Summary
Dans ce protocole, les îlots pancréatiques sont reconstruits et analysés à l’aide d’algorithmes de calcul implémentés dans une application multiplateforme dédiée.
Abstract
Les propriétés structurelles des îlots pancréatiques sont essentielles à la réponse fonctionnelle des cellules sécrétant de l’insuline, du glucagon et de la somatostatine, en raison de leurs implications dans la communication intra-îlot via la signalisation électrique, paracrine et autocrine. Dans ce protocole, l’architecture tridimensionnelle d’un îlot pancréatique est d’abord reconstruite à partir de données expérimentales à l’aide d’un nouvel algorithme de calcul. Ensuite, les propriétés morphologiques et de connectivité de l’îlot reconstruit, telles que le nombre et les pourcentages des différents types de cellules, le volume cellulaire et les contacts de cellule à cellule, sont obtenues. Ensuite, la théorie des réseaux est utilisée pour décrire les propriétés de connectivité de l’îlot à l’aide de mesures dérivées du réseau telles que le degré moyen, le coefficient de clustering, la densité, le diamètre et l’efficacité. Enfin, toutes ces propriétés sont évaluées fonctionnellement par des simulations computationnelles utilisant un modèle d’oscillateurs couplés. Dans l’ensemble, nous décrivons ici un flux de travail étape par étape, mis en œuvre dans IsletLab, une application multiplateforme développée spécifiquement pour l’étude et la simulation d’îlots pancréatiques, afin d’appliquer une nouvelle méthodologie de calcul pour caractériser et analyser les îlots pancréatiques en complément du travail expérimental.
Introduction
Le pancréas est divisé en régions appelées tête, cou, corps et queue, chacune ayant des structures, des fonctions et une position anatomiquedifférentes 1,2. D’un point de vue fonctionnel, le pancréas peut être divisé en systèmes endocrinien et exocrine, le premier étant responsable de la sécrétion d’hormones impliquées de manière critique dans la régulation de l’homéostasie du glucose, tandis que le second contribue à la digestion des aliments via la sécrétion d’enzymes dans le duodénum1. Les îlots pancréatiques constituent le tissu endocrinien du pancréas et sont responsables de la sécrétion de glucagon, d’insuline et de somatostatine, sécrétés respectivement par les cellules ɑ, β et δ,respectivement 3. En plus de leurs mécanismes de régulation intrinsèques, ces cellules sont régulées par une communication électrique directe (entre les cellules β et les β probables et les cellules δ), ainsi que par la signalisation paracrine et autocrine 4,5,6. Les deux mécanismes dépendent fortement de l’architecture de l’îlot (c.-à-d. la composition et l’organisation des différents types de cellules dans l’îlot)7,8. Il est important de noter que l’architecture des îlots est altérée en présence de diabète, ce qui perturbe très probablement la communication intra-îlot en conséquence 9,10.
L’étude des îlots pancréatiques implique un large éventail de méthodologies expérimentales. Parmi ceux-ci, l’utilisation de techniques de fluorescence pour déterminer le nombre, l’emplacement et le type des différentes cellules de l’îlot a permis d’étudier les propriétés structurelles et morphologiques des îlots pancréatiques 11,12,13 et de mieux comprendre les implications fonctionnelles pour la santé et la maladie. En complément, des modèles informatiques de cellules pancréatiques 14,15,16 et, plus récemment, d’îlots pancréatiques 12,17,18,19 ont été utilisés au cours des dernières décennies pour évaluer des aspects difficiles, voire impossibles à traiter expérimentalement.
Dans ce protocole, nous visons à combler le fossé entre le travail expérimental et informatique en décrivant une méthodologie pour reconstruire les architectures d’îlots, analyser leurs propriétés morphologiques et de connectivité à travers des métriques quantitatives, et effectuer des simulations de base pour évaluer les implications fonctionnelles des propriétés des îlots.
Le protocole décrit ci-dessous est basé sur des algorithmes de calcul spécialement conçus pour l’étude des îlots pancréatiques. En résumé, dans la première étape du protocole, l’architecture des îlots est reconstruite à partir de données expérimentales à l’aide de l’algorithme récemment proposé par Félix-Martínez et al.19 dans laquelle les positions nucléaires obtenues par coloration au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et les types cellulaires identifiés par immunofluorescence (comme décrit en détail par Hoang et al.11,12 ) sont traités dans le cadre d’une procédure d’optimisation itérative. Cela conduit à déterminer la taille et la position optimales de chaque cellule et à obtenir un îlot composé de cellules qui ne se chevauchent pas. Deuxièmement, sur la base de l’architecture reconstruite, des contacts de cellule à cellule sont identifiés pour déterminer les propriétés de connectivité et générer le réseau d’îlots correspondant qui permet à l’utilisateur d’obtenir des mesures quantitatives pour décrire plus en détail l’architecture des îlots (les détails sur l’algorithme de reconstruction peuvent être consultés dans le travail original sur le sujet19). Enfin, des simulations fonctionnelles de base sont réalisées à l’aide de l’approche de modélisation proposée par Hoang et al.12 dans laquelle, sur la base de la nature pulsatile de la sécrétion hormonale observée expérimentalement 20,21, chaque cellule est traitée comme un oscillateur, et donc l’îlot est représenté comme un réseau d’oscillateurs couplés suivant les propriétés de connectivité de l’îlot reconstruit.
