Summary
I detta protokoll rekonstrueras och analyseras bukspottkörtelöarna med hjälp av beräkningsalgoritmer implementerade i en dedikerad multiplatformapplikation.
Abstract
Strukturella egenskaper hos bukspottkörtelöar är nyckeln till det funktionella svaret hos insulin-, glukagon- och somatostatinutsöndrande celler på grund av deras konsekvenser i intraisletkommunikation via elektrisk, parakrin och autokrin signalering. I detta protokoll rekonstrueras den tredimensionella arkitekturen hos en bukspottkörtelö först från experimentella data med hjälp av en ny beräkningsalgoritm. Därefter erhålls de morfologiska och anslutningsegenskaper hos den rekonstruerade ön, såsom antalet och procentandelarna av den olika typen av celler, cellulär volym och cell-till-cell-kontakter. Sedan används nätverksteori för att beskriva öns anslutningsegenskaper genom nätverks härledda mätvärden som genomsnittlig grad, klustringskoefficient, densitet, diameter och effektivitet. Slutligen utvärderas alla dessa egenskaper funktionellt genom beräkningssimuleringar med hjälp av en modell av kopplade oscillatorer. Sammantaget beskriver vi här ett steg-för-steg-arbetsflöde, implementerat i IsletLab, en multiplatformsapplikation utvecklad specifikt för studier och simulering av bukspottkörtelöar, för att tillämpa en ny beräkningsmetod för att karakterisera och analysera bukspottkörtelöar som ett komplement till det experimentella arbetet.
Introduction
Bukspottkörteln är uppdelad i regioner som kallas huvud, nacke, kropp och svans, var och en med olika strukturer, funktioner och anatomisk position 1,2. Ur funktionell synvinkel kan bukspottkörteln delas in i endokrina och exokrina system med den förra ansvarig för utsöndringen av hormoner som är kritiskt involverade i regleringen av glukoshomeostas, medan den senare bidrar till matsmältning via utsöndring av enzymer i tolvfingertarmen1. Pankreatiska öar utgör den endokrina vävnaden i bukspottkörteln och är ansvariga för utsöndringen av glukagon, insulin och somatostatin, utsöndrat från ɑ, β respektive δ-celler3. Förutom deras inneboende regleringsmekanismer regleras dessa celler via direkt elektrisk kommunikation (mellan β-celler och sannolikt β och δ-celler), och även av parakrin och autokrin signalering 4,5,6. Båda mekanismerna är starkt beroende av öarkitekturen (dvs. sammansättningen och organisationen av de olika typerna av celler inom holmen)7,8. Viktigt är att öarkitekturen förändras i närvaro av diabetes, vilket troligen stör intraisletkommunikationen som ett resultat 9,10.
Studien av bukspottkörtelöar involverar ett brett spektrum av experimentella metoder. Bland dessa har användningen av fluorescenstekniker för att bestämma antalet, platsen och typen av de olika cellerna i holmen gjort det möjligt att studera de strukturella och morfologiska egenskaperna hos bukspottkörtelöar 11,12,13 och att få en bättre förståelse för de funktionella konsekvenserna för hälsa och sjukdom. Som ett komplement har beräkningsmodeller av bukspottkörtelceller 14,15,16 och på senare tid pankreaskär 12,17,18,19 använts under de senaste decennierna för att utvärdera aspekter som är svåra eller till och med omöjliga att ta itu med experimentellt.
I detta protokoll syftar vi till att överbrygga klyftan mellan det experimentella och beräkningsmässiga arbetet genom att beskriva en metod för att rekonstruera öarkitekturer, att analysera deras morfologiska och anslutningsegenskaper genom kvantitativa mätvärden och att utföra grundläggande simuleringar för att utvärdera de funktionella konsekvenserna av öegenskaperna.
