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Bioengineering

Computerrekonstruktion von Pankreasinseln als Werkzeug für die Struktur- und Funktionsanalyse

Published: March 9, 2022 doi: 10.3791/63351
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1Investigador por México (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México), , 2Department of Electrical Engineering, Universidad Autónoma Metropolitana

Summary

In diesem Protokoll werden die Pankreasinseln rekonstruiert und analysiert, indem Berechnungsalgorithmen verwendet werden, die in einer dedizierten Multiplattform-Anwendung implementiert sind.

Abstract

Strukturelle Eigenschaften von Pankreasinseln sind aufgrund ihrer Auswirkungen auf die intraisletale Kommunikation über elektrische, parakrine und autokrine Signalgebung der Schlüssel für die funktionelle Reaktion von Insulin-, Glucagon und Somatostatin-sezernierenden Zellen. In diesem Protokoll wird die dreidimensionale Architektur einer Pankreasinsel zunächst aus experimentellen Daten mit einem neuartigen Rechenalgorithmus rekonstruiert. Als nächstes werden die morphologischen und Konnektivitätseigenschaften der rekonstruierten Insel, wie die Anzahl und die Prozentsätze der verschiedenen Arten von Zellen, des Zellvolumens und der Zell-zu-Zell-Kontakte, erhalten. Dann wird die Netzwerktheorie verwendet, um die Konnektivitätseigenschaften der Insel durch vom Netzwerk abgeleitete Metriken wie Durchschnittsgrad, Clustering-Koeffizient, Dichte, Durchmesser und Effizienz zu beschreiben. Schließlich werden alle diese Eigenschaften funktional durch Computersimulationen unter Verwendung eines Modells gekoppelter Oszillatoren bewertet. Insgesamt beschreiben wir hier einen Schritt-für-Schritt-Workflow, der in IsletLab, einer Multiplattform-Anwendung, die speziell für die Untersuchung und Simulation von Pankreasinseln entwickelt wurde, implementiert wurde, um eine neuartige Berechnungsmethodik zur Charakterisierung und Analyse von Pankreasinseln als Ergänzung zur experimentellen Arbeit anzuwenden.

Introduction

Die Bauchspeicheldrüse ist in Regionen unterteilt, die als Kopf, Hals, Körper und Schwanz bezeichnet werden und jeweils unterschiedliche Strukturen, Funktionen und anatomische Positionenaufweisen 1,2. Aus funktioneller Sicht kann die Bauchspeicheldrüse in endokrine und exokrine Systeme unterteilt werden, wobei erstere für die Sekretion von Hormonen verantwortlich sind, die entscheidend an der Regulation der Glukosehomöostase beteiligt sind, während letzteres über die Sekretion von Enzymen in den Zwölffingerdarm1 zur Nahrungsverdauung beiträgt. Pankreasinseln bilden das endokrine Gewebe der Bauchspeicheldrüse und sind verantwortlich für die Sekretion von Glucagon, Insulin und Somatostatin, die aus ɑ-, β- bzw. δ-Zellen ausgeschiedenwerden 3. Zusätzlich zu ihren intrinsischen Regulationsmechanismen werden diese Zellen über direkte elektrische Kommunikation (zwischen β-Zellen und wahrscheinlichen β- und δ-Zellen) sowie durch parakrine und autokrine Signalgebung 4,5,6 reguliert. Beide Mechanismen hängen stark von der Inselarchitektur ab (d.h. von der Zusammensetzung und Organisation der verschiedenen Zelltypen innerhalb der Insel)7,8. Wichtig ist, dass die Inselarchitektur in Gegenwart von Diabetes verändert wird, was höchstwahrscheinlich die intrainselförmige Kommunikation als Folge von 9,10 stört.

Die Untersuchung von Pankreasinseln umfasst eine breite Palette von experimentellen Methoden. Unter diesen hat die Verwendung von Fluoreszenztechniken zur Bestimmung der Anzahl, Lage und Art der verschiedenen Zellen auf der Insel es ermöglicht, die strukturellen und morphologischen Eigenschaften der Pankreasinseln11,12,13 zu untersuchen und ein besseres Verständnis der funktionellen Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheit zu erlangen. Als Ergänzung wurden in den letzten Jahrzehnten Computermodelle der Pankreaszellen 14,15,16 und in jüngerer Zeit der Pankreasinseln12,17,18,19 verwendet, um Aspekte zu bewerten, die experimentell schwer oder gar unmöglich zu behandeln sind.

In diesem Protokoll wollen wir die Lücke zwischen experimenteller und computergestützter Arbeit schließen, indem wir eine Methodik zur Rekonstruktion von Inselarchitekturen, zur Analyse ihrer morphologischen und Konnektivitätseigenschaften durch quantitative Metriken und zur Durchführung grundlegender Simulationen zur Bewertung der funktionalen Auswirkungen der Inseleigenschaften skizzieren.

