这些实验方案将帮助研究人员利用Seahorse细胞外通量分析技术，探究三维培养的癌细胞系来源类球体中的线粒体能量代谢。
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摘要
摘要
三维（3D）细胞聚集体，称为球状体，已成为 体外 近年来，细胞培养技术不断发展。与将细胞培养为二维单层细胞（2D培养）不同，球形细胞培养能够促进、调控并支持细胞生理结构和特性的形成 体内包括细胞外基质蛋白的表达、细胞信号传导、基因表达、蛋白质合成、分化和增殖。三维培养的重要性已在多个研究领域得到认可，包括肿瘤学、糖尿病、干细胞生物学和组织工程。在过去十年中，已开发出改进的方法用于生成类球体并评估其代谢功能和命运。
已使用XF24胰岛捕获板或XFe96类球体微孔板，通过细胞外通量（XF）分析仪研究三维微组织（如类球体）中的线粒体功能。然而，利用XF技术探测类球体中线粒体能量代谢的具体实验方案及优化方法尚未被详细描述。本文提供了使用XFe96 XF分析仪和类球体微孔板对单个三维类球体进行线粒体能量代谢检测的详细实验方案。通过使用不同癌细胞系，证明了XF技术能够区分不同大小、体积、细胞数量、 DNA含量和类型的三维类球体中的细胞呼吸。
使用寡霉素、BAM15、鱼藤酮和抗霉素A等线粒体效应化合物的最佳浓度，检测三维球状体中线粒体能量代谢的特定参数。本文还讨论了对球状体获得数据进行归一化处理的方法，并阐述了利用XF技术研究球状体代谢时需考虑的诸多因素。本方案将有助于推动先进模型中的相关研究 体外 球状体模型
引言
过去20年中，生物研究领域的体外（in vitro）模型技术迅速发展。如今，这类模型包括器官芯片、类器官以及三维微组织球体，这些已成为提升体外（in vitro）与体内（in vivo）研究之间转化效率的共同研究重点。先进体外（in vitro）模型的应用，特别是球体模型，已广泛覆盖多个研究领域，包括组织工程、干细胞研究、癌症与疾病生物学1,2,3,4,5,6,7，以及安全性测试，如遗传毒理学8,9,10、纳米材料毒理学11,12,13
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方案
图1：细胞球体生成、细胞外通量分析及下游实验的图示化工作流程。 四种癌细胞系被选择性地以单层形式培养（A)，从培养瓶中分离后接种至超低吸附96孔微孔板中，以形成球状体（B). 将 A549 肺癌细胞、HepG2/C3A 肝癌细胞、SK-OV-3 卵巢腺癌细胞和 MCF-7 乳腺癌细胞以 1 × 103-8 × 103 细胞/孔，并培养至7天以形成单个球体，通过连续观察和平面测量法优化球体接种密度和培养时间。形成球体后，将其用无血清XF培养基洗涤，并小心接种至预先包被多聚-D-赖氨酸的球体检测微孔板中，C）。采用XFe96分析仪对类球体进行胞外通量分析，使用多种实验方案分别考察以下内容：（1）类球体最佳尺寸以获得基础线粒体呼吸反应；（2）线粒体呼吸抑制剂的....
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结果
为获得形态良好且致密的球状体，每种细胞系均针对接种密度和培养时间进行了单独优化（图3。A549、HepG2/C3A和SK-OV-3细胞系最初形成松散的聚集体，在培养7天后才逐渐发育为具有清晰边界的圆形类球体。相比之下，MCF-7细胞在3天内即可形成类球体。所有类球体模型在培养结束后，其类球体体积与初始接种细胞密度之间均表现出明显相关性。类球体的大小和形态随接种密度的优化而得到调控。在所有模型中，随着类球体尺寸增大，其形态完整性和圆度开始下降。各细胞系的接种策略在4 × 103 细胞/孔，用于A549和SK-OV-3细胞；HepG2/C3A细胞的接种密度已在其他研究中优化为1 × 103 细胞/孔，MCF-7 细胞以 4 × 103 所有实验中每孔细胞数/孔。在优化的接种策略下，球状体体积介于 5.46 × 107 µm3 (SK-OV-3) 和 1.45 × 108 µm3 (A549) (图3B
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讨论
主要发现与成果
本文提供了一项详细的实验方案 利用XFe96 XF分析仪，结合一系列癌源性细胞系，检测单个三维球状体的线粒体能量代谢。本文建立并描述了一种快速培养A549、HepG2/C3A、MCF7和SK-OV-3细胞球状体的方法，该方法采用抗细胞黏附技术实现细胞强制聚集。本方案针对使用XF技术检测球状体代谢过程中的多个关键问题进行了探讨，包括：（1）优化球状体培养流程，以及将球状体从原始培养容器转移至技术供应商提供的专用球状体检测微孔板时的操作与处理；（2）呼吸作用相关化合物的使用浓度及其渗透的时间依赖性；（3）加样注射策略的选择；（4）实验组间数据标准化的方法。本文对上述各项因素均进行了系统研究，并在下文予以详细讨论。所提出的方法旨在以XFe96通量分析仪为基础，利用单个三维球状体获得稳定可靠的代谢氧通量数据。该实验策略可作为通用框架和起点，适用于基础实验室条件下其他球状体模型的建立与应用。
注意事项
类球体生长、大小及XF技术的敏感性
为了使用.......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
N.J.C 获得了英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）MIBTP 企业合作奖（BB/M01116X/1，1940003）以及 Sygnature Discovery 有限公司的支持
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A549 | ECACC | #86012804 | 肺癌细胞系 |
| Agilent Seahorse XF RPMI 培养基，pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | 含 1 mM HEPES 的 XF 检测培养基，不含酚红、碳酸氢钠、葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠 |
