Summary
هنا ، نصف بروتوكولا لعزل كمية كافية من الخلايا العضلية غير القلبية المفردة ذات الصلاحية العالية من قلب الفأر بعد احتشاء عضلة القلب (MI). يمكن استخدام هذا لتسلسل الخلية الواحدة اللاحق ، وتحليل قياس التدفق الخلوي ، وزراعة الخلايا الأولية.
Abstract
احتشاء عضلة القلب (MI) هو واحد من أكثر أمراض القلب والأوعية الدموية شيوعا ، مع زيادة معدل الوفيات في جميع أنحاء العالم. تمثل الخلايا غير القلبية أكثر من نصف إجمالي عدد خلايا القلب ، وتساهم في التعويضات التكيفية عند إصابة عضلة القلب ، بما في ذلك الاستجابات الالتهابية وإصلاح الأنسجة وتشكيل الندبات. لدراسة البيئة المكروية القلبية بعد MI ، يستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) على نطاق واسع لتحديد أنواع خلايا القلب المختلفة والاتصالات بين الخلايا. من بين إجراءات تحضير عينة scRNA-seq ، يعد تحضير تعليق الخلية أحد أهم الخطوات ، لأن صلاحية الخلية يمكن أن تؤثر على جودة نتائج scRNA-seq. لذلك ، قمنا بتصميم بروتوكول تجريبي لإعداد تعليق الخلايا غير القلبية من قلوب الفئران بعد MI مع التركيز الإضافي على تحسين صلاحية الخلية عن طريق اختيار إنزيمات هضمية خفيفة ، والتحكم في وقت الهضم ، وتطبيق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS). أخيرا ، قمنا بعزل خلايا CD45 + من تعليق الخلايا غير القلبية التي تم الحصول عليها من خلال هذا البروتوكول ، ثم أجرينا scRNA-seq.
Introduction
احتشاء عضلة القلب (MI) هو واحد من أكثر أمراض القلب والأوعية الدموية شيوعا ، ويزداد معدل الوفيات في جميع أنحاء العالم1. يحدث MI بسبب عدم كفاية إمدادات الدم إلى عضلة القلب المحيطة ، والتي يمكن أن تكون نتيجة لانسداد الشريان التاجي الذي يحدث مع تمزق لوحة تصلب الشرايين. على الرغم من أن التدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI) قد قلل من معدلات وفيات مرضى MI الحاد ، إلا أن ارتفاع معدل انتشار قصور القلب بعد MI لا يزال يمثلمشكلة 2. الفيزيولوجيا المرضية الرئيسية الكامنة وراء قصور القلب بعد MI هي استجابة الجسم التعويضية لإصابات القلب ، والتي تنطوي على استبدال عضلة القلب الميتة بندوب ليفية غير مقلصة. تعتمد هذه الاستجابات التكيفية بشكل كبير على الالتهاب الموضعي بوساطة التفاعلات بين أنواع الخلايا المتعددة وخلايا أنسجة القلب ، ويعتبر هذا الالتهاب الآن هدفا علاجيا محتملا لتقليل تكوين الندبة الليفية ، وبالتالي الحماية من قصور القلب بعد MI 3,4. ومن المثير للاهتمام أن البيئة المكروية في موقع الاحتشاء تشهد انتقالا يعتمد على الوقت في أنواع الخلايا المتسللة ووظائفها في مراحل مختلفة من MI 1,5. أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا غير القلبية (مثل الخلايا المناعية والخلايا الليفية والخلايا البطانية) تلعب أدوارا مركزية في التهاب ما بعد MI وإصلاح الأنسجة 5,6. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام تسلسل الخلية الواحدة على نطاق واسع كأداة قوية لتوضيح مشاركات ووظائف الخلايا العضلية غير القلبية في البيئة الدقيقة بعد MI 7,8. يوفر هذا نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا المرضية لإصابة وإصلاح ما بعد MI وتطوير العلاجات المحتملة ضد قصور القلب بعد MI.
تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية (RNA-Seq) هو تقنية تستخدم لدراسة النسخ الكاملة بتفصيل كبير باستخدام تسلسل الجيل التالي (NGS) 7،8،9. في الآونة الأخيرة ، أحدث تطوير scRNA-Seq ثورة في مجال البحوث الطبية الحيوية. بالمقارنة مع التسلسل السائب التقليدي ، يحلل scRNA-Seq ملفات تعريف التعبير الجيني وعدم تجانس النسخ على مستوى الخليةالواحدة 7,8. تعزز هذه التقنية بشكل كبير البحث في الفيزيولوجيا المرضية الخلوية ل MI 9,10 من خلال تحديد أنواع الخلايا المتداولة المختلفة في البيئة المكروية بعد MI والكشف عن التفاعل بين خلايا عضلة القلب والخلايا العضلية غير القلبية. تساهم هذه النتائج أيضا في الكشف عن أهداف علاجية جديدة لفشل القلب بعد MI. بشكل عام ، تتضمن تجربة ما بعد MI القائمة على scRNA-seq ثلاثة أقسام رئيسية: (1) إنشاء نموذج حيواني بعد MI. (2) إعداد تعليق الخلية ؛ و (3) تسلسل العينات وتحليل البيانات. من الملاحظ أن تحضير تعليق الخلية هو الخطوة الأكثر أهمية في إعداد تجربة scRNA-Seq لأن جودة تعليق الخلية تحدد دقة النتائج.
تم تصميم هذا البروتوكول لاستخراج تعليق الخلايا غير القلبية من الأنسجة القلبية بعد MI. بشكل ملحوظ ، يتم تضمين التفاصيل المحددة للحفاظ على صلاحية الخلية وحلها. وفي الوقت نفسه ، يمكن العثور على المعدات المستخدمة في هذا البروتوكول ، مثل المجموعات الجراحية للفئران وأجهزة تهوية القوارض وأجهزة الطرد المركزي ، في معظم مراكز التجارب على الحيوانات والمختبرات الطبية الحيوية ، وبالتالي ، فإن تكلفة تجربة هذا البروتوكول منخفضة نسبيا. علاوة على ذلك ، إذا تم النظر في النقاط الزمنية ومواقع الاحتشاء كمتغيرات ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمحاكاة مجموعة واسعة من السيناريوهات السريرية ، خاصة بالنسبة لمضاعفات ما بعد MI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر في جامعة تشجيانغ وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الاستشارية للحيوانات في جامعة تشجيانغ.
1. جراحة ربط الشريان التاجي الأمامي الأيسر (ربط LAD)
ملاحظة: تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع كنماذج. تم حصاد القلوب بعد 2 أسابيع من MI. تم إجراء جراحة ربط الشريان التاجي الأمامي الأيسر كما هو موضح سابقا وأظهر11.
- تطهير الأدوات الجراحية مع 70 ٪ من الإيثانول قبل الجراحة.
- وزن الفأر ، ثم تخدير الفأر بالحقن داخل الصفاق من 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ / كغ). راقب منعكس قرصة إصبع القدم ، وقم بقياس معدل التنفس لتقييم عمق التخدير أثناء العملية.
- ضع الماوس على طاولة العمليات مع وسادة تسخين 37 درجة مئوية. استخدم مرهم العيون لمنع جفاف العين.
- قم بإزالة الشعر من صدره ورقبته اليسرى باستخدام كريم مزيل الشعر ، واستخدم مسحات قطنية لإزالة الشعر. تطهير الجلد مع iodophor ، تليها 70 ٪ الكحول لتنظيف المنطقة ثلاث مرات.
- إجراء شق عنق الرحم في خط الوسط (0.8-1.0 سم) تحت المجهر. افصل الجلد والعضلات والأنسجة المحيطة بالقصبة الهوائية ، ثم أدخل قنية 20 جم في القصبة الهوائية.