Das unten beschriebene Protokoll basiert auf Berechnungsalgorithmen, die speziell für die Untersuchung von Pankreasinseln entwickelt wurden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im ersten Schritt des Protokolls die Inselarchitektur aus experimentellen Daten unter Verwendung des kürzlich von Félix-Martínez et al.19 vorgeschlagenen Algorithmus rekonstruiert wird, in dem Kernpositionen durch 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Färbung und Zelltypen durch Immunfluoreszenz identifiziert werden (wie ausführlich beschrieben von Hoang et al.11,12 ) werden in einem iterativen Optimierungsverfahren verarbeitet. Dies führt dazu, die optimale Größe und Position jeder Zelle zu bestimmen und eine Insel zu erhalten, die aus nicht überlappenden Zellen besteht. Zweitens werden auf der Grundlage der rekonstruierten Architektur Zell-zu-Zell-Kontakte identifiziert, um die Konnektivitätseigenschaften zu bestimmen und das entsprechende Inselnetzwerk zu generieren, das es dem Benutzer ermöglicht, quantitative Metriken zu erhalten, um die Inselarchitektur weiter zu beschreiben (Details über den Rekonstruktionsalgorithmus können in der Originalarbeit zum Thema19 konsultiert werden). Schließlich werden grundlegende funktionelle Simulationen mit dem von Hoang et al.12 vorgeschlagenen Modellierungsansatz durchgeführt, bei dem basierend auf der pulsierenden Natur der experimentell beobachteten Hormonsekretion20,21 jede Zelle als Oszillator behandelt wird und daher die Insel als ein Netzwerk gekoppelter Oszillatoren dargestellt wird, die den Konnektivitätseigenschaften der rekonstruierten Insel folgen.

Angesichts der rechnerischen Komplexität der in diesem Protokoll verwendeten Algorithmen wurden alle beteiligten Schritte in einer eigenständigen Anwendung22 implementiert, mit dem Hauptziel, diese Rechenwerkzeuge allen interessierten Lesern unabhängig von ihrer Erfahrung in der Verwendung von spezialisierter Software oder Programmiersprachen zu nähern.

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Protocol

HINWEIS: Ein schematisches Diagramm des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung lautet wie folgt (siehe Zusatzdatei 1 für Details zu den Bedienfeldern, die bei jedem Schritt des Protokolls verwendet werden).

Figure 1
Abbildung 1: Flussdiagramm Ein Flussdiagramm, das die sequenzielle Reihenfolge des Protokolls beschreibt, wie es in IsletLab implementiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. IsletLab unter Linux installieren

HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen in den Abschnitten 2 und 3 der Zusatzdatei 2, um IsletLab unter Windows oder macOS zu installieren.

  1. Öffnen Sie einen Internetbrowser und gehen Sie zu https://github.com/gjfelix/IsletLab. Laden Sie die IsletLab-Repository-Dateien herunter und extrahieren Sie sie.
    HINWEIS: Die Zusatzdatei 3 enthält eine Kopie der Version von IsletLab, die in diesem Protokoll verwendet wird.
  2. Stellen Sie sicher, dass die gcc- und nvcc-Compiler installiert sind. Öffnen Sie ein Terminal und geben Sie die folgenden Befehle ein:
    GCC --Version
    nvcc --version
    Befolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 1 der Zusatzdatei 2, wenn einer dieser Befehle vom System nicht erkannt wird.
  3. Laden Sie die Data-Science-Plattform herunter und installieren Sie sie (siehe Materialverzeichnis). Öffnen Sie ein Terminal und gehen Sie zum Ordner IsletLab.
  4. Erstellen Sie eine neue Umgebung, indem Sie den folgenden Befehl in das Terminal eingeben:
    conda env create -f isletlabgui_v1.0.yml
  5. Aktivieren Sie die neue Umgebung, indem Sie Folgendes eingeben:
    conda aktivieren isletlab_v1.0
  6. Starten Sie die IsletLab-Anwendung, indem Sie den folgenden Befehl in das Terminal eingeben (siehe Abbildung 2 für eine Beschreibung des Hauptfensters):
    Python isletlabgui_v1.0.py

Figure 2
Abbildung 2: Die Benutzeroberfläche von IsletLab. Die Benutzeroberfläche besteht aus drei Hauptbereichen: Konfigurations- (1), Statistik- (2) und Grafikfelder (3). Die Grafiksymbolleiste (4) befindet sich am unteren Rand des Grafikbedienfelds. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Wiederaufbau der Insel

