Summary
Neste protocolo, as ilhotas pancreáticas são reconstruídas e analisadas usando algoritmos computacionais implementados em uma aplicação multiplataforma dedicada.
Abstract
As propriedades estruturais das ilhotas pancreáticas são fundamentais para a resposta funcional das células secretantes de insulina, glucagon e somatostatina, devido às suas implicações na comunicação intraisleta via sinalização elétrica, paracrina e autocririna. Neste protocolo, a arquitetura tridimensional de uma ilhota pancreática é primeiro reconstruída a partir de dados experimentais usando um novo algoritmo computacional. Em seguida, são obtidas as propriedades morfológicas e de conectividade da ilhota reconstruída, como o número e percentuais dos diferentes tipos de células, volume celular e contatos célula-célula. Em seguida, a teoria da rede é usada para descrever as propriedades de conectividade da ilhota através de métricas derivadas da rede, como grau médio, coeficiente de cluster, densidade, diâmetro e eficiência. Finalmente, todas essas propriedades são avaliadas funcionalmente através de simulações computacionais usando um modelo de osciladores acoplados. No geral, descrevemos aqui um fluxo de trabalho passo a passo, implementado no IsletLab, um aplicativo multiplataforma desenvolvido especificamente para o estudo e simulação de ilhotas pancreáticas, para aplicar uma nova metodologia computacional para caracterizar e analisar ilhotas pancreáticas como um complemento ao trabalho experimental.
Introduction
O pâncreas é dividido em regiões referidas como cabeça, pescoço, corpo e cauda, cada uma com estruturas, funções e posição anatômicadiferentes 1,2. Do ponto de vista funcional, o pâncreas pode ser dividido em sistemas endócrinos e exócrinos com o primeiro responsável pela secreção de hormônios criticamente envolvidos na regulação da homeostase glicemia, enquanto este último contribui para a digestão alimentar através da secreção de enzimas no duodeno1. As ilhotas pancreáticas constituem o tecido endócrino do pâncreas e são responsáveis pela secreção de glucagon, insulina e somatostatina, secretadas de células de β, e δ, respectivamente3. Além de seus mecanismos de regulação intrínseca, essas células são reguladas via comunicação elétrica direta (entre células β e prováveis β e δ células), e também por sinalização paracrina e autocririna 4,5,6. Ambos os mecanismos são altamente dependentes da arquitetura de ilhotas (ou seja, a composição e organização dos diferentes tipos de células dentro da ilhota)7,8. É importante ressaltar que a arquitetura de ilhotas é alterada na presença de diabetes, provavelmente perturbando a comunicação intraisleta como resultado 9,10.
O estudo das ilhotas pancreáticas envolve uma ampla gama de metodologias experimentais. Entre elas, o uso de técnicas de fluorescência para determinar o número, localização e tipo das diferentes células da ilhota permitiu estudar as propriedades estruturais e morfológicas das ilhotas pancreáticas 11,12,13 e obter uma melhor compreensão das implicações funcionais em saúde e doença. Como complemento, modelos computacionais de células pancreáticas 14,15,16 e, mais recentemente, ilhotas pancreáticas 12,17,18,19 foram utilizadas nas últimas décadas para avaliar aspectos difíceis ou até impossíveis de abordar experimentalmente.
Neste protocolo, buscamos preencher a lacuna entre o trabalho experimental e computacional, delineando uma metodologia para reconstruir arquiteturas de ilhotas, analisar suas propriedades morfológicas e conectividade por meio de métricas quantitativas e realizar simulações básicas para avaliar as implicações funcionais das propriedades ilhotas.