Protokollet som beskrivs nedan är baserat på beräkningsalgoritmer speciellt utformade för studier av bukspottkörtelöar. Sammanfattningsvis, i det första steget i protokollet, rekonstrueras öarkitekturen från experimentella data med hjälp av algoritmen som nyligen föreslagits av Félix-Martínez et al.19 där kärnpositioner erhållna genom 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) färgning och cellulära typer identifierade genom immunofluorescens (som beskrivs i detalj av Hoang et al.11,12 ) bearbetas i en iterativ optimeringsprocedur. Detta leder till att bestämma den optimala storleken och positionen för varje cell och erhålla en ö som består av icke-överlappande celler. För det andra, baserat på den rekonstruerade arkitekturen, identifieras cell-till-cell-kontakter för att bestämma anslutningsegenskaperna och för att generera motsvarande önätverk som gör det möjligt för användaren att erhålla kvantitativa mätvärden för att ytterligare beskriva öarkitekturen (detaljer om rekonstruktionsalgoritmen kan konsulteras i det ursprungliga arbetet med ämnet19). Slutligen utförs grundläggande funktionella simuleringar med hjälp av modelleringsmetoden som föreslagits av Hoang et al.12 där, baserat på den pulserande naturen hos hormonsekretion observerad experimentellt20,21, varje cell behandlas som en oscillator, och därför representeras holmen som ett nätverk av kopplade oscillatorer som följer anslutningsegenskaperna hos den rekonstruerade holmen.
Med tanke på beräkningskomplexiteten hos algoritmerna som används i detta protokoll har alla inblandade steg implementerats i en fristående applikation22 med huvudmålet att närma sig dessa beräkningsverktyg till alla intresserade läsare oavsett deras erfarenhetsnivå för användning av specialiserad programvara eller programmeringsspråk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Ett schematiskt diagram över protokollet visas i figur 1. En steg-för-steg-beskrivning ges enligt följande (se Tilläggsfil 1 för detaljer om de kontrollpaneler som används vid varje steg i protokollet).
Bild 1: Flödesschema. Ett flödesdiagram som beskriver protokollets sekventiella ordning som implementerats i IsletLab. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Installera IsletLab i Linux
Följ instruktionerna i avsnitt 2 och 3 i tilläggsfilen 2 för att installera IsletLab i Windows eller macOS.
- Öppna en webbläsare och gå till https://github.com/gjfelix/IsletLab. Ladda ner och extrahera IsletLab-arkivfilerna.
Den kompletterande filen 3 innehåller en kopia av den version av IsletLab som används i detta protokoll. - Kontrollera att gcc- och nvcc-kompilatorerna är installerade. Öppna en terminal och skriv följande kommandon:
gcc --version
nvcc --version
Följ instruktionerna i avsnitt 1 i tilläggsfilen 2 om något av dessa kommandon inte känns igen av systemet. - Ladda ned och installera datavetenskapsplattformen (se materialtabellen). Öppna en terminal och gå till mappen IsletLab.
- Skapa en ny miljö genom att skriva följande kommando i terminalen:
conda env skapa -f isletlabgui_v1.0.yml - Aktivera den nya miljön genom att skriva:
conda aktivera isletlab_v1.0 - Starta IsletLab-programmet genom att skriva följande kommando i terminalen (se bild 2 för en beskrivning av huvudfönstret):
python isletlabgui_v1.0.py
Bild 2: Användargränssnittet för IsletLab. Gränssnittet består av tre huvudpaneler: konfigurationspaneler (1), statistik (2) och grafik (3). Grafikverktygsfältet (4) finns längst ner på grafikpanelen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Återuppbyggnad av öar
- Förbered indata. Organisera indata för öar (dvs. celltyper och 3D-koordinater med tre dimensioner) i en fil med fyra kolumner där kolumn 1 innehåller celltypen (kodad som 11: ɑ-cell, 12: β-cell, 13: δ-cell) och kolumnerna 2 till 4 innehåller x-, y- respektive z-koordinaterna (se ett utdrag av en indatafil i avsnitt 5 i tilläggsfilen 2 eller indatatestfilen som ingår i IsletLab-förvaret).
- Kontrollera att indatafilen inte innehåller kolumnrubriker. Använd exempelindatafilen som ingår i IsletLab-lagringsplatsen för att följa protokollet om det behövs (Input_Islet_test.txt).
OBS: Indata som användes för att utveckla algoritmerna som implementerades i IsletLab erhölls experimentellt enligt beskrivningen i detalj av Hoang et al.11,12 med dapi-färgning för att bestämma kärnpositionerna och immunofluorescensen för att identifiera de cellulära typerna. - Klicka på knappen Ladda initial ö och välj filen som innehåller indata för att generera en första ö, 3D-representationen och motsvarande statistik. I händelse av fel visas följande meddelande: 'Fel vid inläsning av ö-fil'. För att korrigera detta, upprepa steg 2.1.
- Konfigurera rekonstruktionsprocessen. Klicka på knappen Rekonstruktionsinställningar och ändra optimeringsparametrarna (se avsnitt 4 och 5 i Tilläggsfil 2 för en kort beskrivning av algoritmen och parametrarna som visas i fönstret för rekonstruktionsinställningar).