  1. Bereiten Sie die Eingabedaten vor. Organisieren Sie die eingegebenen Inseldaten (d. h. Zelltypen und dreidimensionale (3D) Koordinaten) in einer vierspaltigen Datei, in der Spalte 1 den Zelltyp enthält (codiert als 11: ɑ-cell, 12: β-cell, 13: δ-cell) und die Spalten 2 bis 4 die x-, y- bzw. z-Koordinaten enthalten (siehe einen Auszug aus einer Eingabedatei in Abschnitt 5 der Zusatzdatei 2 oder der Eingabetestdatei, die im IsletLab-Repository enthalten ist).
  2. Stellen Sie sicher, dass die Eingabedatei keine Spaltenüberschriften enthält. Verwenden Sie die im IsletLab-Repository enthaltene Beispieleingabedatei, um bei Bedarf dem Protokoll zu folgen (Input_Islet_test.txt).
    HINWEIS: Eingabedaten, die zur Entwicklung der in IsletLab implementierten Algorithmen verwendet wurden, wurden experimentell erhalten, wie von Hoang et al.11,12 detailliert beschrieben, wobei die DAPI-Färbung zur Bestimmung der Kernpositionen und die Immunfluoreszenz zur Identifizierung der Zelltypen verwendet wurden.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erste Insel laden (Load Initial Islet ) und wählen Sie die Datei mit den Eingabedaten aus, um eine erste Insel, die 3D-Darstellung und die entsprechenden Statistiken zu generieren. Im Fehlerfall wird die folgende Meldung angezeigt: 'Fehler beim Laden der Inseldatei'. Um dies zu beheben, wiederholen Sie Schritt 2.1.
  4. Konfigurieren Sie den Rekonstruktionsprozess. Klicken Sie auf die Schaltfläche Rekonstruktionseinstellungen und ändern Sie die Optimierungsparameter (siehe Abschnitte 4 und 5 der Zusatzdatei 2 für eine kurze Beschreibung des Algorithmus und der im Fenster Rekonstruktionseinstellungen angezeigten Parameter).
  5. Legen Sie die Anfangstemperatur = 1, den Iterationsfaktor = 1 und den Akzeptanzfaktor = 1 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Parameterwerte zu speichern.
    HINWEIS: Als Faustregel gilt, dass eine Erhöhung des Temperaturparameters sowie der Iterationen und Akzeptanzfaktoren zu besseren Rekonstruktionsergebnissen in Bezug auf die experimentellen Zellen führt, die in der rekonstruierten Insel enthalten sind, auf Kosten einer Erhöhung der Rechenzeit.
  6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Insel rekonstruieren, um das Fenster des Rekonstruktionsprotokolls zu öffnen (eine Beschreibung der im Rekonstruktionsprotokoll enthaltenen Informationen finden Sie in Abschnitt 6 der Zusatzdatei 2).
  7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um den Rekonstruktionsprozess zu starten. Überwachen Sie den Optimierungsprozess, bis die Meldung "Bitte schließen Sie dieses Fenster, um fortzufahren" angezeigt wird. Schließen Sie das Fenster des Rekonstruktionsprotokolls, um die visuelle Darstellung der rekonstruierten Insel zu generieren und die zugehörigen Statistiken zu berechnen (siehe linke Spalte in Abbildung 3A-C).
  8. Bewerten Sie die Ergebnisse des Rekonstruktionsprozesses, indem Sie die Optimierungsstatistiken analysieren, die auf der letzten Registerkarte "Insel" des Statistikbereichs angezeigt werden. Konzentrieren Sie sich insbesondere auf die Maximierung des Prozentsatzes der experimentellen Zellen, die in den rekonstruierten Inseln enthalten sind (% der experimentellen) oder gleichwertig, auf die Minimierung der Anzahl der Überlappungen (auch grafisch im Konvergenzdiagramm dargestellt, rechte Spalte in Abbildung 3A-C).
  9. Wenn der Prozentsatz der experimentellen Statistik gemäß den Benutzerzielen als niedrig angesehen wird, starten Sie IsletLab wie in Schritt 9.1 beschrieben neu und erhöhen Sie die Anfangstemperatur, den Iterationsfaktor und den Akzeptanzfaktor in den Rekonstruktionseinstellungen und wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4, bis zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden (> 95% der Versuchszellen). Siehe Abschnitte 5-7 der Zusatzakte 2 für eine weitere Beschreibung des Wiederaufbauprozesses und der damit verbundenen Ergebnisse.

3. Identifizierung von Zell-zu-Zell-Kontakten

  1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Rekonstruktionseinstellungen , und legen Sie den Parameter Kontakttoleranz fest, um die Kontakttoleranz von Zelle zu Zelle zu definieren, und klicken Sie auf OK, um die Parameterwerte zu speichern.
    HINWEIS: Der Kontakttoleranzparameter stellt den maximalen Abstand zwischen den Zellen dar, um als in Kontakt betrachtet zu werden.
  2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zell-zu-Zell-Kontakte, um die Zellen in engem Kontakt zu identifizieren. Suchen Sie auf der Registerkarte Kontakte nach Zellen im Kontakt, die grafisch (schwarze Linien) im Grafikfeld angezeigt werden, und nach den entsprechenden Statistiken (d. h. gesamte, homotypische und heterotypische Kontakte und ɑ-ɑ, β-β, δ-δ, ɑ-β, ɑ-δ, β-δ Kontakte), die im Statistikbereich angezeigt werden (siehe linke Spalte von Abbildung 4A-C).
  3. Erhöhen (verringern) Sie den Kontakttoleranzparameter, um die Anzahl der Kontakte von Zelle zu Zelle zu erhöhen (zu verringern). Einzelheiten zur Identifizierung von Zell-zu-Zell-Kontakten und den damit verbundenen Ergebnissen finden Sie in Abschnitt 8 der Zusatzakte 2.

4. Aufbau des Inselnetzes

  1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Netzwerk erstellen, um das Inselnetzwerk zu generieren und die zugehörigen Netzwerkmetriken zu berechnen (siehe rechte Spalte in Abbildung 4A-C).
    HINWEIS: Eine weitere Beschreibung der Ergebnisse im Zusammenhang mit dem generierten Inselnetz finden Sie in Abschnitt 9 der Zusatzdatei 2.