Compte tenu de la complexité de calcul des algorithmes utilisés dans ce protocole, toutes les étapes impliquées ont été implémentées dans une application autonome22 avec l’objectif principal d’approcher ces outils de calcul à tous les lecteurs intéressés quel que soit leur niveau d’expérience dans l’utilisation de logiciels spécialisés ou de langages de programmation.
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Protocol
REMARQUE : Un diagramme schématique du protocole est illustré à la figure 1. Une description étape par étape est donnée comme suit (voir le fichier supplémentaire 1 pour plus de détails sur les panneaux de contrôle utilisés à chaque étape du protocole).
Figure 1 : Organigramme. Diagramme de flux décrivant l’ordre séquentiel du protocole tel qu’implémenté dans IsletLab. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
1. Installation d’IsletLab sous Linux
REMARQUE: Suivez les instructions données dans les sections 2 et 3 du fichier supplémentaire 2 pour installer IsletLab dans Windows ou macOS.
- Ouvrez un navigateur Internet et accédez à https://github.com/gjfelix/IsletLab. Téléchargez et extrayez les fichiers du référentiel IsletLab.
REMARQUE : Le fichier supplémentaire 3 inclut une copie de la version d’IsletLab utilisée dans ce protocole. - Vérifiez que les compilateurs gcc et nvcc sont installés. Ouvrez un terminal et tapez les commandes suivantes :
gcc --version
nvcc --version
Suivez les instructions indiquées à la section 1 du fichier supplémentaire 2 si l’une de ces commandes n’est pas reconnue par le système. - Téléchargez et installez la plateforme de science des données (voir Tableau des matériaux). Ouvrez un terminal et accédez au dossier IsletLab.
- Créez un nouvel environnement en tapant la commande suivante dans le terminal :
conda env create -f isletlabgui_v1.0.yml - Activez le nouvel environnement en tapant :
conda activer isletlab_v1.0 - Lancez l’application IsletLab en tapant la commande suivante dans le terminal (voir Figure 2 pour une description de la fenêtre principale) :
python isletlabgui_v1.0.py
Figure 2 : Interface utilisateur d’IsletLab. L’interface est composée de trois panneaux principaux : les panneaux de configuration (1), de statistiques (2) et de graphiques (3). La barre d’outils graphique (4) se trouve en bas du panneau graphique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Reconstruction des îlots
- Préparez les données d’entrée. Organisez les données d’îlot d’entrée (c’est-à-dire les types de cellules et les coordonnées tridimensionnelles (3D)) dans un fichier à quatre colonnes dans lequel la colonne 1 contient le type de cellule (codé comme 11: ɑ-cell, 12: β-cell, 13: δ-cell) et les colonnes 2 à 4 contiennent les coordonnées x, y et z, respectivement (voir un extrait d’un fichier d’entrée dans la section 5 du fichier supplémentaire 2 ou le fichier de test d’entrée inclus dans le référentiel IsletLab).
- Assurez-vous que le fichier d’entrée n’inclut pas d’en-têtes de colonne. Utilisez l’exemple de fichier d’entrée inclus dans le référentiel IsletLab pour suivre le protocole si nécessaire (Input_Islet_test.txt).
REMARQUE: Les données d’entrée utilisées pour développer les algorithmes mis en œuvre dans IsletLab ont été obtenues expérimentalement comme décrit en détail par Hoang et al.11,12 en utilisant la coloration DAPI pour déterminer les positions nucléaires et l’immunofluorescence pour identifier les types cellulaires. - Cliquez sur le bouton Charger l’îlot initial et sélectionnez le fichier contenant les données d’entrée pour générer un îlot initial, la représentation 3D et les statistiques correspondantes. En cas d’erreur, le message suivant s’affiche : ' Erreur de chargement du fichier d’îlots'. Pour corriger cela, répétez l’étape 2.1.
- Configurez le processus de reconstruction. Cliquez sur le bouton Paramètres de reconstruction et modifiez les paramètres d’optimisation (voir les sections 4 et 5 du fichier supplémentaire 2 pour une brève description de l’algorithme et des paramètres affichés dans la fenêtre des paramètres de reconstruction).
