या में वृद्धि एकल 3 डी स्फेरॉइड में स्थिर-राज्य ओसीआर प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। ये डेटा इन दृष्टिकोणों का उपयोग करके 3 डी स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन मापदंडों की खोज करते समय यौगिक प्रवेश और उनके संबंधित गतिज प्रोफाइल के महत्व को उजागर करते हैं। चित्रा 3, चित्रा 4, और चित्रा 5 में प्रस्तुत डेटा द्वारा सूचित गोलाकार अनुकूलन गुणों, यौगिकों की सांद्रता और माप चक्र समय का उपयोग करते हुए, कैंसर व्युत्पन्न 3 डी स्फेरॉइड (चित्रा 6) की एक श्रृंखला में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव चयापचय के विशिष्ट मापदंडों की जांच के लिए एक मान्य माइटोस्ट्रेस परीक्षण स्थापित किया गया था। महत्व का, और कुछ मोनोलेयर कैंसर सेल लाइनों40 की तरह, कुछ कैंसर-व्युत्पन्न 3 डी स्फेरॉइड की अधिकतम श्वसन क्षमता (अयुग्मित-उत्तेजित श्वसन की दर) ओलिगोमाइसिन (चित्रा 5) द्वारा बाधित थी। विशेष रूप से, ए 54 9 या एमसीएफ -7 कोशिकाओं से उगाए गए 3 डी स्फेरॉइड ने ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन के बाद बीएएम 15 के साथ असंबद्ध होने पर श्वसन की काफी कम अधिकतम दर दिखाई, ओलिगोमाइसिन (चित्रा 5 एफ और चित्रा 5 एच) के बिना बीएएम 15 द्वारा असंबद्ध होने की तुलना में। यह देखते हुए कि यह प्रभाव अन्य 3 डी स्फेरॉइड संस्कृतियों के भीतर मौजूद हो सकता है, हम सुझाव देते हैं कि जब तक पहले से मान्य प्रोटोकॉल नियोजित नहीं किया जाता है, तब तक 3 डी स्फेरॉइड में अधिकतम श्वसन क्षमता का अनुमान ओलिगोमाइसिन के बिना लगाया जाना चाहिए।

सेलुलर स्फेरॉइड में ग्लाइकोलाइटिक प्रवाह के उपाय के रूप में ईसीएआर डेटा का एक साथ संग्रह
जैसा कि आमतौर पर प्रौद्योगिकी निर्माता से साहित्य या जानकारी में देखा जाता है, ईसीएआर के रूप में मापा जाने वाला स्फेरॉइड की ग्लाइकोलाइटिक दर, एक माध्यमिक पैरामीटर है जिसे ओसीआर के साथ कैप्चर किया जा सकता है। अकेले ईसीएआर की गणना करना किसी भी एक्सएफ प्रयोग में एक उपयोगी या सार्थक पैरामीटर नहीं है क्योंकि यह एक्सएफ परख बफर की बफरिंग क्षमता या माइटोकॉन्ड्रियल अम्लीकरण के अलावा के लिए सही नहीं है, जो सीओ2 से एचसीओ3- और एच + के जलयोजन से उत्पन्न होता है। ईसीएआर केवल तभी व्यावहारिक होता है जब इन डेटा सुधारों को लागू किया जाता है, जिसके बाद ग्लाइकोलाइटिक प्रवाह के बारे में अधिक सटीक निष्कर्ष प्रदान करना संभव हो जाता है। प्रति डेटा अधिक सार्थक उत्पन्न करने के लिए बफरिंग क्षमता के लिए सही करने के लिए, किसी को स्फेरॉइड माइक्रोप्लेट के लिए माइक्रोचैंबर की मात्रा जाननी चाहिए। निर्माता गोलाकार माइक्रोप्लेट के साथ इसके लिए एक वास्तविक मात्रा प्रदान करने में असमर्थ रहा है, और इसलिए, प्रति डेटा आसानी से निर्धारित नहीं किया जा सकता है। दरअसल, यद्यपि इन मापों को अनुभवजन्य रूप से प्राप्त किया जा सकता है, यह इस पांडुलिपि के दायरे से परे था। हालांकि, उचित सुधार के साथ और कुएं में मौजूद किसी दिए गए गोलाकार आकार (जैसे, गोलाकार घनत्व का माप प्राप्त करना) के लिए माइक्रोचैंबर की मात्रा जानने के साथ, ईसीएआर डेटा सार्थक हो जाएगा, और ग्लाइकोलाइटिक पीईआर की गणना की जा सकती है। इसलिए, एक्सएफ डेटा तब स्फेरॉइड में ग्लाइकोलाइटिक और ऑक्सीडेटिव चयापचय की जांच के लिए अधिक जानकारीपूर्ण हो सकता है, लेकिन केवल तभी जब इन मापदंडों को गहराई से माना जाता था।