5. Funktionale Simulation der rekonstruierten Insel

  1. Wechseln Sie zur Registerkarte Simulation des Konfigurationsfensters der Schnittstelle (Abbildung 5).
  2. Wählen Sie den gewünschten Modus der Eigenfrequenz - Konstant oder Zufall - und klicken Sie auf die Schaltfläche Intrinsische Frequenz konfigurieren , um die Oszillatorfrequenz (in Hz) zu definieren. Wenn eine zufällige Eigenfrequenz ausgewählt wird, definieren Sie den Mittelwert und die Abweichung (in Hz), um normalverteilte Zufallsfrequenzen zu erzeugen (siehe Abschnitt 11 der Ergänzungsdatei 2 für eine Beschreibung der Simulationsparameter).
  3. Wählen Sie den gewünschten Modus der Anfangsphase - Konstant oder Zufällig. Wenn eine konstante Anfangsphase ausgewählt ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Anfangsphase konfigurieren , um die Phase der Oszillatoren (im Bogenmaß) zu definieren. Wenn die zufällige Anfangsphase ausgewählt ist, weist das System allen Oszillatoren zufällige Phasen zwischen 0 und 2π zu.
    HINWEIS: Wenn eine konstante Anfangsphase ausgewählt ist, werden alle Oszillatoren in Phase initialisiert.
  4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Interaktionen konfigurieren , um die Interaktionsparameter von Zelle zu Zelle im Fenster Interaktionsstärke zu definieren. Eine Beschreibung der Interaktionsparameter finden Sie in Abschnitt 11 der Zusatzdatei 2.
  5. Konfigurieren Sie die Simulation, indem Sie die Gesamtsimulationszeit (in s), den Zeitschritt (in s) und den Sparfaktor (Anzahl der Schritte zwischen gespeicherten Datenpunkten) definieren. In der in Abbildung 5 gezeigten Simulation betrug die Gesamtzeit 20000 s, mit einem Zeitschritt von 0,1 s und einem Einsparfaktor von 500.
  6. Definieren Sie die Anzahl der Blöcke, Threads und Rechenplattformfunktionen, die für die Durchführung der Simulation verfügbar sind. Definieren Sie diese Parameter in Übereinstimmung mit den spezifischen Eigenschaften der verfügbaren Grafikprozessoreinheit (GPU).
    HINWEIS: Im Beispiel in Abbildung 5 wurden 36 Blöcke und 64 Threads pro Block (2304 Computing-Plattform-Kerne) verwendet, da eine GPU mit 36 Multiprozessoren und 64 Computing-Plattform-Kernen pro Multiprozessor verwendet wurde. Der Wert des verwendeten Parameters für die Rechenplattform betrug 75, da die Hardware-Computing-Plattform-Fähigkeit 7,5 betrug (Einzelheiten zu diesen Parametern finden Sie in Abschnitt 10 der Zusatzdatei 2).
  7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Simulation ausführen, um das Fenster Simulationsprotokoll zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Simulation zu starten und den Prozess zu überwachen, bis die Legende "Bitte schließen Sie das Fenster, um fortzufahren" angezeigt wird. Einzelheiten zum Simulationsprotokoll finden Sie in Abschnitt 12 der Zusatzdatei 2.
  8. Schließen Sie das Fenster Simulationsprotokoll, um die Simulationsergebnisse zu beobachten (siehe Abbildung 5). Einzelheiten zu den Simulationsergebnissen sind in Abschnitt 13 der Ergänzungsdatei 2 enthalten.

6. Speichern Sie das Projekt (optional)

  1. Klicken Sie in der Menüleiste auf Datei > Projekt exportieren. Wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem die Projektdatei gespeichert werden soll, und klicken Sie auf die Schaltfläche OK.
    HINWEIS: Der Name der Projektdatei wird automatisch anhand des Namens der ursprünglichen Datendatei ermittelt. Wenn das Projekt nicht gespeichert wird, werden alle Ergebnisse und zugehörigen Dateien automatisch gelöscht.
  2. Laden Sie ein exportiertes Projekt, indem Sie auf Datei > Projekt laden klicken.

7. Zahlen speichern (optional)

  1. Klicken Sie in der Plotsymbolleiste auf das Symbol "Handlung speichern", um die aktuelle Visualisierung in einer Bilddatei zu speichern. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Zahlen, die im Protokoll erstellt werden.
    HINWEIS: Plots und Inselvisualisierungen können mit den Symbolen geändert werden, die in der Plotsymbolleiste des Grafikbedienfelds verfügbar sind.

8. Projekt laden (optional)

  1. Klicken Sie im Hauptmenü auf Datei > Projekt laden , und wählen Sie eine zuvor gespeicherte Projektdatei aus, wie in den Schritten 6.1-6.2 beschrieben.
    HINWEIS: Ein Projekt wird nicht korrekt geladen, wenn die Projektdatei extern geändert wurde. Wenn ein Projekt erfolgreich geladen wurde, stehen nur die Simulationsfunktionen zur Verfügung.