- Définissez la température initiale = 1, le facteur d’itérations = 1 et le facteur d’acceptation = 1. Cliquez sur le bouton OK pour enregistrer les valeurs des paramètres.
REMARQUE: En règle générale, une augmentation du paramètre de température, ainsi que des itérations et des facteurs d’acceptation, donnera de meilleurs résultats de reconstruction en termes de cellules expérimentales incluses dans l’îlot reconstruit au détriment d’une augmentation du temps de calcul. - Cliquez sur le bouton Reconstruire l’îlot pour ouvrir la fenêtre du journal de reconstruction (voir la section 6 du fichier supplémentaire 2 pour une description des informations fournies dans le journal de reconstruction).
- Cliquez sur le bouton Exécuter pour démarrer le processus de reconstruction. Surveillez le processus d’optimisation jusqu’à ce que le message : « Veuillez fermer cette fenêtre pour continuer » s’affiche. Fermez la fenêtre du journal de reconstruction pour générer la représentation visuelle de l’îlot reconstruit et calculer les statistiques associées (voir la colonne de gauche de la figure 3A-C).
- Évaluez les résultats du processus de reconstruction en analysant les statistiques d’optimisation affichées dans l’onglet final de l’îlot du panneau des statistiques. En particulier, concentrez-vous sur la maximisation du pourcentage de cellules expérimentales incluses dans les îlots reconstruits (% des îlots expérimentaux) ou de manière équivalente, sur la minimisation du nombre de chevauchements (également représenté graphiquement dans le diagramme de convergence, colonne de droite de la figure 3A-C).
- Si le pourcentage de statistiques expérimentales est considéré comme faible selon les objectifs de l’utilisateur, redémarrez IsletLab comme décrit à l’étape 9.1, augmentez la température initiale, le facteur d’itérations et le facteur d’acceptation dans les paramètres de reconstruction et répétez les étapes 2.1-2.4 jusqu’à ce que des résultats satisfaisants soient obtenus (> 95% des cellules expérimentales). Voir les sections 5 à 7 du dossier supplémentaire 2 pour une description plus détaillée du processus de reconstruction et des résultats connexes.
3. Identification des contacts de cellule à cellule
- Cliquez sur le bouton Paramètres de reconstruction et définissez le paramètre Tolérance de contact pour définir la tolérance de contact de cellule à cellule, puis cliquez sur OK pour enregistrer les valeurs des paramètres.
REMARQUE : Le paramètre de tolérance de contact représente la distance maximale entre les cellules pour être considéré comme en contact. - Cliquez sur le bouton Contacts de cellule à cellule pour identifier les cellules en contact étroit. Dans l’onglet Contacts, recherchez les cellules en contact affichées graphiquement (lignes noires) dans le panneau graphique et les statistiques correspondantes (c.-à-d. contacts totaux, homotypiques et hétérotypiques et ɑ-ɑ, β-β, δ-δ, ɑ-β, ɑ-δ, contacts β-δ) affichées dans le panneau des statistiques (voir la colonne de gauche de la figure 4A-C).
- Augmentez (diminuez) le paramètre de tolérance de contact pour augmenter (diminuer) le nombre de contacts de cellule à cellule. Voir la section 8 du dossier supplémentaire 2 pour plus de détails sur l’identification des contacts de cellule à cellule et les résultats associés.
4. Construire le réseau d’îlots
- Cliquez sur le bouton Créer un réseau pour générer le réseau d’îlots et calculer les mesures de réseau associées (voir la colonne de droite de la figure 4A-C).
REMARQUE : Une description plus détaillée des résultats liés au réseau d’îlots généré est donnée à la section 9 du dossier supplémentaire 2.
5. Simulation fonctionnelle de l’îlot reconstruit
- Basculez vers l’onglet Simulation du panneau de configuration de l’interface (Figure 5).
- Sélectionnez le mode de fréquence intrinsèque souhaité - Constant ou Aléatoire - et cliquez sur le bouton Configurer la fréquence intrinsèque pour définir la fréquence des oscillateurs (en Hz). Si une fréquence intrinsèque aléatoire est sélectionnée, définissez la moyenne et l’écart (en Hz) pour générer des fréquences aléatoires normalement distribuées (voir la section 11 du fichier supplémentaire 2 pour une description des paramètres de simulation).
- Sélectionnez le mode souhaité de la phase initiale - Constant ou Aléatoire. Si une phase initiale constante est sélectionnée, cliquez sur le bouton Configurer la phase initiale pour définir la phase des oscillateurs (en radians). Si une phase initiale aléatoire est sélectionnée, le système attribuera des phases aléatoires comprises entre 0 et 2π à tous les oscillateurs.