O protocolo descrito abaixo é baseado em algoritmos computacionais especificamente projetados para o estudo de ilhotas pancreáticas. Em resumo, na primeira etapa do protocolo, a arquitetura de ilhotas é reconstruída a partir de dados experimentais utilizando o algoritmo recentemente proposto por Félix-Martínez et al.19 em que posições nucleares obtidas através de 4′,6-diamidino-2-pheilndole (DAPI) coloração e tipos celulares identificados através de imunofluscência (como descrito em detalhes por Hoang et al.11,12 ) são processados em um procedimento de otimização iterativo. Isso leva à determinação do tamanho e posição ideais de cada célula e à obtenção de uma ilhota composta de células não sobrepostas. Em segundo lugar, com base na arquitetura reconstruída, os contatos célula-célula são identificados para determinar as propriedades de conectividade e gerar a rede de ilhotas correspondente que permite ao usuário obter métricas quantitativas para descrever melhor a arquitetura de ilhotas (detalhes sobre o algoritmo de reconstrução podem ser consultados no trabalho original sobre o assunto19). Finalmente, simulações funcionais básicas são realizadas utilizando-se a abordagem de modelagem proposta por Hoang et al.12 em que, com base na natureza pulsante da secreção hormonal observada experimentalmente20,21, cada célula é tratada como um oscilador e, portanto, a ilhota é representada como uma rede de osciladores acoplados seguindo as propriedades de conectividade da ilhota reconstruída.
Dada a complexidade computacional dos algoritmos utilizados neste protocolo, todas as etapas envolvidas foram implementadas em um aplicativo autônomo22 com o objetivo principal de abordar essas ferramentas computacionais para todos os leitores interessados, independentemente de seu nível de experiência no uso de software especializado ou linguagens de programação.
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Protocol
NOTA: Um diagrama esquemático do protocolo é mostrado na Figura 1. Uma descrição passo a passo é dada da seguinte forma (consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter detalhes sobre os painéis de controle usados em cada etapa do protocolo).
Figura 1: Diagrama de fluxo. Um diagrama de fluxo descrevendo a ordem sequencial do protocolo conforme implementado no IsletLab. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Instalação do IsletLab no Linux
NOTA: Siga as instruções dadas nas seções 2 e 3 do Arquivo Suplementar 2 para instalar o IsletLab nas janelas ou macOS.
- Abra um navegador de internet e vá para https://github.com/gjfelix/IsletLab. Baixe e extraia os arquivos do repositório do IsletLab.
NOTA: O Arquivo Suplementar 3 inclui uma cópia da versão do IsletLab usada neste protocolo. - Verifique se os compiladores GCC e NVCC estão instalados. Abra um terminal e digite os seguintes comandos:
gcc --versão
nvcc --versão
Siga as instruções listadas na seção 1 do Arquivo Suplementar 2 se algum desses comandos não for reconhecido pelo sistema. - Baixe e instale a plataforma de ciência de dados (ver Tabela de Materiais). Abra um terminal e vá para a pasta IsletLab.
- Crie um novo ambiente digitando o seguinte comando no terminal:
conda env criar -f isletlabgui_v1.0.yml - Ativar o novo ambiente digitando:
conda ativar isletlab_v1.0 - Inicie o aplicativo IsletLab digitando o seguinte comando no terminal (ver Figura 2 para uma descrição da janela principal):
píton isletlabgui_v1.0.py
Figura 2: A interface de usuário do IsletLab. A interface é composta por três painéis principais: configuração (1), estatística (2) e gráficos (3) painéis. A barra de ferramentas gráfica (4) está localizada na parte inferior do painel gráfico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Reconstrução de ilhotas
- Prepare os dados de entrada. Organize os dados de ilhotas de entrada (ou seja, tipos de células e coordenadas de três dimensões (3D) em um arquivo de quatro colunas em que a coluna 1 contém o tipo de célula (codificado como 11: ª célula, 12: β células, 13: δ células) e as colunas 2 a 4 contêm as coordenadas x, y e z, respectivamente (consulte um trecho de um arquivo de entrada na seção 5 do Arquivo Suplementar 2 ou no arquivo de teste de entrada incluído no repositório do IsletLab).
- Certifique-se de que o arquivo de entrada não inclua cabeçalhos de coluna. Use o arquivo de entrada de exemplo incluído no repositório DolletLab para seguir o protocolo, se necessário (Input_Islet_test.txt).