- Ställ in initialtemperaturen = 1, iterationsfaktorn = 1 och acceptansfaktorn = 1. Klicka på OK för att spara parametervärdena.
OBS: Som en tumregel kommer en ökning av temperaturparametern, liksom i iterationerna och acceptansfaktorerna, att ge bättre rekonstruktionsresultat när det gäller de experimentella cellerna som ingår i den rekonstruerade ön på bekostnad av en ökning av beräkningstiden. - Klicka på knappen Reconstruct Islet för att öppna fönstret för rekonstruktionsloggen (se avsnitt 6 i tilläggsfil 2 för en beskrivning av informationen i rekonstruktionsloggen).
- Klicka på knappen Kör för att starta rekonstruktionsprocessen. Övervaka optimeringsprocessen tills meddelandet: "Stäng det här fönstret för att fortsätta" visas. Stäng rekonstruktionsloggfönstret för att generera den visuella representationen av den rekonstruerade holmen och för att beräkna relaterad statistik (se den vänstra kolumnen i figur 3A-C).
- Utvärdera resultaten av rekonstruktionsprocessen genom att analysera optimeringsstatistiken som visas på den sista öfliken i statistikpanelen. Fokusera särskilt på att maximera andelen experimentella celler som ingår i de rekonstruerade öarna (% av experimentella) eller motsvarande, på att minimera antalet överlappningar (visas även grafiskt i konvergensdiagrammet, höger kolumn i figur 3A-C).
- Om % av experimentell statistik anses vara låg enligt användarmålen, starta om IsletLab enligt beskrivningen i steg 9.1 och öka initialtemperaturen, iterationsfaktorn och acceptansfaktorn i rekonstruktionsinställningarna och upprepa steg 2.1-2.4 tills tillfredsställande resultat erhålls (> 95% av experimentella celler). Se avsnitten 5–7 i tilläggsfilen 2 för ytterligare beskrivning av rekonstruktionsprocessen och de relaterade resultaten.
3. Identifiera cell-till-cell-kontakter
- Klicka på knappen Rekonstruktionsinställningar och ställ in parametern Kontakttolerans för att definiera toleransen cell-till-cell-kontakt och klicka på OK för att spara parametervärdena.
OBS: Kontakttoleransparametern representerar det maximala avståndet mellan celler för att betraktas som i kontakt. - Klicka på knappen Cell-till-cell-kontakter för att identifiera cellerna i nära kontakt. På fliken Kontakter söker du efter celler i kontakt som visas grafiskt (svarta linjer) i grafikpanelen och motsvarande statistik (dvs. totalt, homotypiska och heterotypiska kontakter och ɑ-ɑ, β-β, δ-δ, ɑ-β, ɑ-δ, β-δ kontakter) som visas i statistikpanelen (se den vänstra kolumnen i figur 4A-C).
- Öka (minska) kontakttoleransparametern för att öka (minska) antalet cell-till-cell-kontakter. Se avsnitt 8 i tilläggsfil 2 för detaljer om identifiering av cell-till-cell-kontakter och tillhörande resultat.
4. Bygga ö-nätverket
- Klicka på knappen Skapa nätverk för att generera ö-nätverket och beräkna tillhörande nätverksmått (se den högra kolumnen i figur 4A-C).
OBS: En ytterligare beskrivning av resultaten relaterade till det genererade önätet ges i avsnitt 9 i tilläggsfil 2.
5. Funktionell simulering av den rekonstruerade holmen
- Växla till fliken Simulering på konfigurationspanelen i gränssnittet (bild 5).
- Välj önskat läge för inneboende frekvens - konstant eller slumpmässig - och klicka på knappen Konfigurera inneboende frekvens för att definiera oscillatorernas frekvens (i Hz). Om en slumpmässig inneboende frekvens väljs, definiera medelvärdet och avvikelsen (i Hz) för att generera normalt fördelade slumpmässiga frekvenser (se avsnitt 11 i tilläggsfilen 2 för en beskrivning av simuleringsparametrarna).
- Välj önskat läge för den inledande fasen - Konstant eller Slumpmässig. Om en konstant inledande fas är vald klickar du på knappen Konfigurera inledande fas för att definiera oscillatorernas fas (i radianer). Om slumpmässig initial fas väljs kommer systemet att tilldela slumpmässiga faser mellan 0 och 2π till alla oscillatorer.
