Summary
Aquí, describimos un protocolo para aislar una cantidad suficiente de miomiocitos únicos no cardiomiocitos con alta viabilidad de un corazón de ratón post-infarto de miocardio (IM). Esto se puede utilizar para la secuenciación posterior de una sola célula, el análisis de citometría de flujo y el cultivo celular primario.
Abstract
El infarto de miocardio (IM) es una de las enfermedades cardiovasculares más comunes, con un aumento de la mortalidad en todo el mundo. Los no cardiomiocitos representan más de la mitad de la población total de células cardíacas y contribuyen a las compensaciones adaptativas en caso de lesión miocárdica, incluidas las respuestas inflamatorias, la reparación de tejidos y la formación de cicatrices. Para estudiar el microambiente cardíaco post-IM, la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) se usa ampliamente para identificar diferentes tipos de células cardíacas y comunicaciones intercelulares. Entre los procedimientos de preparación de muestras de scRNA-seq, la preparación de la suspensión celular es uno de los pasos más críticos, porque la viabilidad celular puede afectar la calidad de los resultados de scRNA-seq. Por lo tanto, diseñamos un protocolo experimental para preparar una suspensión de células no cardiomiocitos de corazones de ratón post-IM con un enfoque adicional en mejorar la viabilidad celular mediante la elección de enzimas digestivas suaves, el control del tiempo de digestión y la aplicación de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Finalmente, aislamos células CD45+ de la suspensión celular no cardiomiocitaria obtenida a través de este protocolo, y luego realizamos scRNA-seq.
Introduction
El infarto de miocardio (IM) es una de las enfermedades cardiovasculares más comunes, y su mortalidad aumenta en todo el mundo1. El IM es causado por un suministro insuficiente de sangre al miocardio circundante, que puede ser el resultado de un bloqueo de la arteria coronaria que ocurre con la ruptura de la placa aterosclerótica. A pesar de que la intervención coronaria percutánea (ICP) ha reducido las tasas de mortalidad de los pacientes con IM agudo, la alta prevalencia de insuficiencia cardíaca después del IM sigue siendo un problema2. La fisiopatología clave que subyace a la insuficiencia cardíaca post-IM es la respuesta compensatoria del cuerpo a las lesiones cardíacas, que implica reemplazar el músculo cardíaco muerto con cicatrices fibróticas no contráctiles. Estas respuestas adaptativas dependen significativamente de la inflamación local mediada por las interacciones entre múltiples tipos de células y células del tejido cardíaco, y esta inflamación ahora se considera como una diana terapéutica potencial para reducir la formación de cicatrices fibróticas y, por lo tanto, proteger contra la insuficiencia cardíaca post-IM 3,4. Curiosamente, el microambiente en el sitio del infarto experimenta una transición dependiente del tiempo en los tipos de células infiltrantes y funciones en diferentes etapas de MI 1,5. Muchos estudios han demostrado que los no cardiomiocitos (por ejemplo, células inmunes, fibroblastos y células endoteliales) juegan un papel central en la inflamación post-IM y la reparación de tejidos 5,6. En los últimos años, la secuenciación unicelular ha sido ampliamente utilizada como una poderosa herramienta para dilucidar las implicaciones y funciones de los no cardiomiocitos en el microambiente post-IM 7,8. Esto proporciona información sobre la fisiopatología de la lesión y reparación post-IM y el desarrollo de terapias potenciales contra la insuficiencia cardíaca post-IM.
La secuenciación de ARN de alto rendimiento (RNA-Seq) es una técnica utilizada para estudiar transcriptomas completos con gran detalle utilizando secuenciación de próxima generación (NGS)7,8,9. Recientemente, el desarrollo de scRNA-Seq ha revolucionado el campo de la investigación biomédica. En comparación con la secuenciación masiva convencional, scRNA-Seq analiza los perfiles de expresión génica y la heterogeneidad transcripcional a nivel de una sola célula 7,8. Esta técnica promueve significativamente la investigación de la fisiopatología celular de MI 9,10 al identificar diferentes tipos de células circulantes en el microambiente post-MI y descubrir la interacción entre cardiomiocitos y no cardiomiocitos. Estos hallazgos contribuyen aún más a descubrir nuevos objetivos terapéuticos para la insuficiencia cardíaca posterior al IM. En general, el experimento post-MI basado en scRNA-seq incluye tres secciones principales: (1) el establecimiento de un modelo animal post-MI; 2) la preparación de la suspensión celular; y (3) secuenciación de muestras y análisis de datos. Notablemente, la preparación de la suspensión celular es el paso más crítico en la preparación del experimento scRNA-Seq porque la calidad de la suspensión celular determina la precisión de los resultados.