9. Starten Sie den Rekonstruktionsprozess und die Analyse neu (optional)

  1. Der Benutzer kann jederzeit Datei > Neustart auswählen, um alle Ergebnisse zu verwerfen und eine neue Rekonstruktion und Analyse zu starten.

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Representative Results

Die Rekonstruktion von Pankreasinseln mit der von Félix-Martínez et al.19 vorgeschlagenen Methodik hängt stark von den Parametern ab, die dem Optimierungsalgorithmus (definiert in den Rekonstruktionseinstellungen) gegeben werden. Ein Beispiel dafür ist visuell in Abbildung 3 dargestellt, wo rekonstruierte Inselchen, die mit verschiedenen Parametersätzen erhalten wurden, gezeigt werden. Erstens wird in Abbildung 3A eine Rekonstruktion gezeigt, die 86,6% der in den Anfangsdaten enthaltenen Zellen umfasste (509 von 588 Zellen, Anfangstemperatur = 1, Iterationsfaktor = 1, Akzeptanzfaktor = 1). Wenn die Anfangstemperatur und die Iterations- und Akzeptanzfaktoren erhöht werden (Anfangstemperatur = 10, Iterationsfaktor = 5 und Akzeptanzfaktor = 5, Abbildung 3B), wurde ein höherer Prozentsatz (93,37%) der Anfangszellen wurden in die rekonstruierten Inseln einbezogen (d. h. 549 von 588 Zellen). Noch bessere Ergebnisse können erzielt werden, wenn viel höhere Werte verwendet werden, insbesondere für die Iterations- und Akzeptanzfaktoren, wie in Abbildung 3C dargestellt (Anfangstemperatur = 10, Iterationsfaktor = 1000, Akzeptanzfaktor = 500), wobei die rekonstruierte Insel aus 99,15% der Anfangszellen besteht (583 von 588 Zellen). Die Konvergenzdiagramme (rechte Spalte in Abbildung 3A-C), die die Entwicklung überlappender Zellen als Funktion der Temperatur zeigen, müssen ausgewertet werden, um zu bestimmen, wie sich die Parameter auf den Optimierungsprozess auswirken. Als Faustregel gilt, dass die Interaktions- und Akzeptanzfaktoren erhöht werden müssen, wenn die rekonstruierte Insel einen geringen Prozentsatz an Anfangszellen enthält. Folglich wird die Rechenzeit unweigerlich zunehmen, da diese Faktoren die Anzahl der ausgewerteten Iterationen direkt erhöhen. Zum Beispiel betrug die Rechenzeit der ersten oben beschriebenen Rekonstruktion 6 s. Im Gegensatz dazu betrugen die Rechenzeiten der zweiten und dritten Rekonstruktion 21 s bzw. 24 min 6 s.

Figure 3
Abbildung 3: Inselrekonstruktion unter Verwendung suboptimaler Parametersätze in den Rekonstruktionseinstellungen Die Verwendung suboptimaler Parametersätze könnte zu einem geringen Prozentsatz an experimentellen Zellen in den rekonstruierten Inseln führen. (A) Links: 86,6% der experimentellen Zellen wurden in die rekonstruierte Insel einbezogen (Anfangstemperatur = 1, Iterationsfaktor = 1, Akzeptanzfaktor = 1, Rechenzeit = 6 s). Rechts: Konvergenzdiagramm des Wiederaufbauprozesses. (B) Links: 93,4% der experimentellen Zellen wurden in die rekonstruierte Insel einbezogen (Anfangstemperatur = 10, Iterationsfaktor = 10, Akzeptanzfaktor = 5, Rechenzeit = 21 s). Rechts: Konvergenzdiagramm des Wiederaufbauprozesses. (C) Links: 99,15% der experimentellen Zellen wurden in die rekonstruierte Insel einbezogen (Anfangstemperatur = 10, Iterationsfaktor = 1000, Akzeptanzfaktor = 500, Rechenzeit = 24 min, 8 s). Rechts: Konvergenzdiagramm des Wiederaufbauprozesses. Die Pfeile in den Konvergenzdiagrammen zeigen die anfängliche und letzte Anzahl überlappender Zellen des Rekonstruktionsprozesses (vor der Nachbearbeitungsphase des Rekonstruktionsalgorithmus). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Identifizierung von Zell-zu-Zell-Kontakten von der rekonstruierten Insel hängt vom Wert des Kontakttoleranzparameters (definiert in den Rekonstruktionseinstellungen) ab, wie in Abbildung 4A-C dargestellt, wo die Zell-zu-Zell-Kontakte (dargestellt durch schwarze Linien), die aus den in Abbildung 3A-C gezeigten rekonstruierten Architekturen identifiziert wurden, dargestellt werden. Wenn beispielsweise eine Kontakttoleranz von 1 μm definiert wird, wie in Abbildung 4A, werden nur 290 Zell-zu-Zell-Kontakte identifiziert. Wenn dagegen die Kontakttoleranz auf 2 μm erhöht wird, wie in Abbildung 4B,C, stiegen die identifizierten Gesamtkontakte auf 636 bzw. 731 (siehe Statistikbereich in Abbildung 4A-C). Diese Unterschiede zeigen sich auch in der visuellen Darstellung der Zell-zu-Zell-Kontakte, die in der linken Spalte von Abbildung 4A-C gezeigt werden, da die Anzahl der Kontakte zwischen den Zellen deutlich zunimmt, wenn ein höherer Wert der Kontakttoleranz verwendet wird. Es ist erwähnenswert, dass die Anzahl der Kontakte auch von der Anzahl der Zellen abhängt, die in den rekonstruierten Inseln enthalten sind, und daher bestimmt die Kombination des Temperaturparameters, der Iterationen und Akzeptanzfaktoren sowie der Kontakttoleranz letztendlich die Konnektivität der rekonstruierten Insel, die sich in den gebildeten Inselnetzwerken und den entsprechenden Netzwerkmetriken widerspiegelt. wie in der rechten Spalte von Abbildung 4A-C dargestellt. Das Netzwerkdiagramm ermöglicht es dem Benutzer, zu visualisieren, wie die verschiedenen Zellen verbunden sind. Quantitativ werden die Konnektivitätseigenschaften der Insel anhand der folgenden Netzwerkmetriken beschrieben: durchschnittlicher Grad, Dichte, durchschnittlicher Clustering-Koeffizient, Effizienz und Durchmesser (Einzelheiten zu diesen Metriken können in Abschnitt 9 der Zusatzdatei 2 eingesehen werden).