OBS: Om en konstant initial fas väljs kommer alla oscillatorer att initieras i fas. - Klicka på knappen Konfigurera interaktioner för att definiera interaktionsparametrarna från cell till cell i fönstret för interaktionsstyrka. En beskrivning av interaktionsparametrarna finns i avsnitt 11 i tilläggsfil 2.
- Konfigurera simuleringen genom att definiera den totala simuleringstiden (i s), tidssteget (i s) och sparfaktorn (antal steg mellan sparade datapunkter). I simuleringen som visas i figur 5 var den totala tiden 20000 s, med ett tidssteg på 0,1 s och en sparfaktor på 500.
- Definiera antalet block, trådar och datorplattformskapacitet som är tillgängliga för att utföra simuleringen. Definiera dessa parametrar i enlighet med de specifika egenskaperna hos den tillgängliga grafikbehandlingsenheten (GPU).
I exemplet som visas i figur 5 användes 36 block och 64 trådar per block (2304 datorplattformskärnor) eftersom en GPU med 36 multiprocessorer och 64 datorplattformskärnor per multiprocessorer användes. Värdet på den använda kapacitetsparametern för datorplattformen var 75 eftersom maskinvaruberäkningsplattformens kapacitet var 7,5 (se avsnitt 10 i tilläggsfil 2 för mer information om dessa parametrar). - Klicka på knappen Kör simulering för att öppna simuleringsloggfönstret. Klicka på knappen Kör för att starta simuleringen och övervaka processen tills förklaringen: "Stäng fönstret för att fortsätta" visas. Se avsnitt 12 i tilläggsfil 2 för mer information om simuleringsloggen.
- Stäng simuleringsloggfönstret för att observera simuleringsresultaten (se bild 5). Detaljer om simuleringsresultaten ges i avsnitt 13 i tilläggsfil 2.
6. Spara projektet (valfritt)
- Klicka på Arkiv > Exportera projekt i menyraden. Välj katalogen där projektfilen ska sparas och klicka på OK-knappen .
Namnet på projektfilen bestäms automatiskt baserat på namnet på den ursprungliga datafilen. Om projektet inte sparas raderas alla resultat och relaterade filer automatiskt. - Läsa in ett exporterat projekt genom att klicka på Arkiv > Läs in projekt.
7. Spara siffror (valfritt)
- Klicka på ikonen Spara ritning i verktygsfältet rita för att spara den aktuella visualiseringen i en bildfil. Upprepa detta steg för alla siffror som skapats i hela protokollet.
Visualiseringar av tomter och öar kan ändras med hjälp av ikonerna i verktygsfältet rita på grafikpanelen.
8. Ladda projekt (valfritt)
- Klicka på Arkiv > Läs in projekt på huvudmenyn och välj en projektfil som sparats tidigare enligt beskrivningen i steg 6.1-6.2.
Ett projekt läses inte in korrekt om projektfilen har ändrats externt. Om ett projekt läses in är endast simuleringsfunktionerna tillgängliga.
9. Starta om rekonstruktionsprocessen och analysen (valfritt)
- Användaren kan när som helst välja Fil > Starta om för att ignorera alla resultat och starta en ny rekonstruktion och analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rekonstruktionen av bukspottkörtelöar med hjälp av den metod som föreslagits av Félix-Martínez et al.19 är starkt beroende av parametrarna som ges till optimeringsalgoritmen (definierad i rekonstruktionsinställningarna). Ett exempel på detta visas visuellt i figur 3 där rekonstruerade öar erhållna med olika uppsättningar parametrar visas. Först, i figur 3A, visas en rekonstruktion som inkluderade 86,6% av cellerna som ingår i de ursprungliga uppgifterna (509 av 588 celler, initial temperatur = 1, iterationsfaktor = 1, acceptansfaktor = 1). När den initiala temperaturen och iterations- och acceptansfaktorerna ökas (initial temperatur = 10, iterationsfaktor = 5 och acceptansfaktor = 5, figur 3B), inkluderades en högre procentandel (93,37%) av initiala celler i de rekonstruerade öarna (dvs 549 av 588 celler). Ännu bättre resultat kan erhållas om mycket högre värden används, särskilt för iterations- och acceptansfaktorerna, vilket illustreras i figur 3C (initial temperatur = 10, iterationsfaktor = 1000, acceptansfaktor = 500), där den rekonstruerade holmen består av 99,15% av de ursprungliga cellerna (583 av 588 celler). Konvergensdiagrammen (höger kolumn i figur 3A-C), som visar utvecklingen av överlappande celler som en funktion av temperaturen, måste utvärderas för att bestämma hur parametrarna påverkar optimeringsprocessen. Som en tumregel måste interaktions- och acceptansfaktorerna ökas när den rekonstruerade holmen innehåller en låg andel initiala celler. Följaktligen kommer beräkningstiden oundvikligen att öka, eftersom dessa faktorer direkt ökar antalet utvärderade iterationer. Till exempel var beräkningstiden för den första rekonstruktionen som beskrivs ovan 6 s. Däremot var beräkningstiderna för den andra och tredje rekonstruktionen 21 s respektive 24 min 6 s.