NOTA: Os dados de entrada utilizados para desenvolver os algoritmos implementados no IsletLab foram obtidos experimentalmente conforme descrito em detalhes por Hoang et al.11,12 usando a coloração da DAPI para determinar as posições nucleares e a imunofluorescência para identificar os tipos celulares. - Clique no botão 'Carregar ilhota inicial ' e selecione o arquivo contendo dados de entrada para gerar uma ilhota inicial, a representação 3D e as estatísticas correspondentes. Em caso de erro, a seguinte mensagem será exibida: 'Arquivo de isícula de carregamento de erro'. Para corrigir isso, repita o passo 2.1.
- Configure o processo de reconstrução. Clique no botão Configurações de Reconstrução e modifique os parâmetros de otimização (consulte as seções 4 e 5 do Arquivo Suplementar 2 para uma breve descrição do algoritmo e dos parâmetros mostrados na janela de configurações de reconstrução).
- Definir a temperatura inicial = 1, fator de iterações = 1, e fator de aceitação = 1. Clique no botão OK para salvar os valores dos parâmetros.
NOTA: Como regra geral, um aumento no parâmetro de temperatura, bem como nas iterações e fatores de aceitação, produzirá melhores resultados de reconstrução em termos das células experimentais incluídas na ilhota reconstruída em detrimento de um aumento no tempo de computação. - Clique no botão Reconstruir ilhotas para abrir a janela de registro de reconstrução (consulte a seção 6 do Arquivo Suplementar 2 para obter uma descrição das informações fornecidas no registro de reconstrução).
- Clique no botão Executar para iniciar o processo de reconstrução. Monitore o processo de otimização até que a mensagem: 'Por favor, feche esta janela para continuar' é exibida. Feche a janela de registro de reconstrução para gerar a representação visual da ilhota reconstruída e para calcular as estatísticas relacionadas (ver a coluna esquerda na Figura 3A-C).
- Avalie os resultados do processo de reconstrução analisando as estatísticas de otimização mostradas na guia final de ilhotas do painel estatístico. Particularmente, concentre-se em maximizar a porcentagem de células experimentais incluídas nas ilhotas reconstruídas (% de experimentais) ou equivalentemente, na minimização do número de sobreposições (também mostradas graficamente no enredo de convergência, coluna direita na Figura 3A-C).
- Se a % da estatística experimental for considerada baixa de acordo com os objetivos do usuário, reinicie o IsletLab como descrito na etapa 9.1 e aumente a temperatura inicial, fator de iterações e fator de aceitação nos ajustes de reconstrução e repita as etapas 2.1-2.4 até que os resultados satisfatórios sejam obtidos (> 95% das células experimentais). Consulte as seções 5-7 do Arquivo Suplementar 2 para maior descrição do processo de reconstrução e dos resultados relacionados.
3. Identificação de contatos célula a célula
- Clique no botão Configurações de reconstrução e defina o parâmetro Tolerância de Contato para definir a tolerância de contato entre células e clique em OK para salvar os valores dos parâmetros.
NOTA: O parâmetro de tolerância ao contato representa a distância máxima entre as células para ser considerado como em contato. - Clique no botão Contatos célula-célula para identificar as células em contato próximo. Na guia contatos, verifique se há células em contato mostradas graficamente (linhas pretas) no painel gráfico e nas estatísticas correspondentes (ou seja, contatos total, homotípico e heterotípico e contatos β-β, δ-δ, β δ, β-δ) mostrados no painel de estatísticas (ver a coluna esquerda da Figura 4A-C).
- Aumente (diminua) o parâmetro de tolerância ao contato para aumentar (diminuir) o número de contatos célula-célula. Consulte a seção 8 do Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes sobre a identificação de contatos célula-célula e os resultados associados.
4. Construção da rede de ilhotas
- Clique no botão Build Network para gerar a rede de ilhotas e para calcular as métricas de rede associadas (consulte a coluna direita na Figura 4A-C).
NOTA: Uma descrição adicional dos resultados relacionados à rede de ilhotas geradas é dada na seção 9 do Arquivo Suplementar 2.