REMARQUE: Si une phase initiale constante est sélectionnée, tous les oscillateurs seront initialisés en phase. - Cliquez sur le bouton Configurer les interactions pour définir les paramètres d’interaction de cellule à cellule dans la fenêtre de force d’interaction. Pour une description des paramètres d’interaction, reportez-vous à la section 11 du dossier supplémentaire 2.
- Configurez la simulation en définissant le temps total de simulation (en s), le pas de temps (en s) et le facteur d’enregistrement (nombre d’étapes entre les points de données enregistrés). Dans la simulation illustrée à la figure 5 , le temps total était de 20000 s, avec un pas de temps de 0,1 s et un facteur d’économie de 500.
- Définissez le nombre de blocs, de threads et de capacités de plate-forme de calcul disponibles pour effectuer la simulation. Définissez ces paramètres en fonction des caractéristiques spécifiques de l’unité de traitement graphique (GPU) disponible.
REMARQUE: Dans l’exemple illustré à la figure 5, 36 blocs et 64 threads par bloc ont été utilisés (2304 cœurs de plate-forme informatique) car un GPU avec 36 multiprocesseurs et 64 cœurs de plate-forme informatique par multiprocesseur a été utilisé. La valeur du paramètre de capacité de la plate-forme de calcul utilisé était de 75 puisque la capacité de la plate-forme de calcul matériel était de 7,5 (voir la section 10 du fichier supplémentaire 2 pour plus de détails sur ces paramètres). - Cliquez sur le bouton Exécuter la simulation pour ouvrir la fenêtre du journal de simulation. Cliquez sur le bouton Exécuter pour démarrer la simulation et surveiller le processus jusqu’à ce que la légende : « Veuillez fermer la fenêtre pour continuer » s’affiche. Reportez-vous à la section 12 du dossier supplémentaire 2 pour plus de détails sur le journal de simulation.
- Fermez la fenêtre du journal de simulation pour observer les résultats de la simulation (voir Figure 5). Des détails sur les résultats de la simulation sont donnés à la section 13 du dossier supplémentaire 2.
6. Enregistrer le projet (facultatif)
- Cliquez sur Fichier > Exporter le projet dans la barre de menus. Sélectionnez le répertoire dans lequel le fichier projet sera enregistré et cliquez sur le bouton OK .
Remarque : Le nom du fichier projet est déterminé automatiquement en fonction du nom du fichier de données initial. Si le projet n’est pas enregistré, tous les résultats et les fichiers associés seront automatiquement supprimés. - Chargez un projet exporté en cliquant sur Fichier > Charger le projet.
7. Enregistrer les chiffres (facultatif)
- Cliquez sur l’icône Enregistrer le tracé située dans la barre d’outils du tracé pour enregistrer la visualisation actuelle dans un fichier image. Répétez cette étape pour toutes les figures créées tout au long du protocole.
REMARQUE : Les tracés et les visualisations d’îlots peuvent être modifiés à l’aide des icônes disponibles dans la barre d’outils du tracé du panneau graphique.
8. Charger le projet (facultatif)
- Cliquez sur Fichier > Charger le projet dans le menu principal et sélectionnez un fichier projet enregistré précédemment comme décrit aux étapes 6.1 à 6.2.
Remarque : Un projet ne sera pas chargé correctement si le fichier projet a été modifié en externe. Si un projet est chargé avec succès, seules les fonctionnalités de simulation seront disponibles.
9. Redémarrez le processus de reconstruction et d’analyse (facultatif)
- À tout moment, l’utilisateur peut sélectionner Fichier > Redémarrer pour ignorer tous les résultats et commencer une nouvelle reconstruction et analyse.
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Representative Results
La reconstruction des îlots pancréatiques à l’aide de la méthodologie proposée par Félix-Martínez et al.19 dépend fortement des paramètres donnés à l’algorithme d’optimisation (définis dans les paramètres de reconstruction). Un exemple de ceci est montré visuellement dans la figure 3 où des îlots reconstruits obtenus à l’aide de différents ensembles de paramètres sont montrés. Tout d’abord, dans la figure 3A, une reconstruction qui comprenait 86,6 % des cellules incluses dans les données initiales est montrée (509 sur 588 cellules, température initiale = 1, facteur d’itération = 1, facteur d’acceptation = 1). Lorsque la température initiale et les facteurs d’itération et d’acceptation sont augmentés (température initiale = 10, facteur d’itération = 5 et facteur d’acceptation = 5, figure 3B), un pourcentage plus élevé (93,37 %) de cellules initiales a été inclus dans les îlots reconstruits (c.-à-d. 549 cellules sur 588). Des résultats encore meilleurs peuvent être obtenus si des valeurs beaucoup plus élevées sont utilisées, en particulier pour les facteurs d’itération et d’acceptation, comme illustré à la figure 3C (température initiale = 10, facteur d’itérations = 1000, facteur d’acceptation = 500), où l’îlot reconstruit est composé de 99,15% des cellules initiales (583 sur 588 cellules). Les diagrammes de convergence (colonne de droite de la figure 3A-C), montrant l’évolution des cellules superposées en fonction de la température, doivent être évalués pour déterminer comment les paramètres affectent le processus d’optimisation. En règle générale, les facteurs d’interaction et d’acceptation doivent être augmentés lorsque l’îlot reconstruit comprend un faible pourcentage de cellules initiales. Par conséquent, le temps de calcul augmentera inévitablement, car ces facteurs augmentent directement le nombre d’itérations évaluées. Par exemple, le temps de calcul de la première reconstruction décrite ci-dessus était de 6 s. En revanche, les temps de calcul des deuxième et troisième reconstructions étaient respectivement de 21 s et 24 min 6 s.