| Agilent Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪 | Agilent Technologies Inc. | - | 用于单个类球体中氧消耗速率测量的仪器 |
| 抗霉素 A | Merck Life Science | A8674 | 线粒体呼吸链复合体 III 抑制剂 |
| BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | 线粒体质子载体解偶联剂 |
| 黑色壁微孔板 | Greiner Bio-One | 655076 | 用于基于荧光的检测 |
| CELLSTAR 防粘附表面 96 孔 U 型微孔板 | Greiner Bio-One | 650970 | 用于生成类球体的微孔板 |
| CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒 | Promega | G9681 | 用于测定 3D 微组织类球体细胞活力的检测试剂盒 |
| Cultrex 聚-D-赖氨酸 | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | 用于包被 XFe96 类球体微孔板以促进类球体附着的分子细胞粘附剂 |
| D-(+)-葡萄糖 | Merck Life Sciences | G8270 | 细胞培养生长及 XF 检测培养基的补充剂 |
| Dulbecco’s 改良伊格尔培养基 (DMEM) | Gibco | 11885084 | HepG2/C3A 类球体的培养基 |
| EVOS XL Core 成像系统 | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | 相差成像显微镜 |
| EZ-PCR 支原体检测试剂盒 | Biological Industries | 20-700-20 | 细胞培养物中的支原体筛查 |
| FIJI 即 Image J | 合并图像的分析 | ||
| 胎牛血清 | Merck Life Science | F7524 | 细胞培养基补充剂 |
| HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | 肝癌细胞系，源自亲代 HepG2 细胞系的克隆衍生物 |
| Lactate-Glo | Promega | J5021 | 用于测定类球体培养基中乳酸含量的检测试剂盒 |
| L-谷氨酰胺（200 mM 溶液） | Merk Life Sciences | G7513 | 细胞培养生长及 XF 检测培养基的补充剂 |
| M50 体视显微镜 | Leica Microsytems | LEICAM50 | 体视解剖显微镜；用于类球体操作 |
| MCF-7 | ECACC | #86012803 | 乳腺腺癌细胞系 |
| 来自Streptomyces diastatochromogenes的鱼藤酮 | Merck Life Science | O4876 | ATP 合酶抑制剂 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | 添加至细胞培养基中的抗生素 |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒 | Initrogen | P7589 | 类球体中双链 DNA 的分析 |
| 鱼藤酮 | Merck Life Science | R8875 | 线粒体呼吸链复合体 I 抑制剂 |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | A549、MCF7 和 SK-OV-3 类球体的培养基 |
| Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
| Seahorse XFe96 类球体 FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | 每个 Seahorse XFe96 类球体 FluxPak 包含：6 个 Seahorse XFe96 类球体微孔板（102978-100）、6 个 XFe96 传感器盒和 1 瓶 500 mL Seahorse XF 校准液（100840-000） |
| 移液管：5、10 和 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | 细胞培养耗材 |
| SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | 卵巢腺癌细胞系 |
| 丙酮酸钠（100 mM 溶液） | Merck Life Science | S8636 | 细胞培养生长及 XF 检测培养基的补充剂 |
| T75 cm2 细胞培养瓶 | Greiner Bio-One | 658175 | 用于维持细胞培养的组织培养处理瓶 |
| TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | 细胞解离试剂 |
| Wave 控制器软件 | Agilent Technologies Inc. | - | |
| 宽口移液枪头 | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | 具有宽开口的移液枪头，用于类球体操作 |
参考文献
- Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).
- Amann, A., et al.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 3/11/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.