Este protocolo está diseñado para extraer una suspensión de células no cardiomiocitos del tejido cardíaco post-IM; Significativamente, se incluyen los detalles específicos para mantener la viabilidad y resolución celular. Mientras tanto, el equipo utilizado en este protocolo, como kits quirúrgicos para ratones, ventiladores para roedores y centrífugas, se puede encontrar en la mayoría de los centros de experimentación animal y laboratorios biomédicos, y, por lo tanto, el costo experimental de este protocolo es relativamente bajo. Además, si se consideran los puntos de tiempo y los sitios de infarto como variables, este protocolo se puede aplicar para simular una amplia gama de escenarios clínicos, especialmente para las complicaciones posteriores al IM.
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Protocol
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio en la Universidad de Zhejiang y fueron aprobados por el Comité Asesor de Animales de la Universidad de Zhejiang.
1. Cirugía de ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (ligadura LAD)
NOTA: Se utilizaron ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad como modelos. Los corazones fueron cosechados 2 semanas después del IM. La cirugía de ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda se llevó a cabo como se describió y demostrópreviamente 11.
- Desinfecte los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% antes de la cirugía.
- Pesar el ratón y luego anestesiar al ratón con inyecciones intraperitoneales de pentobarbital sódico al 1% (50 mg / kg). Observe el reflejo de pellizco del dedo del pie y mida la frecuencia respiratoria para evaluar la profundidad de la anestesia durante el procedimiento.
- Coloque el ratón sobre la mesa de operaciones con una almohadilla térmica a 37 °C. Use ungüento oftálmico para prevenir la deshidratación ocular.
- Depilarse el pecho y el cuello precordiales izquierdos con crema depilatoria, y utilizar hisopos de algodón para eliminar los vellos. Desinfecte su piel con yodóforo, seguido de alcohol al 70% para limpiar el área tres veces.
- Realice una incisión cervical en la línea media (0.8-1.0 cm) bajo un microscopio. Separe la piel, el músculo y el tejido que rodea la tráquea, y luego inserte una cánula de 20 G en la tráquea.
NOTA: Observe mientras inserta la cánula en la tráquea bajo vista microscópica para asegurarse de que el tubo no se inserte en el esófago. - Conecte el ratón a un ventilador para roedores configurado a un volumen corriente de 0,2 ml con 150 golpes por minuto.
- Incise el pecho del ratón oblicuamente a lo largo de la línea medioclavicular con una tijera estéril. Diseccionar el tejido subcutáneo para exponer las costillas.
- Use tijeras estériles para cortar la piel oblicuamente a lo largo de la línea clavicular media izquierda (0.8-1.0 cm). Realizar toracotomía izquierda para separar la tercera y cuarta costilla para exponer el corazón. Use un retractor de costillas para una visión clara.
- Abra el pericardio con fórceps curvos y luego liga la arteria descendente anterior izquierda (debajo del apéndice de la aurícula izquierda) usando una sutura de seda 7-0. Una pared anterior pálida del ventrículo izquierdo indica que la perfusión miocárdica se interrumpe con éxito.
- Suelte el retractor de costillas y cose la incisión torácica en capas con una sutura de seda 5-0 mientras expulsa el aire del pecho. Cose la incisión del cuello con una sutura de seda de sutura 5-0.
- Retire el tubo traqueal del ratón una vez que se restablezca su respiración espontánea. Inyecte por vía intraperitoneal 0,5 ml de solución salina estéril precalentada. Inyecte buprenorfina (0,1 mg/kg) cada 12 h por vía subcutánea para minimizar el dolor.
- Finalmente, coloque el mouse en la almohadilla térmica para esperar la reanimación. Controle al ratón para asegurarse de que no sufre de disnea excesiva o hemorragia a través de la observación visual.
- Devuelva el ratón a su jaula después de que se despierte. Durante la primera semana, monitoree el ratón diariamente para verificar que su movilidad, aseo y hábitos alimenticios sean adecuados. De acuerdo con las necesidades del experimento, cosechar el corazón en diferentes puntos de tiempo después de IM.