Figure 3 : Reconstruction d’îlots à l’aide d’ensembles de paramètres sous-optimaux dans les paramètres de reconstruction L’utilisation d’ensembles de paramètres sous-optimaux pourrait conduire à un faible pourcentage de cellules expérimentales dans les îlots reconstruits. (A) À gauche : 86,6 % des cellules expérimentales ont été incluses dans l’îlot reconstruit (température initiale = 1, facteur d’itération = 1, facteur d’acceptation = 1, temps de calcul = 6 s). A droite : plan de convergence du processus de reconstruction. (B) À gauche : 93,4 % des cellules expérimentales ont été incluses dans l’îlot reconstruit (température initiale = 10, facteur d’itérations = 10, facteur d’acceptation = 5, temps de calcul = 21 s). A droite : plan de convergence du processus de reconstruction. (C) À gauche : 99,15 % des cellules expérimentales ont été incluses dans l’îlot reconstruit (température initiale = 10, facteur d’itérations = 1000, facteur d’acceptation = 500, temps de calcul = 24 min, 8 s). A droite : plan de convergence du processus de reconstruction. Les flèches dans les diagrammes de convergence indiquent le nombre initial et final de cellules superposées du processus de reconstruction (avant la phase de post-traitement de l’algorithme de reconstruction). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L’identification des contacts de cellule à cellule à partir de l’îlot reconstruit dépend de la valeur du paramètre de tolérance de contact (défini dans les paramètres de reconstruction) illustré à la figure 4A-C, où les contacts de cellule à cellule (représentés par des lignes noires), identifiés à partir des architectures reconstruites illustrées à la figure 3A-C, sont présentés. Par exemple, si une tolérance de contact de 1 μm est définie, comme dans la figure 4A, seuls 290 contacts de cellule à cellule sont identifiés. En revanche, si la tolérance de contact est augmentée à 2 μm, comme dans la figure 4B,C, le nombre total de contacts identifiés est passé à 636 et 731, respectivement (voir le panneau des statistiques de la figure 4A-C). Ces différences peuvent également être remarquées dans la représentation visuelle des contacts de cellule à cellule illustrée dans la colonne de gauche de la figure 4A-C, car le nombre de contacts entre les cellules augmente clairement à mesure qu’une valeur plus élevée de la tolérance de contact est utilisée. Il convient de souligner que le nombre de contacts dépend également du nombre de cellules incluses dans les îlots reconstruits et, par conséquent, la combinaison du paramètre de température, des itérations et des facteurs d’acceptation, et de la tolérance de contact détermine en fin de compte la connectivité de l’îlot reconstruit, ce qui se reflète sur les réseaux d’îlots formés et les mesures de réseau correspondantes, comme le montre la colonne de droite de la figure 4A-C. Le tracé réseau permet à l’utilisateur de visualiser comment les différentes cellules sont connectées. Quantitativement, les propriétés de connectivité de l’îlot sont décrites en fonction des mesures de réseau suivantes : degré moyen, densité, coefficient de regroupement moyen, efficacité et diamètre (les détails sur ces mesures peuvent être consultés à la section 9 du fichier supplémentaire 2).