5. Simulação funcional da ilhota reconstruída
- Mude para a guia de simulação do painel de configuração da interface (Figura 5).
- Selecione o modo desejado de frequência intrínseca - Constante ou Aleatória - e clique no botão Configurar frequência intrínseca para definir a frequência dos osciladores (em Hz). Se for selecionada uma frequência intrínseca aleatória, defina a média e o desvio (em Hz) para gerar frequências aleatórias normalmente distribuídas (ver seção 11 do Arquivo Suplementar 2 para uma descrição dos parâmetros de simulação).
- Selecione o modo desejado da fase inicial - Constante ou Aleatório. Se uma fase inicial constante for selecionada, clique no botão Configurar fase inicial para definir a fase dos osciladores (em radians). Se a fase inicial aleatória for selecionada, o sistema atribuirá fases aleatórias entre 0 e 2π a todos os osciladores.
NOTA: Se uma fase inicial constante for selecionada, todos os osciladores serão iniciados em fase. - Clique no botão Configurar Interações para definir os parâmetros de interação célula-celular na janela de força de interação. Para obter uma descrição dos parâmetros de interação, consulte a seção 11 do Arquivo Suplementar 2.
- Configure a simulação definindo o tempo total de simulação (em s), etapa de tempo (em s) e fator de salvamento (números de etapas entre os pontos de dados salvos). Na simulação mostrada na Figura 5 o tempo total foi de 20000, com um passo de tempo de 0,1 s e um fator de salvamento de 500.
- Defina o número de blocos, threads e recursos de plataforma de computação disponíveis para realizar a simulação. Defina esses parâmetros de acordo com as características específicas da unidade de processamento gráfico (GPU) disponível.
NOTA: No exemplo mostrado na Figura 5, foram utilizados 36 blocos e 64 threads por bloco (2304 núcleos de plataforma de computação) desde que foi utilizada uma GPU com 36 multiprocessadores e 64 núcleos de plataforma de computação por multiprocessadores. O valor do parâmetro de capacidade da plataforma de computação utilizado foi de 75, uma vez que a capacidade da plataforma de computação de hardware era 7.5 (ver seção 10 do Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes sobre esses parâmetros). - Clique no botão Executar simulação para abrir a janela de registro de simulação. Clique no botão Executar para iniciar a simulação e monitore o processo até que a legenda: 'Por favor, feche a janela para continuar' seja exibida. Consulte a seção 12 do Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes sobre o registro de simulação.
- Feche a janela de registro de simulação para observar os resultados da simulação (ver Figura 5). Detalhes sobre os resultados da simulação são dados na seção 13 do Arquivo Suplementar 2.
6. Salve o projeto (opcional)
- Clique em Arquivar > Projeto de Exportação na barra de menu. Selecione o diretório no qual o arquivo do projeto será salvo e clique no botão OK .
NOTA: O nome do arquivo do projeto é determinado automaticamente com base no nome do arquivo de dados inicial. Se o projeto não for salvo, todos os resultados e arquivos relacionados serão excluídos automaticamente. - Carregue um projeto exportado clicando em Arquivo > Projeto de Carga.
7. Salvar figuras (opcional)
- Clique no Ícone salvar plot localizado na barra de ferramentas do plot para salvar a visualização atual em um arquivo de imagem. Repita esta etapa para todas as figuras criadas ao longo do protocolo.
NOTA: As visualizações de gráficos e ilhotas podem ser modificadas usando os ícones disponíveis na barra de ferramentas de plot do painel gráfico.
8. Projeto de carga (opcional)
- Clique em Arquivar > Carregar projeto no menu principal e selecione um arquivo de projeto salvo anteriormente, conforme descrito nas etapas 6.1-6.2.
NOTA: Um projeto não será carregado corretamente se o arquivo do projeto tiver sido modificado externamente. Se um projeto for carregado com sucesso, apenas os recursos de simulação estarão disponíveis.
9. Reinicie o processo de reconstrução e análise (opcional)
- A qualquer momento o usuário pode selecionar Arquivo > Reiniciar para descartar todos os resultados e iniciar uma nova reconstrução e análise.