NOTA: En este protocolo, la suspensión unicelular se preparó con el corazón 2 semanas después del IM.
2. Preparación de la suspensión unicelular cardíaca
- Preparación de las soluciones y medios
- Tampón de disociación del tejido cardíaco: Mezcle 10 mg de colagenasa IV (600 U/ml), 5 mg de dispasa II (0,5 U/ml) y 50 μL de DNasa I (100 μg/ml) en 5 ml de RPMI 1640. Precaliente este medio a 37 °C en un baño maría antes de usarlo.
- Tampón de lavado celular: Prepare BSA al 1% o FBS al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS, PH 7.4) y manténgala a 4 °C o en hielo.
- Solución de perfusión: PBS preenfriado (PH 7.4) como solución de perfusión.
- Tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC): use el tampón de lisis RBC mencionado por el fabricante.
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener la lista de reactivos y equipos utilizados en este estudio.
- Eutanasia al ratón mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (150 mg/kg).
- Disección cardíaca
- Coloque el ratón en posición supina fijando sus extremidades posteriores en su lugar con cinta adhesiva.
- Rocíe el cuerpo con etanol al 70% y luego corte verticalmente a través de la piel abdominal y los músculos evitando perforar el hígado. Abra cuidadosamente el tórax evitando perforar el corazón.
- Utilice el PBS preenfriado (PH 7.4) para perfundir el ventrículo izquierdo hasta que se observe el líquido de perfusión incoloro (se necesitan aproximadamente 15 ml de PBS [pH 7.4]).
- Levante suavemente el corazón del tórax con fórceps y corte el exceso de tejido adherido a la parte exterior del corazón con tijeras oftálmicas. Coloque el corazón en 1 ml de PBS preenfriado (PH 7.4) en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.
- Disociación enzimática del tejido cardíaco
- Transfiera el corazón del ratón a un pocillo de una placa de 24 pocillos con 150 μL del tampón de disociación del tejido cardíaco colocado en hielo y córtelo en trozos pequeños (~ 1 mm) con una tijera.
- Transfiera el tejido cardíaco picado a un tubo de centrífuga de 15 ml con 5 ml del tampón de disociación tisular.
NOTA: El volumen tampón de disociación del tejido cardíaco recomendado es de 5 ml/corazón. - Colocar el tubo de centrífuga en el agitador alternativo eléctricamente termostático a 125 rpm durante 1 h a 37 °C. Pipet la suspensión de tejido hacia arriba y hacia abajo 10 veces cada 20 min.
- Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm para eliminar el tejido no digerido y los grumos. Agregue 25 ml del tampón de lavado celular para enjuagar el tubo original y luego transfiéralo para enjuagar el filtro celular. A continuación, filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm para eliminar aún más los grupos celulares.
- Centrifugar la suspensión de celda filtrada a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y, a continuación, vuelva a suspender la muestra de células en un tampón de lisis 1x RBC durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Añadir cuatro veces más volumen del tampón de lavado de la celda y centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 ml del tampón de lavado celular. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml del tampón de lavado celular.
- Mezclar 18 μL de la suspensión celular con 2 μL de solución de tinción de naranja de acridina (AO)/yoduro de propidio (PI) (9:1) y añadir 10 μL de la mezcla a un portaobjetos de cámara de conteo. Evalúe el número de celdas y la viabilidad utilizando un contador automático de celdas.
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Representative Results
Se obtuvo una suspensión unicelular con alta vitalidad mediante la implementación de la sección 2 de este protocolo. Sin embargo, todavía se podían observar fragmentos celulares (Figura 1A); por lo tanto, se realizó la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para mejorar aún más la calidad16. Después del FACS, el tamaño celular promedio se reduce de 9,6 μm a 9,1 μm ( Tabla 1), lo que sugiere que la proporción de fragmentos celulares puede reducirse efectivamente en la suspensión celular mediante el FACS (Figura 1B). La estrategia de acceso utilizada para el sistema de control del sistema de control del terreno se muestra en la figura 1C.
Además de las imágenes de la Figura 1, la concentración celular, el tamaño celular promedio y la viabilidad celular se midieron mediante un contador celular (Tabla 1). Las diferencias en las concentraciones celulares se debieron al volumen de la suspensión celular. Notablemente, el tamaño promedio de la célula disminuyó después de la FACS (Tabla 1), lo que muestra que FACS puede reducir efectivamente la aglutinación celular y eliminar fragmentos celulares.