गोलाकार गठन, हैंडलिंग, स्थानांतरण और आंदोलन
कुछ सेल लाइनें दूसरों की तुलना में स्फेरॉइड के गठन के लिए बेहतर अनुकूल हैं और स्फेरॉइड बिल्कुल नहीं बना सकती हैं, उदाहरण के लिए, एमसीएफ -7 डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाएं41,42 अन्य सेल लाइनों (चित्रा 3) की तुलना में अत्यधिक परिपत्र स्फेरॉइड बनाती हैं। एक अन्य उदाहरण के रूप में, कैपन -1 अग्नाशयी कैंसर कोशिकाओं को पैंक -1 या बीएक्सपीसी 343 की तुलना में बेहतर स्फेरॉइड बनाने के लिए दिखाया गया है। इसी तरह, यकृत कार्सिनोमा सेल लाइनों को कॉम्पैक्ट स्फेरॉइड 5,44 बनाने के लिए चर क्षमताओं के लिए जाना जाता है, फेनोटाइप में एक मनाया परिवर्तन जैसे कि बढ़ी हुई दवा चयापचय या एल्बुमिन का उत्पादन, जैसा कि हेपजी 2 बनाम हेपजी 2 / सी 3 ए 9,45,46 या हेपाआरजी स्फेरॉइड 17,47,48 के मामले में है . इसलिए, उपयोगकर्ताओं को तदनुसार गोलाकार संवर्धन तकनीकों का अनुकूलन करना चाहिए और इष्टतम बोने के घनत्व और खेती के समय पाठ्यक्रम को निर्धारित करने के लिए अनुमापन प्रयोग करना चाहिए। इसके अलावा, परख मीडिया के निर्माण और संरचना को स्फेरॉइड फॉर्मूलेशन को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, जिसमें मिथाइलसेल्यूलोज के अलावा, अक्सर मैट्रिक्स चिपचिपाहट 43,49,50 को बढ़ाने के लिए मीडिया में जोड़ा जाता है। इसलिए, इष्टतम सेल माध्यम संरचना का उपयोग सभी सेल लाइनों के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।

गोलाकार संस्कृति में मध्यम एक्सचेंजों की संख्या उपयोग की जाने वाली सेल लाइन द्वारा निर्धारित की जाती है। हालांकि, आमतौर पर, पोषक तत्वों को फिर से भरने के लिए ज्यादातर मामलों में हर 2-3 दिनों में आधा वॉल्यूम मध्यम आदान-प्रदान लागू होता है। हमने एक्सएफ विश्लेषण अध्ययनों में गोलाकार मॉडल के तेजी से विकास और तैनाती के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्रोतों से सेल-विकर्षक माइक्रोप्लेट्स का उपयोग करके 3 डी स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए मजबूर-समग्र दृष्टिकोण का उपयोग किया। हालांकि, वैकल्पिक प्लेटफ़ॉर्म अन्य सेल प्रकारों से स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए बेहतर अनुकूल हो सकते हैं, उदाहरण के लिए, हैंगिंग-ड्रॉप या मैट्रिक्स-एम्बेडेड दृष्टिकोण। संसाधन-सीमित प्रयोगशालाओं में, उपयोगकर्ता प्रारंभिक स्फेरॉइड विधि विकास चरणों की आर्थिक लागत को काफी कम करने के लिए सेल-विकर्षक माइक्रोप्लेटसतहों 51,52 के गठन के लिए एगरोज़-तरल ओवरले तकनीक की ओर देखना चाह सकते हैं। एक्सएफ विश्लेषण और अन्य डाउनस्ट्रीम परख करने के लिए संस्कृति वाहिकाओं के बीच स्फेरॉइड की गति आवश्यक है। हस्तांतरण में आसानी आमतौर पर गोलाकार आकार और समग्र घनत्व द्वारा निर्धारित की जाती है। हम गोलाकार अखंडता बनाए रखने के लिए पी 200 या पी 1000 चौड़े छिद्र पिपेट टिप का उपयोग करने की सलाह देते हैं; छोटे बोर पिपेट युक्तियाँ गोलाकार के यांत्रिक व्यवधान का जोखिम उठाती हैं, जिसे व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है या देखभाल के साथ, छिद्र को बढ़ाने के लिए पिपेट टिप के अंत को ट्रिम करके बनाया जा सकता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण टिप के अंत के आसपास प्लास्टिक को फरिंग पेश करने के लिए उत्तरदायी हो सकता है, जो हैंडलिंग के दौरान यांत्रिक व्यवधान पैदा कर सकता है। एक बैकलाइट या लाइटबॉक्स का उपयोग स्फेरॉइड परख माइक्रोप्लेट में स्फेरॉइड के सफल हस्तांतरण को सुनिश्चित करने के लिए एक आवश्यक कदम के रूप में विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत गोलाकार हैंडलिंग और अवलोकन के लिए भी उपयोगी है। इसके अलावा, एक गोलाकार परख माइक्रोप्लेट के कुएं के भीतर गोलाकार स्थिति विशेष महत्व की है और सीधे एक विशिष्ट माइटोस्ट्रेस परीक्षण (चित्रा 7) के दौरान ओसीआर और यौगिक प्रभाव को प्रभावित करती है, सबसे अधिक संभावना गोलाकार स्थिति और सेंसर जांच फ्लोरोफोरस के संबंध के कारण होती है।