Figur 3: Ö-rekonstruktion med suboptimala uppsättningar parametrar i rekonstruktionsinställningarna Att använda suboptimala uppsättningar parametrar kan leda till en låg andel experimentella celler i de rekonstruerade öarna. (A) Vänster: 86,6% av experimentella celler inkluderades i den rekonstruerade holmen (initial temperatur = 1, iterationsfaktor = 1, acceptansfaktor = 1, beräkningstid = 6 s). Till höger: konvergensplott för återuppbyggnadsprocessen. (B) Vänster: 93,4% av experimentella celler inkluderades i den rekonstruerade holmen (initial temperatur = 10, iterationsfaktor = 10, acceptansfaktor = 5, beräkningstid = 21 s). Till höger: konvergensplott för återuppbyggnadsprocessen. (C) Vänster: 99,15% av experimentella celler inkluderades i den rekonstruerade holmen (initial temperatur = 10, iterationsfaktor = 1000, acceptansfaktor = 500, beräkningstid = 24 min, 8 s). Till höger: konvergensplott för återuppbyggnadsprocessen. Pilarna i konvergensdiagrammen indikerar det initiala och slutliga antalet överlappade celler i rekonstruktionsprocessen (före rekonstruktionsalgoritmens efterbehandlingsfas). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Identifiering av cell-till-cell-kontakter från den rekonstruerade holmen beror på värdet på kontakttoleransparametern (definierad i rekonstruktionsinställningarna) som illustreras i figur 4A-C, där cell-till-cell-kontakterna (representerade av svarta linjer), identifierade från de rekonstruerade arkitekturerna som visas i figur 3A-C, presenteras. Till exempel, om en kontakttolerans på 1 μm definieras, som i figur 4A, identifieras endast 290 cell-till-cell-kontakter. Om kontakttoleransen däremot ökas till 2 μm, som i figur 4B,C, ökade de totala identifierade kontakterna till 636 respektive 731 (se statistikpanelen i figur 4A-C). Dessa skillnader kan också märkas i den visuella representationen av cell-till-cell-kontakterna som visas i den vänstra kolumnen i figur 4A-C, eftersom antalet kontakter mellan celler tydligt ökar när ett högre värde på kontakttoleransen används. Det är värt att lyfta fram att antalet kontakter också beror på antalet celler som ingår i de rekonstruerade öarna, och därför bestämmer kombinationen av temperaturparametern, iterationer och acceptansfaktorer och kontakttolerans i slutändan anslutningen till den rekonstruerade holmen, vilket återspeglas på de önätverk som bildas och motsvarande nätverksmått, som visas i den högra kolumnen i figur 4A-C. Nätverksdiagrammet tillåter användaren att visualisera hur de olika cellerna är anslutna. Kvantitativt beskrivs öns anslutningsegenskaper i termer av följande nätverksmått: genomsnittlig grad, densitet, genomsnittlig klustringskoefficient, effektivitet och diameter (detaljer om dessa mätvärden kan konsulteras i avsnitt 9 i tilläggsfilen 2).