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Representative Results
A reconstrução das ilhotas pancreáticas utilizando a metodologia proposta por Félix-Martínez et al.19 é altamente dependente dos parâmetros dados ao algoritmo de otimização (definido nos cenários de reconstrução). Um exemplo disso é mostrado visualmente na Figura 3, onde ilhotas reconstruídas obtidas usando diferentes conjuntos de parâmetros são mostradas. Primeiro, na Figura 3A, uma reconstrução que incluiu 86,6% das células incluídas nos dados iniciais é mostrada (509 de 588 células, temperatura inicial = 1, fator de iterações = 1, fator de aceitação = 1). Quando a temperatura inicial e os fatores de iteração e aceitação são aumentados (temperatura inicial = 10, fator de iterações = 5, e fator de aceitação = 5, Figura 3B), uma porcentagem maior (93,37%) das células iniciais foram incluídas nas ilhotas reconstruídas (ou seja, 549 de 588 células). Resultados ainda melhores podem ser obtidos se forem utilizados valores muito mais elevados, particularmente para os fatores de iteração e aceitação, conforme ilustrado na Figura 3C (temperatura inicial = 10, fator de iterações = 1000, fator de aceitação = 500), onde a ilhota reconstruída é composta por 99,15% das células iniciais (583 das 588 células). Os gráficos de convergência (coluna direita na Figura 3A-C), mostrando a evolução das células sobrepostas em função da temperatura, devem ser avaliados para determinar como os parâmetros afetam o processo de otimização. Como regra geral, os fatores de interação e aceitação devem ser aumentados quando a ilhota reconstruída inclui uma baixa porcentagem de células iniciais. Consequentemente, o tempo de computação inevitavelmente aumentará, uma vez que esses fatores aumentam diretamente o número de iterações avaliadas. Por exemplo, o tempo de computação da primeira reconstrução descrita acima foi de 6 s. Em contrapartida, os tempos computacionais da segunda e terceira reconstruções foram de 21 s e 24 min 6 s, respectivamente.
Figura 3: Reconstrução de ilhotas utilizando conjuntos subótimos de parâmetros nas configurações de reconstrução Usando conjuntos subótimos de parâmetros poderia levar a uma baixa porcentagem de células experimentais nas ilhotas reconstruídas. (A) Esquerda: 86,6% das células experimentais foram incluídas na ilhota reconstruída (temperatura inicial = 1, fator iterações = 1, fator de aceitação = 1, tempo de computação = 6 s). Direito: parcela de convergência do processo de reconstrução. (B) Esquerda: 93,4% das células experimentais foram incluídas na ilhota reconstruída (temperatura inicial = 10, fator de iterações = 10, fator de aceitação = 5, tempo de computação = 21 s). Direito: parcela de convergência do processo de reconstrução. (C) Esquerda: 99,15% das células experimentais foram incluídas na ilhota reconstruída (temperatura inicial = 10, fator de iterações = 1000, fator de aceitação = 500, tempo de computação = 24 min, 8 s). Direito: parcela de convergência do processo de reconstrução. As setas nos gráficos de convergência indicam o número inicial e final sobrepostas células do processo de reconstrução (antes da fase pós-processamento do algoritmo de reconstrução). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A identificação dos contatos célula-célula da ilhota reconstruída depende do valor do parâmetro de tolerância de contato (definido nos cenários de reconstrução) conforme ilustrado na Figura 4A-C, onde são apresentados os contatos célula-célula (representados por linhas pretas), identificados a partir das arquiteturas reconstruídas mostradas na Figura 3A-C. Por exemplo, se uma tolerância de contato de 1 μm for definida, como na Figura 4A, apenas 290 contatos célula-célula são identificados. Em contrapartida, se a tolerância ao contato for aumentada para 2 μm, como na Figura 4B,C, o total de contatos identificados aumentou para 636 e 731, respectivamente (ver o painel de estatísticas na Figura 4A-C). Essas diferenças também podem ser notadas na representação visual dos contatos célula-célula mostrados na coluna esquerda da Figura 4A-C, uma vez que o número de contatos entre as células aumenta claramente à medida que um valor mais elevado da tolerância ao contato é usado. Vale ressaltar que o número de contatos também depende do número de células incluídas nas ilhotas reconstruídas e, portanto, da combinação do parâmetro de temperatura, das iterações e fatores de aceitação e da tolerância ao contato, determinando, em última instância, a conectividade da ilhota reconstruída, que se reflete nas redes de ilhotas formadas e nas métricas de rede correspondentes, como mostrado na coluna direita da Figura 4A-C. O plot de rede permite que o usuário visualize como as diferentes células estão conectadas. Quantitativamente, as propriedades de conectividade da ilhota são descritas em termos das seguintes métricas de rede: grau médio, densidade, coeficiente médio de cluster, eficiência e diâmetro (detalhes sobre essas métricas podem ser consultados na seção 9 do Arquivo Suplementar 2).