पृष्ठभूमि सुधार और तापमान नियंत्रण कुओं
माइक्रोप्लेट-आधारित परख का उपयोग कई अनुसंधान क्षेत्रों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण है; हालाँकि, उनका उपयोग कई व्यावहारिक चुनौतियां प्रस्तुत करता है। जैसा कि अन्य प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों में सच है, विशेष रूप से वे जो 96 (या अधिक) सरणी प्रारूप का उपयोग करते हैं, माइक्रोप्लेट ज्यामिति और स्थिति समय के साथ प्लेट में तापमान और गैस-विनिमय ढाल को प्रभावित कर सकती है, जिसे अक्सर 'एज इफेक्ट्स' 53,54 कहा जाता है। हमने स्फेरॉइड परख माइक्रोप्लेट के बारे में भी यही सच पाया। निर्माता के दिशानिर्देशों और प्रोटोकॉल के तहत, सबसे बाहरी कोने के कुएं: ए 1, ए 12, एच 1 और एच 12 को हमेशा एक्सएफई 96 विश्लेषक के लिए पृष्ठभूमि सुधार और तापमान नियंत्रण कुओं के रूप में नामित किया जाता है। इसके विपरीत, 24-अच्छी तरह से सरणी प्रारूप के साथ, ए 1 और डी 6 को नियंत्रण कुओं के रूप में नामित किया गया है, साथ ही दो अन्य कुओं के साथ समान रूप से बी 4 और सी 3 में प्लेट के बीच में फैले हुए हैं। एक्सएफ गोलाकार विश्लेषण करने पर, हमें निर्माता के मार्गदर्शन का उपयोग करके शुरू में एकत्र किए गए डेटा में महत्वपूर्ण विचलन मिला। यह डेटा के अधिग्रहण शुरू करने से पहले तापमान और सीओ2 सामग्री के लिए परख प्रीइक्विलिब्रेशन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक चरणों को शामिल करने के बावजूद था, अक्सर कुछ श्वसन अवरोधकों (चित्रा 8) के इंजेक्शन के बाद ओसीआर के लिए नकारात्मक मूल्यों का उत्पादन।

हमने इन टिप्पणियों को गोलाकार परख माइक्रोप्लेट में किनारे के प्रभाव के कारण पाया। चित्रा 8 में, हमने पाया कि माइक्रोप्लेट में पृष्ठभूमि नियंत्रण कुओं को पुनर्वितरित करना, एक्सएफ डेटा लगभग 2 गुना समायोजित किया गया था। दो सबसे संभावित कारण (1) किनारे के कुओं पर वाष्पीकरण प्रभाव के कारण एक्सएफई 96 जांच के लिए नमूने के लिए एक छोटे कुल वॉल्यूम चैंबर के परिणामस्वरूप, और (2) पृष्ठभूमि सुधार और नमूना कुओं के लिए नामित उन कुओं के बीच अपर्याप्त तापमान संतुलन से, जिसके परिणामस्वरूप डेटासेट होते हैं जो या तो मास्क या ओवर-फुलाते हैं ओसीआर। इस तरह के परिणामों से बचने के लिए, इसलिए यह अनुशंसा की जाती है, विशेष रूप से गोलाकार विश्लेषण के संदर्भ में, कि उपयोगकर्ता गोलाकार परख माइक्रोप्लेट की संपूर्णता में पृष्ठभूमि सुधार के लिए नामित कुओं को पुनर्वितरित करते हैं और एक्सएफ डेटा प्राप्त करने से पहले अपने परख को पूर्व-संतुलित करने के लिए आवश्यक कदम उठाते हैं।