Figure 4
Abbildung 4: Einfluss des Kontakttoleranzparameters bei der Identifizierung von Zell-zu-Zell-Kontakten. (A-C) Links: Zell-zu-Zell-Kontakte, die von den in Abbildung 3A-C gezeigten rekonstruierten Inseln identifiziert wurden (290, 636 und 731 Gesamtkontakte in den Feldern A, B bzw. C). Die für den Kontakttoleranzparameter verwendeten Werte waren 1 μm (A) und 2 μm (B und C). Beachten Sie, dass die Anzahl der Zellen, die in den rekonstruierten Inseln enthalten sind, auch die Anzahl der identifizierten Zell-zu-Zell-Kontakte beeinflusst. Rechts: Netzwerke, die aus den Zell-zu-Zell-Kontakten generiert werden, werden in der entsprechenden linken Spalte angezeigt. Beachten Sie, dass die Auswirkungen der Konnektivität auf die Netzwerkmetriken im Statistikbereich hervorgehoben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Sobald die Insel rekonstruiert und die Zell-zu-Zell-Kontakte identifiziert wurden, kann eine Funktionssimulation durchgeführt werden (nur wenn eine kompatible GPU verfügbar ist). Typische Simulationsergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt, einschließlich der summierten Schwingungen der verschiedenen Zellpopulationen (ɑ, β und δ-Zellen) und der gesamten Insel (oberes Diagramm des Grafikfelds in Abbildung 5). Diese Abbildung zeigt die Phasenunterschiede im Laufe der Zeit zwischen den verschiedenen Zellpopulationen als Ergebnis der Konnektivitäts- und Interaktionseigenschaften und ermöglicht es dem Benutzer, den Beitrag jeder Zellpopulation (rote, grüne und blaue Linien) zum oszillierenden Verhalten der gesamten Insel (schwarze Linie) zu bestimmen. Zum Beispiel deutet die obere Abbildung 5 darauf hin, dass auf der Populationsebene ɑ- und β-Zellen vollständig phasenverschoben oszillieren, während δ-Zellen mit ɑ- und β-Zellen aus der Phase oszillieren. Darüber hinaus wird laut Simulation das Schwingungsverhalten der Insel von den Schwingungen der ɑ-Zellen dominiert, obwohl auch die Wirkung der anderen Zellpopulationen bemerkt werden kann. Beachten Sie, dass die Schwingungssignale aller Inselzellen automatisch in einer Datendatei gespeichert werden (siehe Tabelle 1 und Abschnitt 13 in der Zusatzdatei 2), so dass der Benutzer eine detaillierte Analyse der Simulationsergebnisse durchführen kann. Als Ergänzung wird auch der Inselsynchronisationsindex berechnet und angezeigt, der die Phasenkohärenz der Schwingungen widerspiegelt (unteres Diagramm des Grafikfelds in Abbildung 5). Beachten Sie, dass der Synchronisationsindex zwischen 0 und 1 liegt, wobei 0 und 1 eine Null- bzw. Gesamtsynchronisation zwischen allen Zellen auf der Insel anzeigen. Das Synchronisationsindexdiagramm kann daher als Visualisierung interpretiert werden, wie sich die Synchronizität zwischen Inselzellen im Laufe der Zeit aufgrund der Konnektivitäts- und Interaktionseigenschaften der rekonstruierten Insel ändert. Da die durchgeführte Simulation auf der Idee der gekoppelten Oszillatoren12 basiert und stark von der Konnektivität der rekonstruierten Insel abhängt, ist es wichtig, eine akzeptable Inselrekonstruktion und Zell-zu-Zell-Konnektivität zu erreichen, bevor eine Funktionssimulation durchgeführt wird.