Figura 4: Efeito do parâmetro de tolerância de contato na identificação de contatos célula-célula. (A-C) Esquerda: contatos célula-célula identificados a partir das ilhotas reconstruídas mostradas na Figura 3A-C (290, 636 e 731 contatos totais nos painéis A, B e C, respectivamente). Os valores utilizados para o parâmetro de tolerância ao contato foram de 1 μm (A) e 2 μm (B e C). Observe que o número de células incluídas nas ilhotas reconstruídas também afeta o número de contatos célula-célula identificados. À direita: as redes geradas a partir dos contatos célula-celular são mostradas na coluna esquerda correspondente. Note-se que o impacto da conectividade nas métricas de rede é destacado no painel de estatísticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Finalmente, uma vez que a ilhota tenha sido reconstruída e os contatos célula-célula tenham sido identificados, uma simulação funcional pode ser realizada (somente quando uma GPU compatível estiver disponível). Os resultados típicos de simulação são mostrados na Figura 5, incluindo as oscilações somadas das diferentes populações celulares (2, β e δ células) e toda a ilhota (parcela superior do painel gráfico na Figura 5). Este número mostra as diferenças de fase ao longo do tempo entre as diferentes populações celulares como resultado das propriedades de conectividade e interação e permite ao usuário determinar a contribuição de cada população celular (linhas vermelhas, verdes e azuis) para o comportamento oscilatório de toda a ilhota (linha preta). Por exemplo, o painel superior da Figura 5 sugere que, no nível populacional, as células β oscilam completamente fora de fase, enquanto as células δ oscilam fora de fase com células de β e β. Além disso, de acordo com a simulação, o comportamento oscilatório da ilhota é dominado pelas oscilações das células, embora o efeito das outras populações celulares também possa ser notado. Observe que os sinais oscilatórios de todas as células ilhotas são salvos automaticamente em um arquivo de dados (ver Tabela 1 e seção 13 em Arquivo Suplementar 2), permitindo assim que o usuário realize uma análise detalhada dos resultados da simulação. Como complemento, o índice de sincronização de ilhotas, que reflete a coerência de fase das oscilações, também é calculado e exibido (gráfico inferior do painel gráfico na Figura 5). Observe que o índice de sincronização varia de 0 a 1, onde 0 e 1 indicam uma sincronização nula e total entre todas as células da ilhota, respectivamente. O gráfico do índice de sincronização pode, portanto, ser interpretado como uma visualização de como a sincronicidade entre as células ilhotas varia ao longo do tempo como resultado das propriedades de conectividade e interação da ilhota reconstruída. Uma vez que a simulação realizada é baseada na ideia de osciladores acoplados12 e depende fortemente da conectividade da ilhota reconstruída, é fundamental para alcançar uma reconstrução aceitável de ilhotas e conectividade célula a célula antes de realizar uma simulação funcional.