डेटा का सामान्यीकरण
एक्सएफ तकनीक के साथ एकल 3 डी स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की जांच के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के अलावा, यह पेपर 3 डी स्फेरॉइड के साथ प्राप्त माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर डेटा को सामान्य करने के संभावित तरीके भी प्रस्तुत करता है। विभिन्न सेल सीडिंग घनत्व (चित्रा 3) पर सुसंस्कृत एमसीएफ -7 स्फेरॉइड के साथ प्राप्त श्वसन दर डेटा का उपयोग करते हुए, हम प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व, गोलाकार मात्रा और डीएसडीएनए सामग्री (चित्रा 9) के लिए सामान्यीकृत होने पर बढ़ते आकार और व्यास के एमसीएफ -7 स्फेरॉइड से बेसल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर पेश करते हैं। एक्सएफ डेटासेट की सटीक व्याख्या के लिए उपयुक्त सामान्यीकरण विधि सर्वोपरि है, खासकर जब इन विट्रो 3 डी स्फेरॉइड मॉडल और विभिन्न सेल प्रकारों की तुलना की जाती है। खराब सामान्यीकरण गलत परिणाम पैदा कर सकता है जिसकी तुलना डेटासेट के बीच नहीं की जा सकती है। स्फेरॉइड एक्सएफ डेटा के सामान्यीकरण के लिए प्रोटीन सामग्री को प्राथमिकता नहीं दी जाती है, क्योंकि प्रीट्रीटमेंट श्वसन दर पर महत्वपूर्ण प्रभाव के बिना प्रोटीन संश्लेषण की दर को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, प्रोटीन की महत्वपूर्ण, असंगत मात्रा सेल लिसिस पर गोलाकार माइक्रोप्लेट्स से बंध सकती है, कुओं के बीच प्रोटीन सामग्री में भिन्नता पेश करती है। यह स्फेरॉइड या नॉनएडेरेंट कोशिकाओं का उपयोग करके एक्सएफ विश्लेषण में और जटिल हो सकता है, जिन्हें बांधने के लिए बायोमोलेक्यूलर गोंद की आवश्यकता होती है, जिसमें प्रोटीन हो सकता है।

इंट्रासेल्युलर प्रोटीन सामग्री के विपरीत, परमाणु डीएनए सामग्री सेल प्रकार से स्वतंत्र है और सेल नंबर (चित्रा 9 डी) के आनुपातिक है- सेल नंबर परिमाणीकरण के लिए स्फेरॉइड के विघटन की तुलना में अधिक सटीक और कम समय लेने वाला दृष्टिकोण। इसके विपरीत, येपेज़ एट अल .55, फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के मोनोलेयर में एक्सएफ विश्लेषण का संचालन करते हुए, पाया गया कि एक्सएफ डेटा को सेल नंबर में सामान्य करने से सामान्यीकरण से पहले की तुलना में डेटा का अधिक फैलाव शुरू हुआ। परमाणु डीएनए सामग्री विभेदित अवस्था या फेनोटाइप से स्वतंत्र है और इसलिए प्रोटीन सामग्री की तुलना में एक्सएफ परख में गोलाकार डेटा के सामान्यीकरण के लिए अधिक सटीक है। डीएनए सामग्री अन्य चयापचय से जुड़े डेटासेट56 के विश्लेषण के लिए एक सिद्ध रणनीति भी रही है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि परमाणु डीएनए सामग्री गोलाकार के भीतर मौजूद सभी कोशिकाओं से मात्रा निर्धारित की जाती है; इसलिए, एक्सएफ डेटासेट के लिए डीएनए सामग्री के सामान्यीकरण की सिफारिश नहीं की जाती है जिसमें स्फेरॉइड उपचार से गुजरते हैं जिसके परिणामस्वरूप सेल व्यवहार्यता का महत्वपूर्ण नुकसान हो सकता है। इस तरह के डेटासेट के लिए, यदि संभव हो, तो सेल व्यवहार्यता के लिए सामान्यीकरण को प्राथमिकता दी जाती है, या डेटा को बेसल श्वसन के लिए बेसलाइन-सही किया जा सकता है।