Figure 4 : Effet du paramètre de tolérance de contact dans l’identification des contacts de cellule à cellule. (A-C) À gauche : contacts de cellule à cellule identifiés à partir des îlots reconstruits illustrés à la figure 3A-C (290, 636 et 731 contacts totaux dans les panneaux A, B et C, respectivement). Les valeurs utilisées pour le paramètre de tolérance de contact étaient de 1 μm (A) et 2 μm (B et C). Notez que le nombre de cellules incluses dans les îlots reconstruits affecte également le nombre de contacts de cellule à cellule identifiés. Droite : les réseaux générés à partir des contacts de cellule à cellule sont affichés dans la colonne de gauche correspondante. Notez que l’impact de la connectivité sur les métriques réseau est mis en évidence dans le panneau des statistiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Enfin, une fois l’îlot reconstruit et les contacts cellule-à-cellule identifiés, une simulation fonctionnelle peut être réalisée (uniquement lorsqu’un GPU compatible est disponible). Les résultats typiques de la simulation sont présentés à la figure 5, y compris les oscillations additionnées des différentes populations cellulaires (cellules ɑ, β et δ) et de l’îlot entier (graphique supérieur du panneau graphique de la figure 5). Cette figure montre les différences de phase au fil du temps entre les différentes populations cellulaires en raison des propriétés de connectivité et d’interaction et permet à l’utilisateur de déterminer la contribution de chaque population cellulaire (lignes rouges, vertes et bleues) au comportement oscillatoire de l’ensemble de l’îlot (ligne noire). Par exemple, le panneau supérieur de la figure 5 suggère qu’au niveau de la population, les cellules ɑ et β oscillent complètement déphasées, tandis que les cellules δ oscillent déphasées avec les cellules ɑ et β. De plus, selon la simulation, le comportement oscillatoire de l’îlot est dominé par les oscillations des cellules ɑ, bien que l’effet des autres populations cellulaires puisse également être remarqué. Notez que les signaux oscillatoires de toutes les cellules des îlots sont enregistrés automatiquement dans un fichier de données (voir tableau 1 et section 13 du fichier supplémentaire 2), permettant ainsi à l’utilisateur d’effectuer une analyse détaillée des résultats de la simulation. En complément, l’indice de synchronisation des îlots, qui reflète la cohérence de phase des oscillations, est également calculé et affiché (graphique du bas du panneau graphique de la figure 5). Notez que l’index de synchronisation varie de 0 à 1, où 0 et 1 indiquent une synchronisation nulle et totale entre toutes les cellules de l’îlot, respectivement. Le diagramme d’index de synchronisation peut donc être interprété comme une visualisation de la façon dont la synchronicité entre les cellules d’îlots varie au fil du temps en raison des propriétés de connectivité et d’interaction de l’îlot reconstruit. Étant donné que la simulation effectuée est basée sur l’idée d’oscillateurs couplés12 et dépend fortement de la connectivité de l’îlot reconstruit, il est essentiel d’atteindre une reconstruction d’îlot acceptable et une connectivité de cellule à cellule avant d’effectuer une simulation fonctionnelle.
Figure 5 : Les paramètres de simulation sont définis dans le panneau de configuration de l’onglet simulation. Les résultats de la simulation sont affichés dans l’onglet simulation du panneau graphique où le comportement oscillatoire additionné des différentes populations de cellules (ɑ, β et δ) et de l’ensemble de l’îlot est affiché (en haut). L’indice de synchronisation, une mesure de la cohérence de phase entre les cellules des îlots, est également affiché (en bas). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Il convient de mentionner que pratiquement à chaque étape du processus, des fichiers de données sont générés. Une description des fichiers de données générés se trouve dans le tableau 1 et dans le dossier supplémentaire 2.
| Lime | Description |
| IsletFileName (nom de fichier d’îlot) | Données d’entrée (fournies par l’utilisateur) |
| IsletFileName_initial.txt | Architecture initiale des îlots proposée par l’algorithme comme première étape de la reconstruction |
| IsletFileName_reconstructed.txt | Îlot reconstruit (non posptrocessed) |
| IsletFileName_postprocessed_islet.txt | Îlot final reconstruit et îlot post-épissé |
| IsletFileName_processlog.txt | Journal de reconstruction (algorithme d’optimisation) |
| IsletFileName_overlapped_cells.txt | Cellules superposées à la fin du processus de reconstruction (post-traitement) |
| IsletFileName_all_contacts.txt | Matrice d’adjancence de tous les contacts |
| IsletFileName_aa_contacts.txt | Matrice d’adjancence des contacts ɑ-ɑ |
| IsletFileName_ab_contacts.txt | Matrice d’adjancence des contacts ɑ-β |
| IsletFileName_ad_contacts.txt | Matrice d’adjancence des contacts ɑ-δ |
| IsletFileName_bbbd_contacts.txt | Matrice d’adjancence des contacts β-β et β-δ |
| IsletFileName_bb_contacts.txt | Matrice d’adjancence des contacts β β |
| IsletFileName_bd_contacts.txt | Matrice d’adjancence des contacts δ β |
| IsletFileName_dd_contacts.txt | Matrice d’adjancence des contacts δ δ |
| IsletFileName_Kmat.txt | Matrice d’interaction utilisée dans la simulation |
| IsletFileName_kuramoto_angles.txt | Résultats de la simulation Kuramoto |
Tableau 1 : Description des fichiers enregistrés dans le cadre du fichier projet. Notez que le nom de fichier utilisé pour enregistrer les fichiers de projet est automatiquement défini par le fichier de données initial sélectionné par l’utilisateur.