Figur 4: Effekt av kontakttoleransparametern vid identifiering av cell-till-cell-kontakter. Värden som användes för kontakttoleransparametern var 1 μm (A) och 2 μm (B och C). Observera att antalet celler som ingår i de rekonstruerade öarna också påverkar antalet identifierade cell-till-cell-kontakter. Höger: nätverk som genereras från cell-till-cell-kontakterna visas i motsvarande vänstra kolumn. Observera att anslutningens inverkan på nätverksmåtten markeras i statistikpanelen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Slutligen, när holmen har rekonstruerats och cell-till-cell-kontakterna har identifierats, kan en funktionell simulering utföras (endast när en kompatibel GPU är tillgänglig). Typiska simuleringsresultat visas i figur 5, inklusive de summerade svängningarna av de olika cellpopulationerna (ɑ, β och δ-celler) och hela holmen (övre diagrammet på grafikpanelen i figur 5). Denna figur visar fasskillnaderna över tid mellan de olika cellpopulationerna som ett resultat av anslutnings- och interaktionsegenskaperna och gör det möjligt för användaren att bestämma bidraget från varje cellpopulation (röda, gröna och blå linjer) till det oscillerande beteendet hos hela ön (svart linje). Till exempel föreslår den övre panelen i figur 5 att ɑ och β-celler på befolkningsnivå svänger helt ur fas, medan δ-celler svänger ur fas med ɑ och β-celler. Dessutom, enligt simuleringen, domineras det oscillerande beteendet hos ön av oscillationerna hos ɑ-cellerna, även om effekten av de andra cellpopulationerna också kan märkas. Observera att oscillerande signaler från alla öceller sparas automatiskt i en datafil (se tabell 1 och avsnitt 13 i tilläggsfil 2), vilket gör det möjligt för användaren att utföra en detaljerad analys av simuleringsresultaten. Som ett komplement beräknas och visas också ösynkroniseringsindexet, som återspeglar faskoherensen hos svängningarna, (nedre diagrammet på grafikpanelen i figur 5). Observera att synkroniseringsindexet sträcker sig från 0 till 1, där 0 och 1 anger en null respektive total synkronisering mellan alla celler i ön. Synkroniseringsindexdiagrammet kan därför tolkas som en visualisering av hur synkroniciteten mellan öceller varierar över tid som ett resultat av anslutnings- och interaktionsegenskaperna hos den rekonstruerade holmen. Eftersom den utförda simuleringen är baserad på idén om kopplade oscillatorer12 och starkt beror på anslutningen till den rekonstruerade holmen, är det viktigt att nå en acceptabel ö-rekonstruktion och cell-till-cell-anslutning innan du utför en funktionell simulering.
Bild 5: Simuleringsparametrarna definieras i konfigurationspanelen på fliken Simulering. Resultaten av simuleringen visas på simuleringsfliken i grafikpanelen där det summerade oscillerande beteendet hos de olika populationerna av celler (ɑ, β och δ) och hela holmen visas (överst). Synkroniseringsindexet, ett mått på faskoherens mellan öcellerna, visas också (längst ner). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det är värt att nämna att praktiskt taget vid varje steg i processen genereras datafiler. En beskrivning av de datafiler som genereras finns i tabell 1 och i hela tilläggsfilen 2.
| Fil | Beskrivning |
| IsletFileName | Indata (ges av användaren) |
| IsletFileName_initial.txt | Initial ö-arkitektur som föreslagits av algoritmen för att som ett första steg i rekonstruktionen |
| IsletFileName_reconstructed.txt | Rekonstruerad holme (ej posptrocessed) |
| IsletFileName_postprocessed_islet.txt | Slutlig rekonstruerad holme och postrocessed holme |
| IsletFileName_processlog.txt | Rekonstruktionslogg (optimeringsalgoritm) |
| IsletFileName_overlapped_cells.txt | Överlappade celler i slutet av rekonstruktionsprocessen (efterbehandling) |
| IsletFileName_all_contacts.txt | Adjancency matris för alla kontakter |
| IsletFileName_aa_contacts.txt | Adjancency matris av ɑ-ɑ kontakter |
| IsletFileName_ab_contacts.txt | Adjancency-matris av ɑ-β-kontakter |
| IsletFileName_ad_contacts.txt | Adjancency-matris av ɑ-δ-kontakter |
| IsletFileName_bbbd_contacts.txt | Angränsande matris för β-β och β-δ kontakter |
| IsletFileName_bb_contacts.txt | Angränsande matris för β-β kontakter |
| IsletFileName_bd_contacts.txt | Adjancency-matris för β-δ kontakter |
| IsletFileName_dd_contacts.txt | Adjancency-matris för δ-δ kontakter |
| IsletFileName_Kmat.txt | Interaktionsmatris som används i simuleringen |
| IsletFileName_kuramoto_angles.txt | Resultat av Kuramoto-simuleringen |
Tabell 1: Beskrivning av filer som sparats som en del av projektfilen. Observera att filnamnet som används för att spara projektfilerna automatiskt definieras av den ursprungliga datafilen som valts av användaren.
Kompletterande fil 1: Grafisk beskrivning av protokollet med hjälp av kontrollpanelerna i IsletLab. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: IsletLab-dokumentation. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Innehåller alla filer som behövs för att installera IsletLab. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovanstående protokoll beskriver ett praktiskt tillvägagångssätt för att rekonstruera och analysera pankreatiska öarkitekturer med hjälp av nya beräkningsalgoritmer. Huvudsyftet med detta arbete är att göra det möjligt för öforskningsgemenskapen att härleda kvantitativa mätvärden för att karakterisera de morfologiska och konnektiva egenskaperna hos pankreatiska öarkitekturer och att utvärdera de möjliga funktionella konsekvenserna av sådana egenskaper via beräkningssimuleringar.