Figura 5: Os parâmetros de simulação são definidos no painel de configuração da guia de simulação. Os resultados da simulação são mostrados na guia de simulação do painel gráfico onde o comportamento oscilatório somado das diferentes populações de células (exatamente, β e δ) e toda a ilhota são mostrados (topo). O índice de sincronização, uma medida de coerência de fase entre as células ilhotas, também é mostrado (inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vale ressaltar que praticamente em cada etapa do processo, os arquivos de dados são gerados. Uma descrição dos arquivos de dados gerados pode ser encontrada na Tabela 1 e em todo o Arquivo Suplementar 2.
| Arquivo | Descrição |
| IsletFileName | Dados de entrada (dados dados pelo usuário) |
| IsletFileName_initial.txt | Arquitetura ilhota inicial proposta pelo algoritmo como etapa inicial da reconstrução |
| IsletFileName_reconstructed.txt | Ilhota reconstruída (não posptrocessed) |
| IsletFileName_postprocessed_islet.txt | Ilhota reconstruída final e ilhota pós-pedóculo |
| IsletFileName_processlog.txt | Registro de reconstrução (algoritmo de otimização) |
| IsletFileName_overlapped_cells.txt | Células sobrepostas no final do processo de reconstrução (pós-processamento) |
| IsletFileName_all_contacts.txt | Matriz de adjancency de todos os contatos |
| IsletFileName_aa_contacts.txt | Matriz de adjancency de contatos |
| IsletFileName_ab_contacts.txt | Matriz de adjancency de contatos β |
| IsletFileName_ad_contacts.txt | Matriz de adjancency de contatos δ |
| IsletFileName_bbbd_contacts.txt | Matriz de adjancency de contatos β-β e δ β |
| IsletFileName_bb_contacts.txt | Matriz de adjancency de contatos β-β |
| IsletFileName_bd_contacts.txt | Matriz de adjancency de contatos β-δ |
| IsletFileName_dd_contacts.txt | Matriz de adjancency de contatos δ-δ |
| IsletFileName_Kmat.txt | Matriz de interação utilizada na simulação |
| IsletFileName_kuramoto_angles.txt | Resultados da simulação de Kuramoto |
Tabela 1: Descrição dos arquivos salvos como parte do arquivo do projeto. Observe que o nome do arquivo usado para salvar os arquivos do projeto são definidos automaticamente pelo arquivo de dados inicial selecionado pelo usuário.
Arquivo complementar 1: Descrição gráfica do protocolo usando os painéis de controle do IsletLab. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo complementar 2: Documentação do IsletLab. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo complementar 3: Inclui todos os arquivos necessários para instalar o IsletLab. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
O protocolo acima descreve uma abordagem prática para reconstruir e analisar arquiteturas de ilhotas pancreáticas usando novos algoritmos computacionais. O principal objetivo deste trabalho é permitir que a comunidade de pesquisa de ilhotas obtenha métricas quantitativas para caracterizar as propriedades morfológicas e conectividade das arquiteturas de ilhotas pancreáticas e avaliar as possíveis implicações funcionais dessas propriedades através de simulações computacionais.
Embora os algoritmos adotados neste protocolo tenham sido previamente descritos no detalhe12,19, uma implementação direta e fácil de usar foi carente devido à sua complexidade relativa, limitando assim seu uso como ferramenta complementar ao trabalho experimental e teórico.
Em primeiro lugar, um algoritmo recente proposto por Félix-Martínez et al.19 é usado para reconstruir as arquiteturas de ilhotas a partir de dados experimentais (por exemplo, coordenadas nucleares e tipo de célula). Como resultado, o usuário obtém uma arquitetura de ilhotas composta de células esféricas não sobrepostas com raios automaticamente atribuídos de acordo com as distribuições experimentais relatadas. Na prática, o algoritmo de reconstrução é um procedimento de otimização iterativo que se torna caro do ponto de vista computacional à medida que o número de células na ilhota aumenta. Por essa razão, é altamente recomendável usar um sistema multiprocessador para aproveitar a implementação paralela de processamento do algoritmo descrito neste protocolo. Como descrito acima, um passo fundamental para o processo de reconstrução é definir valores adequados para os parâmetros envolvidos (ou seja, iterações, fatores de aceitação e temperatura inicial), uma vez que o tempo de computação estará diretamente relacionado ao número de iterações realizadas, além do número de processos paralelos utilizados (ou seja, parâmetro de roscas nas configurações de reconstrução). Se o tempo de computação não for um problema, recomendamos fortemente o uso dos valores mais altos possíveis para as iterações e fatores de aceitação, a fim de aumentar o número de iterações realizadas.