डेटा सामान्यीकरण के महत्व के लिए एक उदाहरण के रूप में अतिरिक्त श्वसन क्षमता का उपयोग करना
अतिरिक्त श्वसन क्षमता अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता माइनस बेसल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर (चित्रा 6) की दर का एक उपाय है। हालांकि, इस प्रकार के डेटा को दर के रूप में रिपोर्ट करने के साथ मुद्दा, अर्थात्, पीएमओएलओ2/मिनट /अच्छी तरह से कुछ प्रयोगों के भीतर, यह है कि डेटा सामान्यीकरण से रहित है। डीएनए सामग्री के लिए गोलाकार डेटा को सामान्य करता है, यह अक्सर प्रमुख पैरामीटर को बाहर करता है जिसे कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व के लिए सामान्यीकृत करने की आवश्यकता होती है। यह देखते हुए कि माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व में परिवर्तन से बेसल और अधिकतम श्वसन में आनुपातिक परिवर्तन होगा, अतिरिक्त क्षमता भी बढ़ेगी। उदाहरण के लिए, यदि गोलाकार ओसीआरबेसल 200 है और ओसीआरअधिकतम 400 है, तो अतिरिक्त क्षमता 200 के रूप में रिपोर्ट की जाती है; यदि ओसीआरबेसल 100 और ओसीआरअधिकतम है, तो अतिरिक्त क्षमता भी 100 है; हालाँकि, प्रतिशत के रूप में, वे अधिकतम (या बेसल का 100%) का 50% दोनों हैं। इसलिए, इन दो उदाहरणों के बीच अतिरिक्त क्षमता नहीं बदली जाती है, 200 और 100 की दरों में अंतर के बावजूद जब पीएमओएल ओ2 / मिनट / अच्छी तरह से गणना की जाती है। अध्ययन और परियोजनाओं में एक्सएफ डेटा को अधिक तुलनीय बनाने के लिए आंतरिक रूप से सामान्यीकृत मूल्य अधिक विश्वसनीय और व्यावहारिक हैं। अतिरिक्त श्वसन क्षमता के लिए ऐसा करने के लिए, हमने इसे पूर्ण दर के बजाय अधिकतम श्वसन के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत करने के लिए चुना है। इसे बेसल श्वसन के प्रतिशत के रूप में भी प्रस्तुत किया जा सकता है। यह मामला होगा यदि कोशिकाओं या स्फेरॉइड के साथ काम करना। हालांकि, यह देखते हुए कि माइक्रोवेल प्लेट में स्फेरॉइड का स्थान पूर्ण ओसीआर को बदल सकता है, लेकिन अवरोधकों या अनकपलर्स के साथ सापेक्ष परिवर्तन नहीं, स्फेरॉइड में आंतरिक रूप से सामान्यीकृत प्रतिक्रियाओं को गुना परिवर्तन या प्रतिशत के रूप में देखना अधिक महत्वपूर्ण है।