Medan algoritmerna som antagits i detta protokoll tidigare har beskrivits i detalj12,19, saknades en direkt och användarvänlig implementering på grund av deras relativa komplexitet, vilket begränsade deras användning som ett kompletterande verktyg till det experimentella och teoretiska arbetet.
För det första används en ny algoritm som föreslagits av Félix-Martínez et al.19 för att rekonstruera öarkitekturerna från experimentella data (t.ex. kärnkoordinater och celltyp). Som ett resultat erhåller användaren en öarkitektur bestående av icke-överlappande sfäriska celler med radier som automatiskt tilldelas i enlighet med de rapporterade experimentella fördelningarna. I praktiken är rekonstruktionsalgoritmen ett iterativt optimeringsförfarande som blir dyrt ur beräkningssynpunkt när antalet celler i holmen ökar. Av denna anledning rekommenderas det starkt att använda ett multiprocessorsystem för att dra nytta av den parallella bearbetningsimplementeringen av algoritmen som beskrivs i detta protokoll. Som beskrivits ovan är ett viktigt steg för rekonstruktionsprocessen att definiera lämpliga värden för de involverade parametrarna (dvs. iterationer, acceptansfaktorer och initial temperatur), eftersom beräkningstiden kommer att vara direkt relaterad till antalet utförda iterationer, förutom antalet parallella processer som används (dvs trådparameter i rekonstruktionsinställningarna). Om beräkningstid inte är ett problem rekommenderar vi starkt att du använder högsta möjliga värden för iterationer och acceptansfaktorer för att öka antalet iterationer som utförs.
Nästa steg i protokollet är identifiering av cell-till-cell-kontakter och generering av ö-nätverket. Båda stegen är direkt relaterade till rekonstruktionsprocessen och som sådan är antalet celler som ingår i de rekonstruerade öarna (och därmed de involverade parametrarna), liksom värdet på den använda kontakttoleransen, nyckeln till att uppnå bästa möjliga resultat.
Slutligen, om användaren så önskar, kan funktionella simuleringar utföras genom implementering av modellen av kopplade oscillatorer som föreslagits av Hoang et al.12 med hjälp av anslutningsnätverket som härrör från rekonstruktionsprocessen för att konfigurera det oscillerande systemet. Med tanke på att simuleringsprocessen innebär att man löser ett system med hundratals eller tusentals kopplade differentialekvationer (en för varje cell i holmen) har simuleringsalgoritmen implementerats genom att utnyttja möjligheten att utföra parallella beräkningar med hjälp av GPU, vilket gör det möjligt för användaren att simulera betydande långa simuleringar på relativt kort beräkningstid. Viktiga steg i simuleringssteget i protokollet är att bestämma lämpligt antal block och trådar som finns tillgängliga i avsnittet om datorplattformsinställningar på simuleringspanelen, en aspekt som är direkt relaterad till egenskaperna hos den använda hårdvaran. De andra parametrarna som är inblandade (inneboende frekvens, inledande fas och interaktionsstyrkor i simuleringspanelen), även om de är relevanta för simuleringsresultaten, är huvudsakligen relaterade till det problem som undersöks och måste definieras av användaren efter eftertänksamt övervägande för att representera det önskade simuleringsscenariot.
Trots de fördelar som protokollet erbjuder måste vissa begränsningar erkännas. För det första är parametrarna relaterade till rekonstruktionsprocessen och identifieringen av cell-till-cell-kontakterna inte unika och kan variera från fall till fall. Av denna anledning, även om en tumregel kan användas för att bestämma värdet på de nödvändiga parametrarna, är en trial-and-error-metod fortfarande oundviklig. En annan aspekt som kan begränsa protokollets tillämplighet är de beräkningsresurser som behövs, särskilt för protokollets rekonstruktions- och simuleringsstadier. Trots dessa begränsningar tillåter det faktum att programmeringskunskap inte behövs för genomförandet av protokollet forskare från olika bakgrunder att lätt använda de föreslagna algoritmerna som annars skulle förbli dunkla för den icke-specialiserade användaren.