Figure 5
Abbildung 5: Die Simulationsparameter werden im Konfigurationsfenster der Registerkarte Simulation definiert. Die Ergebnisse der Simulation werden auf der Registerkarte Simulation des Grafikfelds angezeigt, wo das summierte oszillierende Verhalten der verschiedenen Zellpopulationen (ɑ, β und δ) und der gesamten Insel (oben) angezeigt wird. Der Synchronisationsindex, ein Maß für die Phasenkohärenz zwischen den Inselzellen, ist ebenfalls dargestellt (unten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Es ist erwähnenswert, dass praktisch bei jedem Schritt des Prozesses Datendateien generiert werden. Eine Beschreibung der generierten Datendateien finden Sie in Tabelle 1 und in der gesamten Zusatzdatei 2.

Datei Beschreibung
IsletFileName Eingabedaten (vom Benutzer angegeben)
IsletFileName_initial.txt Anfängliche Inselarchitektur, die vom Algorithmus als erster Schritt der Rekonstruktion vorgeschlagen wird
IsletFileName_reconstructed.txt Rekonstruierte Insel (nicht posptrocessed)
IsletFileName_postprocessed_islet.txt Endgültig rekonstruierte Insel und postrozessive Insel
IsletFileName_processlog.txt Rekonstruktionsprotokoll (Optimierungsalgorithmus)
IsletFileName_overlapped_cells.txt Überlappende Zellen am Ende des Rekonstruktionsprozesses (Postprocessing)
IsletFileName_all_contacts.txt Adjanzenzmatrix aller Kontakte
IsletFileName_aa_contacts.txt Adjanzenzmatrix von ɑ-ɑ-Kontakten
IsletFileName_ab_contacts.txt Adjanzenzmatrix von ɑ-β Kontakten
IsletFileName_ad_contacts.txt Adjanzenzmatrix von ɑ-δ Kontakten
IsletFileName_bbbd_contacts.txt Adjanzenzmatrix von β-β- und β-δ-Kontakten
IsletFileName_bb_contacts.txt Adjanzenzmatrix von β-β Kontakten
IsletFileName_bd_contacts.txt Adjanzenzmatrix von β-δ Kontakten
IsletFileName_dd_contacts.txt Adjanzenzmatrix von δ-δ Kontakten
IsletFileName_Kmat.txt In der Simulation verwendete Interaktionsmatrix
IsletFileName_kuramoto_angles.txt Ergebnisse der Kuramoto-Simulation

Tabelle 1: Beschreibung der Dateien, die als Teil der Projektdatei gespeichert wurden. Beachten Sie, dass der zum Speichern der Projektdateien verwendete Dateiname automatisch durch die vom Benutzer ausgewählte Ausgangsdatendatei definiert wird.

Zusatzakte 1: Grafische Beschreibung des Protokolls über die Bedienfelder von IsletLab. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsakte 2: IsletLab-Dokumentation. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsakte 3: Enthält alle Dateien, die für die Installation von IsletLab erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Das obige Protokoll skizziert einen praktischen Ansatz zur Rekonstruktion und Analyse von Pankreasinselarchitekturen unter Verwendung neuartiger Berechnungsalgorithmen. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, die Inselforschungsgemeinschaft in die Lage zu versetzen, quantitative Metriken abzuleiten, um die morphologischen und Konnektivitätseigenschaften von Pankreasinselarchitekturen zu charakterisieren und die möglichen funktionalen Implikationen solcher Eigenschaften durch computergestützte Simulationen zu bewerten.

Während die in diesem Protokoll verwendeten Algorithmen zuvor ausführlich beschrieben wurden12,19, fehlte aufgrund ihrer relativen Komplexität eine direkte und benutzerfreundliche Implementierung, wodurch ihre Verwendung als ergänzendes Werkzeug zur experimentellen und theoretischen Arbeit eingeschränkt wurde.

Erstens wird ein kürzlich von Félix-Martínez et al.19 vorgeschlagener Algorithmus verwendet, um die Inselarchitekturen aus experimentellen Daten (z. B. Kernkoordinaten und Zelltyp) zu rekonstruieren. Als Ergebnis erhält der Benutzer eine Inselarchitektur, die aus nicht überlappenden sphärischen Zellen besteht, deren Radien automatisch gemäß den berichteten experimentellen Verteilungen zugewiesen werden. In der Praxis ist der Rekonstruktionsalgorithmus ein iteratives Optimierungsverfahren, das aus rechnerischer Sicht teuer wird, wenn die Anzahl der Zellen auf der Insel zunimmt. Aus diesem Grund wird dringend empfohlen, ein Multiprozessorsystem zu verwenden, um die Vorteile der parallelen Verarbeitungsimplementierung des in diesem Protokoll beschriebenen Algorithmus zu nutzen. Wie oben beschrieben, besteht ein wichtiger Schritt für den Rekonstruktionsprozess darin, geeignete Werte für die beteiligten Parameter (d. h. Iterationen, Akzeptanzfaktoren und Anfangstemperatur) zu definieren, da die Rechenzeit zusätzlich zur Anzahl der verwendeten parallelen Prozesse (d. h. Threads-Parameter in den Rekonstruktionseinstellungen) direkt mit der Anzahl der durchgeführten Iterationen zusammenhängt. Wenn die Rechenzeit kein Problem darstellt, empfehlen wir dringend, die höchstmöglichen Werte für die Iterationen und Akzeptanzfaktoren zu verwenden, um die Anzahl der durchgeführten Iterationen zu erhöhen.