Os próximos passos do protocolo são a identificação de contatos célula-celular e a geração da rede ilhota. Ambas as etapas estão diretamente relacionadas ao processo de reconstrução e, como tal, o número de células incluídas nas ilhotas reconstruídas (e, portanto, os parâmetros envolvidos), bem como o valor da tolerância ao contato utilizado, é fundamental para obter os melhores resultados possíveis.
Finalmente, se desejado pelo usuário, simulações funcionais podem ser realizadas através da implementação do modelo de osciladores acoplado proposto por Hoang et al.12 utilizando a rede de conectividade derivada do processo de reconstrução para configurar o sistema oscilatório. Dado que o processo de simulação envolve a resolução de um sistema de centenas ou milhares de equações diferenciais acopladas (uma para cada célula na ilhota), o algoritmo de simulação foi implementado aproveitando a possibilidade de realizar cálculos paralelos usando a GPU, permitindo assim que o usuário simule simulações longas consideráveis em um tempo de computação relativamente curto. As principais etapas da fase de simulação do protocolo são determinar o número adequado de blocos e threads disponíveis na seção de configurações da plataforma de computação do painel de simulação, um aspecto diretamente relacionado às características do hardware utilizado. Os outros parâmetros envolvidos (frequência intrínseca, fase inicial e força de interação no painel de simulação), embora relevantes para os resultados da simulação, estão principalmente relacionados ao problema em investigação e devem ser definidos pelo usuário após consideração atenciosa, a fim de representar o cenário de simulação desejado.
Apesar das vantagens oferecidas pelo protocolo, algumas limitações devem ser reconhecidas. Em primeiro lugar, os parâmetros relacionados ao processo de reconstrução e identificação dos contatos célula-celular não são únicos e podem variar de caso para caso. Por essa razão, embora uma regra de ouro possa ser usada para determinar o valor dos parâmetros necessários, uma abordagem de tentativa e erro ainda é inevitável. Outro aspecto que pode limitar a aplicabilidade do protocolo são os recursos computacionais necessários, particularmente para as etapas de reconstrução e simulação do protocolo. Apesar dessas limitações, o fato de que o conhecimento de programação não é necessário para a implementação do protocolo permite que pesquisadores de diversas origens façam uso dos algoritmos propostos que de outra forma permaneceriam obscuros para o usuário não especializado.
Os usos potenciais do protocolo proposto incluem a visualização de dados experimentais, análise comparativa de ilhotas normais e alteradas (por exemplo, na presença de diabetes tipo 1 ou 2), ou mesmo comparação entre ilhotas de diferentes espécies utilizando métricas quantitativas morfológicas, estruturais e baseadas em rede23. Além disso, ilhotas reconstruídas usando o protocolo aqui delineado podem ser prontamente utilizadas para gerar modelos matemáticos funcionais detalhados nos quais a conectividade e os tamanhos celulares determinados pelo algoritmo de reconstrução são complementados com modelos eletrofisiológicos detalhados de células pancreáticas para elucidar as implicações funcionais da comunicação intercelular dentro de ilhotas reconstruídas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
G.J. Félix-Martínez agradece ao CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) e ao Departamento de Engenharia Elétrica da Universidad Autónoma Metropolitana (Cidade do México) pelo apoio dado a este projeto. Agradecemos ao Dr. Danh-Tai Hoang, ao Dr. Manami Hara e ao Dr. Junghyo Jo pelo excelente trabalho e generosidade em compartilhar as arquiteturas de ilhotas que tornaram esse trabalho possível com a comunidade de pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUDA-capable NVIDIA graphics card | Required for the functional simulations | ||
| IsletLab | https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.) |
References
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