Potentiella användningsområden för det föreslagna protokollet inkluderar visualisering av experimentella data, jämförande analys av normala och förändrade öar (t.ex. i närvaro av typ 1 eller 2-diabetes), eller till och med jämförelse mellan öar från olika arter med hjälp av kvantitativa morfologiska, strukturella och nätverksbaserade mätvärden23. Dessutom kan rekonstruerade öar med hjälp av protokollet som beskrivs här lätt användas för att generera detaljerade funktionella matematiska modeller där anslutningen och cellstorlekarna som bestäms av rekonstruktionsalgoritmen kompletteras med detaljerade elektrofysiologiska modeller av bukspottkörtelceller för att belysa de funktionella konsekvenserna av den intercellulära kommunikationen inom rekonstruerade öar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
G.J. Félix-Martínez tackar CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) och institutionen för elektroteknik vid Universidad Autónoma Metropolitana (México City) för stödet till detta projekt. Vi tackar Dr. Danh-Tai Hoang, Dr. Manami Hara och Dr. Junghyo Jo för deras enastående arbete och generositet när det gäller att dela öarkitekturerna som gjorde detta arbete möjligt med forskarsamhället.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUDA-capable NVIDIA graphics card | Required for the functional simulations | ||
| IsletLab | https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.) |
References
- Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells. ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).
- Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas. The Pancreas. Beger, H. G., Warshaw, A. L., Hruban, R. H., Buchler, M. W., Lerch, M. M., Neoptolemos, J. P., Shimosegawa, T., Whitcomb, D. C., GroB, C. , Wiley Online Library. (2018).
- Liao, E. P., Brass, B., Abelev, Z., Poretsky, L. Endocrine Pancreas. Principles of Diabetes Mellitus. Poretsky, L. , Springer. Cham. (2017).
- Noguchi, G. M., Huising, M. O. Integrating the inputs that shape pancreatic islet hormone release. Nature Metabolism. 1, 1189-1201 (2019).
- Pérez-Armendariz, E. M. Connexin 36, a key element in pancreatic beta cell function. Neuropharmacology. 75, 557-566 (2013).
- Briant, L., et al. δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin. The Journal of Physiology. 596 (2), 197-215 (2018).
- Arrojoe Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Folli, F., et al. Pancreatic islet of Langerhans' cytoarchitecture and ultrastructure in normal glucose tolerance and in type 2 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 20, Suppl 2 137-144 (2018).
- Kilimnik, G., et al. Altered islet composition and disproportionate loss of large islets in patients with type 2 diabetes. PloS One. 6 (11), 27445 (2011).
- Hoang, D. T., et al. A Conserved Rule for Pancreatic Islet Organization. PloS One. 9 (10), 110384 (2014).
- Hoang, D. T., Hara, M., Jo, J. Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses. PloS One. 11 (4), 0152446 (2016).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Félix-Martinez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Mathematical models of electrical activity of the pancreatic β-cell: a physiological review. Islets. 6 (3), 949195 (2014).
- Félix-Martínez, G. J., González-Vélez, V., Godínez-Fernández, J. R., Gil, A. Electrophysiological models of the human pancreatic δ-cell: From single channels to the firing of action potentials. International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering. 36 (2), 3296 (2020).
- Watts, M., Sherman, A. Modeling the pancreatic α-cell: dual mechanisms of glucose suppression of glucagon secretion. Biophysical Journal. 106 (3), 741-751 (2014).
- Lei, C. L., et al. Beta-cell hubs maintain Ca2+ oscillations in human and mouse islet simulations. Islets. 10 (4), 151-167 (2018).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).
- Félix-Martínez, G. J., Mata, A., Godínez-Fernández, J. R. Reconstructing human pancreatic islet architectures using computational optimization. Islets. 12 (6), 121-133 (2020).
- Hellman, B., Salehi, A., Gylfe, E., Dansk, H., Grapengiesser, E. Glucose generates coincident insulin and somatostatin pulses and antisynchronous glucagon pulses from human pancreatic islets. Endocrinology. 150 (12), 5334-5340 (2009).
- Hellman, B., Salehi, A., Grapengiesser, E., Gylfe, E. Isolated mouse islets respond to glucose with an initial peak of glucagon release followed by pulses of insulin and somatostatin in antisynchrony with glucagon. Biochemical and Biophysical Research Communications. 417 (4), 1219-1223 (2012).
- Félix-Martínez, G. J. IsletLab: an application to reconstruct and analyze islet architectures. Islets. 14 (1), 36-39 (2022).
- Félix-Martínez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets. Islets. 14 (1), 23-35 (2022).