Die nächsten Schritte des Protokolls sind die Identifizierung von Zell-zu-Zell-Kontakten und die Generierung des Inselnetzes. Beide Schritte stehen in direktem Zusammenhang mit dem Rekonstruktionsprozess, und daher ist die Anzahl der Zellen, die in den rekonstruierten Inseln enthalten sind (und damit die beteiligten Parameter), sowie der Wert der verwendeten Kontakttoleranz der Schlüssel, um die bestmöglichen Ergebnisse zu erzielen.

Schließlich können auf Wunsch des Benutzers funktionale Simulationen durch die Implementierung des von Hoang et al.12 vorgeschlagenen Modells gekoppelter Oszillatoren unter Verwendung des aus dem Rekonstruktionsprozess abgeleiteten Konnektivitätsnetzwerks zur Konfiguration des Oszillatorsystems durchgeführt werden. Da der Simulationsprozess die Lösung eines Systems von Hunderten oder Tausenden von gekoppelten Differentialgleichungen (eine für jede Zelle auf der Insel) beinhaltet, wurde der Simulationsalgorithmus implementiert, wobei die Möglichkeit genutzt wurde, parallele Berechnungen mit der GPU durchzuführen, so dass der Benutzer beträchtliche lange Simulationen in einer relativ kurzen Rechenzeit simulieren kann. Die wichtigsten Schritte in der Simulationsphase des Protokolls bestehen darin, die entsprechende Anzahl von Blöcken und Threads zu bestimmen, die im Abschnitt "Computerplattformeinstellungen" des Simulationspanels verfügbar sind, ein Aspekt, der in direktem Zusammenhang mit den Eigenschaften der verwendeten Hardware steht. Die anderen beteiligten Parameter (Eigenfrequenz, Anfangsphase und Interaktionsstärken im Simulationspanel) sind zwar für die Simulationsergebnisse relevant, beziehen sich aber hauptsächlich auf das untersuchte Problem und müssen vom Anwender nach sorgfältiger Überlegung definiert werden, um das gewünschte Simulationsszenario darzustellen.

Trotz der Vorteile, die das Protokoll bietet, müssen einige Einschränkungen anerkannt werden. Erstens sind die Parameter im Zusammenhang mit dem Rekonstruktionsprozess und der Identifizierung der Zell-zu-Zell-Kontakte nicht eindeutig und können von Fall zu Fall variieren. Aus diesem Grund kann zwar eine Faustregel verwendet werden, um den Wert der erforderlichen Parameter zu bestimmen, ein Trial-and-Error-Ansatz ist jedoch immer noch unvermeidlich. Ein weiterer Aspekt, der die Anwendbarkeit des Protokolls einschränken könnte, sind die erforderlichen Rechenressourcen, insbesondere für die Rekonstruktions- und Simulationsphasen des Protokolls. Trotz dieser Einschränkungen ermöglicht die Tatsache, dass Programmierkenntnisse für die Implementierung des Protokolls nicht erforderlich sind, Forschern mit unterschiedlichem Hintergrund, die vorgeschlagenen Algorithmen leicht zu nutzen, die sonst für den nicht spezialisierten Benutzer im Dunkeln bleiben würden.

Zu den möglichen Anwendungen des vorgeschlagenen Protokolls gehören die Visualisierung experimenteller Daten, die vergleichende Analyse normaler und veränderter Inseln (z. B. bei Typ-1- oder Typ-2-Diabetes) oder sogar der Vergleich zwischen Inseln verschiedener Arten unter Verwendung quantitativer morphologischer, struktureller und netzwerkbasierter Metriken23. Darüber hinaus können rekonstruierte Inseln, die das hier beschriebene Protokoll verwenden, leicht verwendet werden, um detaillierte funktionale mathematische Modelle zu erzeugen, in denen die durch den Rekonstruktionsalgorithmus bestimmten Konnektivität und Zellgrößen durch detaillierte elektrophysiologische Modelle von Pankreaszellen ergänzt werden, um die funktionellen Implikationen der interzellulären Kommunikation innerhalb rekonstruierter Inseln aufzuklären.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

G.J. Félix-Martínez dankt CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, Mexiko) und der Abteilung für Elektrotechnik der Universidad Autónoma Metropolitana (Mexiko-Stadt) für die Unterstützung dieses Projekts. Wir danken Dr. Danh-Tai Hoang, Dr. Manami Hara und Dr. Junghyo Jo für ihre hervorragende Arbeit und Großzügigkeit beim Teilen der Inselarchitekturen, die diese Arbeit mit der Forschungsgemeinschaft ermöglicht haben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CUDA-capable NVIDIA graphics card Required for the functional simulations
IsletLab https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.)

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References

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Bioengineering Ausgabe 181
Computerrekonstruktion von Pankreasinseln als Werkzeug für die Struktur- und Funktionsanalyse
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Félix-Martínez, G. J., Nicolás-Mata, A., Godínez-Fernández, J. R. Computational Reconstruction of Pancreatic Islets as a Tool for Structural and Functional Analysis. J. Vis. Exp. (181), e63351, doi:10.3791/63351 (2022).

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