ملاحظة: راقب أثناء إدخال القنية في القصبة الهوائية تحت المنظر المجهري للتأكد من عدم إدخال الأنبوب في المريء. - قم بتوصيل الماوس بجهاز تهوية القوارض الذي تم ضبطه على حجم المد والجزر 0.2 مل مع 150 ضربة في الدقيقة.
- شق صدر الفأر بشكل غير مباشر على طول خط منتصف الترقوة بمقص معقم. تشريح الأنسجة تحت الجلد لفضح الأضلاع.
- استخدم مقص معقم لقطع الجلد بشكل غير مباشر على طول خط منتصف الترقوة الأيسر (0.8-1.0 سم). إجراء بضع الصدر الأيسر لفصل الضلوع الثالثة والرابعة لفضح القلب. استخدم ضامد الضلع للحصول على رؤية واضحة.
- افتح التامور بالملقط المنحني ، ثم اربط الشريان النازل الأمامي الأيسر (أسفل ملحق الأذين الأيسر) باستخدام خياطة حريرية 7-0. يشير الجدار الأمامي الشاحب للبطين الأيسر إلى أن نضح عضلة القلب قد توقف بنجاح.
- حرر ضامد الضلع ، وقم بخياطة الشق الصدري في طبقات بخياطة حريرية 5-0 أثناء طرد الهواء من الصدر. غرزة شق الرقبة مع خياطة الحرير 5-0 خياطة.
- قم بإزالة أنبوب القصبة الهوائية من الماوس بمجرد استعادة التنفس التلقائي. حقن داخل الصفاق 0.5 مل من محلول ملحي معقم تم تسخينه مسبقا. حقن البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) كل 12 ساعة تحت الجلد لتقليل الألم.
- أخيرا ، ضع الماوس على وسادة التدفئة لانتظار الإنعاش. راقب الماوس للتأكد من أنه لا يعاني من ضيق التنفس المفرط أو النزيف عبر الملاحظة البصرية.
- أعد الماوس إلى قفصه بعد استيقاظه. في الأسبوع الأول ، راقب الماوس يوميا للتحقق من أن حركته وعاداته وعاداته الغذائية كافية. وفقا لاحتياجات التجربة ، احصد القلب في نقاط زمنية مختلفة بعد MI.
ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم إعداد تعليق الخلية الواحدة مع القلب بعد 2 أسابيع من MI.
2. إعداد تعليق خلية واحدة القلب
- إعداد الحلول والإعلام
- المخزن المؤقت لتفكك أنسجة القلب: امزج 10 مجم من كولاجيناز IV (600 وحدة / مل) ، و 5 مجم من ديسباز II (0.5 وحدة / مل) ، و 50 ميكرولتر من DNase I (100 ميكروغرام / مل) في 5 مل من RPMI 1640. قم بتسخين هذه الوسيلة مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل الاستخدام.
- المخزن المؤقت للغسيل الخلوي: قم بإعداد 1٪ BSA أو 10٪ FBS في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، PH 7.4) ، واحتفظ به عند 4 درجات مئوية أو على الثلج.
- محلول التروية: برنامج تلفزيوني بارد مسبقا (PH 7.4) كمحلول تروية.
- المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC): استخدم المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء كما هو مذكور من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للاطلاع على قائمة الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة.
- القتل الرحيم للفأر عن طريق حقن الصوديوم الخماسي داخل الصفاق (150 مجم / كجم).
- تشريح القلب
- ضع الماوس في وضع ضعيف عن طريق تثبيت أطرافه الخلفية في مكانها بشريط لاصق.
- رش الجسم بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم قطعه عموديا من خلال جلد البطن والعضلات مع تجنب ثقب الكبد. افتح الصدر بعناية مع تجنب ثقب القلب.