यहां उत्पन्न गोलाकार मॉडल सेल प्रकार और वास्तुकला की एक श्रृंखला प्रस्तुत करते हैं जिन्हें शास्त्रीय 2 डी मॉडल में कैप्चर नहीं किया जा सकता है। इनमें तीन आयामों में कोशिकाओं की विषम, स्थानिक व्यवस्था, बढ़ी हुई सेल-सेल संपर्क (जैसे, गैप जंक्शनों और बाह्य मैट्रिक्स का गठन), और गोलाकार व्यास (जैसे, पीएच ग्रेडिएंट, पोषक तत्वों तक ऑक्सीजन प्रसार पहुंच) में जैव रासायनिक ढाल शामिल हैं। इन विट्रो गोलाकार जीव विज्ञान में अध्ययन करने के लिए बाह्य प्रवाह का उपयोग करने से चयापचय गड़बड़ी टिप्पणियों के माध्यम से दवा उपचारों के लिए इष्टतम लक्ष्यों की पहचान की जा सकती है। इन्हें इन विट्रो स्फेरॉइड से विवो ट्यूमर में एक्सट्रपलेशन किया जा सकता है और उन मार्गों की पहचान की जा सकती है जो स्फेरॉइड-ट्यूमर चयापचय को लक्षित कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, गोलाकार विकास के दौरान कार्बोहाइड्रेट का उपयोग। चिकित्सीय तौर-तरीके प्रारंभिक विकास चरणों में स्फेरॉइड को लक्षित करने में प्रभावी हो सकते हैं लेकिन चयापचय नेटवर्क जटिलता परिपक्व होने पर गोलाकार विकास के बाद के चरणों में कम प्रभावी साबित होते हैं। निष्कर्ष निकालने के लिए, जैविक अनुसंधान में 3 डी सेल संस्कृति मॉडल और परिष्कृत विश्लेषण प्रौद्योगिकियों का विकास नायाब क्षमता के साथ एक गतिशील और तेजी से बदलते क्षेत्र बना रहेगा। इन विट्रो सेल कल्चर स्फेरॉइड के बाह्य प्रवाह विश्लेषण को अनुसंधान परिणामों को आगे बढ़ाने के लिए एक अत्याधुनिक अनुसंधान विधि के रूप में नियोजित किया जा सकता है जिसे मानव-प्रासंगिक जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने, अनुसंधान में पशु मॉडल के उपयोग को कम करने और रोगी-केंद्रित अनुसंधान को बढ़ाने के लिए एक्सट्रपलेशन किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एनजेसी को सिग्नेचर डिस्कवरी लिमिटेड (बीबी / एम 01116 एक्स / 1, 1940003) के साथ बीबीएसआरसी एमआईबीटीपी केस अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 ECACC  #86012804 Lung carcinoma cell line
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 Agilent Technologies Inc. 103576-100 XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer Agilent Technologies Inc. - Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids
Antimycin A Merck Life Science A8674 Mitochondrial respiratory complex III inhibitor
BAM15 TOCRIS bio-techne 5737 Mitochondrial protnophore uncoupler
Black-walled microplate Greiner Bio-One 655076 For fluorescence-based assays
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates Greiner Bio-One 650970 Microplates for generating spheroids
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681 Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids
Cultrex Poly-D-Lysine R&D Systems a biotechne brand 3439-100-01 Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids
D-(+)-Glucose Merck Life Sciences G8270 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885084 Culture medium for HepG2/C3A spheroids
EVOS XL Core Imaging System Thermo Fisher Scientific AMEX1000 Phase-contrast imaging microscope
EZ-PCR Mycoplasma test kit Biological Industries 20-700-20 Mycoplasma screening in cell cultures
FIJI Is Just Image J Analysis of collated images
Foetal bovine serum Merck Life Science F7524 Supplement for cell culture medium
HepG2/C3A ATCC  #CRL-10741 Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line
Lactate-Glo Promega J5021 Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium
L-glutamine (200 mM solution) Merk Life Sciences G7513 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
M50 Stereo microscope Leica Microsytems LEICAM50 Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling
MCF-7 ECACC #86012803 Breast adenocarcinoma cell line
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes Merck Life Science O4876 ATP Synthase Inhibitor
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140122 Antibiotics added to cell culture medium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Initrogen P7589 Analysis of dsDNA in spehroids
Rotenone Merck Life Science R8875 Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor
RPMI 1640 Gibco 21875091 Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids
Seahorse Analytics Agilent Technologies Inc. Build 421 https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak Agilent Technologies Inc. 102905-100 Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL Greiner Bio-One 606107; 607107; 760107 Consumables for cell culture
SK-OV-3 ECACC  #HTB-77 Ovarian adenocarcinoma cell line
Sodium pyruvate (100 mM solution) Merck Life Science S8636 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
T75 cm2 cell culture flask Greiner Bio-One 658175 Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures
TrypLExpress Gibco 12604-021 Cell dissociation reagent
Wave controller software Agilent Technologies Inc. -
Wide orifice tip STARLAB International GmbH E1011-8400 Pipette tips with wide opening for spheroid handling

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कैंसर अनुसंधान अंक 180

Erratum

Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 03/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.

Figure 5 was updated from:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 5
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

बाह्य प्रवाह विश्लेषण का उपयोग करके एकल 3 डी माइक्रोटिशू स्फेरॉइड के माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय की खोज करना
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Coltman, N. J., Rochford, G.,… More

Coltman, N. J., Rochford, G., Hodges, N. J., Ali-Boucetta, H., Barlow, J. P. Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (180), e63346, doi:10.3791/63346 (2022).

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