Dossier supplémentaire 1 : Description graphique du protocole à l’aide des panneaux de contrôle d’IsletLab. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire 2 : Documentation IsletLab. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire 3 : Inclut tous les fichiers nécessaires à l’installation d’IsletLab. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le protocole ci-dessus décrit une approche pratique pour reconstruire et analyser les architectures d’îlots pancréatiques à l’aide de nouveaux algorithmes de calcul. L’objectif principal de ces travaux est de permettre à la communauté de recherche sur les îlots de dériver des mesures quantitatives pour caractériser les propriétés morphologiques et de connectivité des architectures d’îlots pancréatiques et d’évaluer les implications fonctionnelles possibles de ces propriétés via des simulations informatiques.
Bien que les algorithmes adoptés dans ce protocole aient déjà été décrits en détail12,19, une implémentation directe et conviviale faisait défaut en raison de leur complexité relative, limitant ainsi leur utilisation en tant qu’outil complémentaire aux travaux expérimentaux et théoriques.
Tout d’abord, un algorithme récent proposé par Félix-Martínez et al.19 est utilisé pour reconstruire les architectures des îlots à partir de données expérimentales (par exemple, coordonnées nucléaires et type de cellule). En conséquence, l’utilisateur obtient une architecture d’îlots composée de cellules sphériques qui ne se chevauchent pas avec des rayons attribués automatiquement conformément aux distributions expérimentales rapportées. En pratique, l’algorithme de reconstruction est une procédure d’optimisation itérative qui devient coûteuse du point de vue informatique à mesure que le nombre de cellules dans l’îlot augmente. Pour cette raison, il est fortement recommandé d’utiliser un système multiprocesseur pour tirer parti de l’implémentation de traitement parallèle de l’algorithme décrit dans ce protocole. Comme décrit ci-dessus, une étape clé du processus de reconstruction consiste à définir des valeurs appropriées pour les paramètres impliqués (c.-à-d. itérations, facteurs d’acceptation et température initiale), car le temps de calcul sera directement lié au nombre d’itérations effectuées, en plus du nombre de processus parallèles utilisés (c.-à-d. paramètre de threads dans les paramètres de reconstruction). Si le temps de calcul n’est pas un problème, nous vous recommandons fortement d’utiliser les valeurs les plus élevées possibles pour les itérations et les facteurs d’acceptation afin d’augmenter le nombre d’itérations effectuées.
Les prochaines étapes du protocole sont l’identification des contacts de cellule à cellule et la génération du réseau d’îlots. Les deux étapes sont directement liées au processus de reconstruction et, en tant que telles, le nombre de cellules incluses dans les îlots reconstruits (et donc les paramètres impliqués), ainsi que la valeur de la tolérance de contact utilisée, sont essentiels pour obtenir les meilleurs résultats possibles.
Enfin, si l’utilisateur le souhaite, des simulations fonctionnelles peuvent être réalisées grâce à la mise en œuvre du modèle d’oscillateurs couplés proposé par Hoang et al.12 en utilisant le réseau de connectivité dérivé du processus de reconstruction pour configurer le système oscillatoire. Étant donné que le processus de simulation implique la résolution d’un système de centaines ou de milliers d’équations différentielles couplées (une pour chaque cellule de l’îlot), l’algorithme de simulation a été mis en œuvre en tirant parti de la possibilité d’effectuer des calculs parallèles à l’aide du GPU, permettant ainsi à l’utilisateur de simuler des simulations de longue durée considérable dans un temps de calcul relativement court. Les étapes clés de l’étape de simulation du protocole consistent à déterminer le nombre approprié de blocs et de threads disponibles dans la section des paramètres de la plate-forme informatique du panneau de simulation, un aspect directement lié aux caractéristiques du matériel utilisé. Les autres paramètres impliqués (fréquence intrinsèque, phase initiale et forces d’interaction dans le panneau de simulation), bien que pertinents pour les résultats de simulation, sont principalement liés au problème étudié et doivent être définis par l’utilisateur après mûre réflexion afin de représenter le scénario de simulation souhaité.
Malgré les avantages offerts par le protocole, certaines limites doivent être reconnues. Tout d’abord, les paramètres liés au processus de reconstruction et à l’identification des contacts cellule-à-cellule ne sont pas uniques et peuvent varier d’un cas à l’autre. Pour cette raison, bien qu’une règle empirique puisse être utilisée pour déterminer la valeur des paramètres requis, une approche par essais et erreurs est toujours inévitable. Un autre aspect qui pourrait limiter l’applicabilité du protocole est les ressources de calcul nécessaires, en particulier pour les étapes de reconstruction et de simulation du protocole. Malgré ces limites, le fait que les connaissances en programmation ne soient pas nécessaires à la mise en œuvre du protocole permet aux chercheurs de divers horizons d’utiliser facilement les algorithmes proposés qui, autrement, resteraient obscurs pour l’utilisateur non spécialisé.