- استخدم برنامج تلفزيوني مبرد مسبقا (PH 7.4) لتغذية البطين الأيسر حتى يتم ملاحظة سائل التروية عديم اللون (هناك حاجة إلى حوالي 15 مل من PBS [pH 7.4]).
- ارفع القلب برفق من الصدر بالملقط ، واقطع الأنسجة الزائدة المرتبطة بالجزء الخارجي من القلب بمقص العيون. ضع القلب في 1 مل من PBS المبرد مسبقا (PH 7.4) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
- التفكك الأنزيمي لأنسجة القلب
- نقل قلب الفأر إلى بئر واحد من لوحة 24 بئر مع 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفكك أنسجة القلب وضعت على الجليد ، وتقطيعه إلى قطع صغيرة (~ 1 مم) بمقص.
- انقل أنسجة القلب المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مع 5 مل من محلول تفكك الأنسجة.
ملاحظة: حجم المخزن المؤقت لتفكك أنسجة القلب الموصى به هو 5 مل / قلب. - ضع أنبوب الطرد المركزي في شاكر ترددي ثرموستاتي كهربائيا عند 125 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ماصة تعليق الأنسجة صعودا وهبوطا 10 مرات كل 20 دقيقة.
- قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة الأنسجة والكتل غير المهضومة. أضف 25 مل من المخزن المؤقت لغسل الخلايا لشطف الأنبوب الأصلي ، ثم انقله لشطف مصفاة الخلية. بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإزالة كتل الخلايا بشكل أكبر.
- جهاز طرد مركزي تعليق الخلية المفلترة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، ثم أعد تعليق عينة الخلية في 1x RBC lysis buffer لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- أضف حجما أكبر بأربع مرات من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا.
- امزج 18 ميكرولتر من معلق الخلية مع 2 ميكرولتر من محلول تلطيخ برتقال أكريدين (AO) / بروبيديوم يوديد (PI) (9: 1) ، وأضف 10 ميكرولتر من الخليط إلى شريحة غرفة العد. قم بتقييم أرقام الخلايا وصلاحيتها باستخدام عداد الخلايا التلقائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الحصول على تعليق أحادي الخلية ذو حيوية عالية من خلال تنفيذ القسم 2 من هذا البروتوكول. ومع ذلك ، لا يزال من الممكن ملاحظة شظايا الخلايا (الشكل 1 أ) ؛ ومن ثم ، تم إجراء فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) لزيادة تحسين الجودة16. بعد FACS ، ينخفض متوسط حجم الخلية من 9.6 ميكرومتر إلى 9.1 ميكرومتر ( الجدول 1) ، مما يشير إلى أنه يمكن تقليل نسبة شظايا الخلايا بشكل فعال في تعليق الخلية بواسطة FACS (الشكل 1 ب). ويظهر الشكل 1 جيم استراتيجية البوابات المستخدمة في نظام مراقبة الأصول الميدانية (FACS).
بالإضافة إلى الصور الواردة في الشكل 1 ، تم قياس تركيز الخلية ومتوسط حجم الخلية وصلاحيتها بواسطة عداد الخلية (الجدول 1). كانت الاختلافات في تركيزات الخلايا بسبب حجم تعليق الخلية. ومن الملاحظ أن متوسط حجم الخلية انخفض بعد نظام مراقبة الأصول الميدانية (الجدول 1)، مما يدل على أن نظام مراقبة الأصول الميدانية يمكن أن يقلل بشكل فعال من تكتل الخلايا ويزيل شظايا الخلايا.