Les utilisations potentielles du protocole proposé comprennent la visualisation de données expérimentales, l’analyse comparative d’îlots normaux et altérés (p. ex., en présence de diabète de type 1 ou 2), ou même la comparaison entre îlots de différentes espèces à l’aide de mesures morphologiques, structurelles et de réseau quantitatives23. De plus, les îlots reconstruits à l’aide du protocole décrit ici peuvent être facilement utilisés pour générer des modèles mathématiques fonctionnels détaillés dans lesquels la connectivité et la taille des cellules déterminées par l’algorithme de reconstruction sont complétées par des modèles électrophysiologiques détaillés de cellules pancréatiques pour élucider les implications fonctionnelles de la communication intercellulaire au sein des îlots reconstruits.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
G.J. Félix-Martínez remercie le CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, Mexique) et le Département de génie électrique de l’Universidad Autónoma Metropolitana (Ville de Mexico) pour le soutien apporté à ce projet. Nous remercions le Dr Danh-Tai Hoang, le Dr Manami Hara et le Dr Junghyo Jo pour leur travail exceptionnel et leur générosité dans le partage des architectures d’îlots qui ont rendu ce travail possible avec la communauté de recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUDA-capable NVIDIA graphics card | Required for the functional simulations | ||
| IsletLab | https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.) |
References
- Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells. ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).
- Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas. The Pancreas. Beger, H. G., Warshaw, A. L., Hruban, R. H., Buchler, M. W., Lerch, M. M., Neoptolemos, J. P., Shimosegawa, T., Whitcomb, D. C., GroB, C. , Wiley Online Library. (2018).
- Liao, E. P., Brass, B., Abelev, Z., Poretsky, L. Endocrine Pancreas. Principles of Diabetes Mellitus. Poretsky, L. , Springer. Cham. (2017).
- Noguchi, G. M., Huising, M. O. Integrating the inputs that shape pancreatic islet hormone release. Nature Metabolism. 1, 1189-1201 (2019).
- Pérez-Armendariz, E. M. Connexin 36, a key element in pancreatic beta cell function. Neuropharmacology. 75, 557-566 (2013).
- Briant, L., et al. δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin. The Journal of Physiology. 596 (2), 197-215 (2018).
- Arrojoe Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Folli, F., et al. Pancreatic islet of Langerhans' cytoarchitecture and ultrastructure in normal glucose tolerance and in type 2 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 20, Suppl 2 137-144 (2018).
- Kilimnik, G., et al. Altered islet composition and disproportionate loss of large islets in patients with type 2 diabetes. PloS One. 6 (11), 27445 (2011).
- Hoang, D. T., et al. A Conserved Rule for Pancreatic Islet Organization. PloS One. 9 (10), 110384 (2014).
- Hoang, D. T., Hara, M., Jo, J. Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses. PloS One. 11 (4), 0152446 (2016).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Félix-Martinez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Mathematical models of electrical activity of the pancreatic β-cell: a physiological review. Islets. 6 (3), 949195 (2014).
- Félix-Martínez, G. J., González-Vélez, V., Godínez-Fernández, J. R., Gil, A. Electrophysiological models of the human pancreatic δ-cell: From single channels to the firing of action potentials. International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering. 36 (2), 3296 (2020).
- Watts, M., Sherman, A. Modeling the pancreatic α-cell: dual mechanisms of glucose suppression of glucagon secretion. Biophysical Journal. 106 (3), 741-751 (2014).
- Lei, C. L., et al. Beta-cell hubs maintain Ca2+ oscillations in human and mouse islet simulations. Islets. 10 (4), 151-167 (2018).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).
- Félix-Martínez, G. J., Mata, A., Godínez-Fernández, J. R. Reconstructing human pancreatic islet architectures using computational optimization. Islets. 12 (6), 121-133 (2020).
- Hellman, B., Salehi, A., Gylfe, E., Dansk, H., Grapengiesser, E. Glucose generates coincident insulin and somatostatin pulses and antisynchronous glucagon pulses from human pancreatic islets. Endocrinology. 150 (12), 5334-5340 (2009).
- Hellman, B., Salehi, A., Grapengiesser, E., Gylfe, E. Isolated mouse islets respond to glucose with an initial peak of glucagon release followed by pulses of insulin and somatostatin in antisynchrony with glucagon. Biochemical and Biophysical Research Communications. 417 (4), 1219-1223 (2012).
- Félix-Martínez, G. J. IsletLab: an application to reconstruct and analyze islet architectures. Islets. 14 (1), 36-39 (2022).
- Félix-Martínez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets. Islets. 14 (1), 23-35 (2022).