تم إجراء ScRNA-seq لدراسة البيئة المكروية المناعية للقلب مع التحقق من جودة تعليق الخلية التي تم الحصول عليها من خلال هذا البروتوكول. بعد تحضير التعليق أحادي الخلية ، قمنا أولا بفرز الخلايا التي تعبر عن البروتين السطحي CD45 ، وهو علامة شائعة لمجموعة واسعة من الخلايا المناعية. بعد ذلك ، أجرينا scRNA-seq على خلايا CD45 + باستخدام منصة 10X Genomics17. وبهذه الطريقة، قمنا بتجميع 14,217 خلية فردية من ثلاث عينات قلب سليمة في مجموعة بيانات مدمجة بعد مراقبة الجودة (الجدول 2). أظهر التجميع غير الخاضع للإشراف والتقليل في أبعاد تضمين الجار العشوائي الموزع على شكل حرف t (t-SNE) فصلا واضحا لسبعة أنواع من الخلايا المناعية (الشكل 2). علاوة على ذلك ، أظهر كل نوع من أنواع الخلايا المناعية تعبيرا عاليا عن العلامات الكلاسيكية. بشكل قاطع ، تظهر هذه النتائج أن التعليق أحادي الخلية الذي أعده هذا البروتوكول له فعالية عالية لتسلسل الخلية الواحدة.
الشكل 1: صلاحية الخلية في معلق الخلية الواحدة القلبية. (أ) صلاحية الخلية بدون FACS. تشير رؤوس الأسهم السوداء إلى شظايا الخلايا (بدون مضان). (ب) صلاحية الخلية مع FACS. يشير السهم الأصفر إلى الخلايا الحية (مضان أخضر) ، ويشير السهم الأحمر إلى الخلايا الميتة (مضان أحمر). (ج) استراتيجية البوابات. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية لخلايا CD45+ القلبية من ثلاث عينات من قلب الفأر. (أ) مخطط tSNE لخلايا CD45+ يوضح تجمعات الخلايا المناعية المحددة بناء على جينات العلامات المتعارف عليها. ب: خريطة حرارية لأهم خمسة جينات معبر عنها تفاضليا في كل مجموعة سكانية فرعية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| قبل FACS | بعد FACS | |
| إجمالي تركيز الخلايا (الخلايا / مل) | 1.51 س 106 | 3.40 س 105 |
| تركيز الخلايا الحية (الخلايا / مل) | 1.40 س 106 | 3.15 س 105 |
| تركيز الخلايا الميتة (الخلايا / مل) | 1.09 س 105 | 2.48 س 104 |
| الجدوى (٪) | 92.8 | 92.7 |
| متوسط حجم الخلية (ميكرومتر) | 9.6 | 9.1 |
الجدول 1: معلق القلب أحادي الخلية قبل وبعد FACS. تتم مقارنة كثافة الخلايا لمعلق الخلية الواحدة القلبي الذي تم الحصول عليه قبل وبعد FACS باستخدام عداد الخلايا الآلي.
| تقديرات | |
| العدد المقدر للخلايا | 14,217 |
| متوسط عدد مرات القراءة لكل خلية | 81,017 |
| الجينات المتوسطة لكل خلية | 1,374 |
| إجمالي الجينات المكتشفة | 18,424 |
| متوسط عدد UMI لكل خلية | 4,021 |
| الباركود صالح | 98.4% |
| يقرأ المعين للجينوم | 95.1% |
الجدول 2: إحصاءات مراقبة الجودة. يسرد الجدول التقديرات المختلفة لبيانات الخلية الواحدة لقلوب الفئران السليمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تهدف هذه المقالة إلى وصف بروتوكول لعزل الخلايا العضلية غير القلبية المفردة من قلوب الفئران بعد MI. يمكن تطبيق البروتوكول لعزل أنواع مختلفة من الخلايا في البيئة المكروية بعد MI بجودة عالية ، بما في ذلك الخلايا المناعية والخلايا البطانية والخلايا الليفية. هناك ثلاثة عوامل أساسية حاسمة للحصول على تعليق خلوي عالي الجودة لتسلسل الخلية الواحدة. الأول هو إعداد الهضم الأنزيمي. من المهم التحكم في وقت الهضم وحجم وتركيز الإنزيمات الهاضمة لضمان بقاء الخلية وكفاءة عزلها. في هذه الحالة ، قمنا بزيادة تركيز الإنزيم بشكل مناسب وإطالة وقت الهضم. هنا ، نوصي بمدة الهضم من 45 دقيقة إلى 1 ساعة. قد تزيد المدة الأقصر من صلاحية الخلية ولكنها قد تؤدي إلى عدم كفاية هضم أنسجة القلب وقد تزيد من كمية كتل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمنا DNase I لمنع تراكم الخلايا لأن الخلايا المحللة يمكنها إطلاق الحمض النووي الحر لتغليف الخلايا المحيطة لتكوين كتل خلوية13. العامل الأساسي الثاني هو استخدام محلول غسيل الخلايا الذي يحتوي على BSA أو FBS. لا يمكن ل BSA أو FBS حماية نشاط الإنزيمات فحسب ، بل يمكنها أيضا تحسين صلاحية الخلايا. العامل الأساسي الأخير هو تسهيل FACS للقضاء على شظايا الخلايا والخلايا الميتة. يمكن أن تؤدي شظايا الخلايا إلى عدد غير دقيق للخلايا وقابليتها للحياة. تعمل هذه العوامل معا على تعزيز صلاحية ونقاء تعليق الخلية ، مما يجعلها أكثر توافقا مع تسلسل الخلية الواحدة.
يصف هذا البروتوكول أولا إعداد تعليق الخلية لتسلسل الخلية الواحدة ، ويتضمن أيضا إجراءات إضافية لتحسين جودة تعليق الخلية بتكلفة منخفضة نسبيا. بالمقارنة مع البروتوكولات الأخرى المستخدمة في الدراسات السابقة ، فإننا نتجنب استخدام الإنزيمات الهاضمة التي يمكن أن تسبب تراكم الخلايا التي يسببها الحمض النووي الحر ، مثل التربسين14. تعد إزالة بقايا الخلايا أحد التحديات الرئيسية لدراسات الخلية الواحدة ، وتستخدم بعض الدراسات مجموعات إزالة الخلايا الميتة لتحسين صلاحية الخلية قبل تشغيل العينات14,15. ومع ذلك ، نقترح هنا استخدام FACS لتعزيز نقاء العينة نظرا لفعاليتها العالية في تقليل الخلايا الميتة والحطام.
يمكن تحليل التعليق أحادي الخلية الذي تم الحصول عليه بواسطة هذا البروتوكول بشكل أكبر عن طريق تحليل التدفق أو زراعة الخلايا الأولية (إجراءات التعقيم القياسية)18. نظرا لأن الإنزيمات الهاضمة خفيفة نسبيا ، فهي مناسبة لهضم أنسجة القلب المأخوذة في مراحل مختلفة من MI ، وكذلك تلك الموجودة في القلوب السليمة. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول له قيود معينة. على سبيل المثال ، الهضم لفترات طويلة عند 37 °C يعزز حتما التعبير عن جينات الإجهاد19,20. يمكن حل هذا القيد باستخدام البروتياز النشط بدرجة حرارة منخفضة أو تقليل وقت الهضم متبوعا ب FACS. أيضا ، لا يشمل هذا البروتوكول عزل خلايا عضلة القلب ، وبالتالي فهو غير مناسب للدراسات حول استجابات الأنسجة المحلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل صناديق العلوم الطبيعية لمقاطعة تشجيانغ (LQ22H020010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Gu, J., et al. Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).
- Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Tzahor, E., Dimmeler, S. A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment. Science. 377 (6610), 4443 (2022).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Massaia, A., et al. Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
- Jin, K., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction. Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).
- Tombor, L. S., et al. Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction. Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).
- Gladka, M. M., et al. Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Garcia-Flores, V., et al. Preparation of single-cell suspensions from the human placenta. Nature Protocols. , (2022).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Hua, X., et al. Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis. Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).
- Grindberg, R. V., et al.
- Vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, 935-936 (2017).