Se realizó ScRNA-seq para estudiar el microambiente inmunológico cardíaco mientras se verificaba la calidad de la suspensión celular obtenida a través de este protocolo. Después de preparar la suspensión de una sola célula, primero clasificamos las células que expresaban la proteína de superficie CD45, que es un marcador común para una amplia gama de células inmunes. A continuación, realizamos scRNA-seq en células CD45+ utilizando la plataforma 10X Genomics17. De esta manera, agrupamos 14.217 células individuales de tres muestras de corazón sano en un conjunto de datos fusionados después del control de calidad (Tabla 2). La agrupación no supervisada y la reducción de la dimensionalidad de la incrustación estocástica del vecino distribuido en t (t-SNE) mostraron una separación obvia de siete tipos de células inmunes (Figura 2). Además, cada tipo de célula inmune mostró una alta expresión de marcadores clásicos. En conclusión, estos resultados muestran que la suspensión unicelular preparada por este protocolo tiene una alta potencia para la secuenciación unicelular.
Figura 1: Viabilidad celular en la suspensión unicelular cardíaca. A) Viabilidad celular sin sistema de control de los bienes sobre el terreno. Las puntas de flecha negras indican fragmentos de células (sin fluorescencia). B) Viabilidad celular con el sistema de control de los bienes sobre el terreno. La flecha amarilla indica células vivas (fluorescencia verde), y la flecha roja indica células muertas (fluorescencia roja). (C) Estrategia de acceso. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Secuenciación de ARN unicelular de células CD45+ cardíacas de tres muestras de corazón de ratón. (A) Diagrama de tSNE de células CD45+ que muestra las poblaciones de células inmunes identificadas en base a genes marcadores canónicos. (B) Mapa de calor de los cinco principales genes expresados diferencialmente en cada subpoblación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Antes del sistema de control de los bienes sobre el terreno | Después del sistema de control de los bienes sobre el terreno | |
| Concentración celular total (células/ml) | 1,51 x 106 | 3,40 x 105 |
| Concentración de células vivas (células/ml) | 1,40 x 106 | 3,15 x 105 |
| Concentración de células muertas (células/ml) | 1,09 x 105 | 2,48 x 104 |
| Viabilidad (%) | 92.8 | 92.7 |
| Tamaño medio de la célula (μm) | 9.6 | 9.1 |
Tabla 1: Suspensión unicelular cardíaca antes y después del FACS. Las densidades celulares de la suspensión unicelular cardíaca obtenida antes y después del FACS se comparan utilizando un contador celular automatizado.
| Estimaciones | |
| Número estimado de celdas | 14,217 |
| Lecturas medias por celda | 81,017 |
| Mediana de genes por célula | 1,374 |
| Total de genes detectados | 18,424 |
| Recuentos UMI medios por célula | 4,021 |
| Códigos de barras válidos | 98.4% |
| Lecturas asignadas al genoma | 95.1% |
Tabla 2: Estadísticas de control de calidad. La tabla enumera las diferentes estimaciones de los datos unicelulares de corazones de ratones sanos.
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Discussion
Este artículo tuvo como objetivo describir un protocolo para aislar no cardiomiocitos individuales de corazones de ratón después del IM. El protocolo se puede aplicar para aislar diferentes tipos de células en el microambiente post-MI con alta calidad, incluidas las células inmunes, las células endoteliales y los fibroblastos. Tres factores esenciales son cruciales para obtener una suspensión celular de alta calidad para la secuenciación de una sola célula. El primero es el ajuste de la digestión enzimática. Es importante controlar el tiempo de digestión y el volumen y la concentración de las enzimas digestivas para asegurar tanto la viabilidad celular como la eficiencia del aislamiento. En este caso, aumentamos adecuadamente la concentración de la enzima y prolongamos el tiempo de digestión. Aquí, recomendamos una duración de digestión de 45 min a 1 h. Una duración más corta puede aumentar la viabilidad celular, pero puede conducir a una digestión insuficiente del tejido cardíaco y puede aumentar la cantidad de grupos celulares. Además, utilizamos DNasa I para prevenir la agregación celular porque las células líticas pueden liberar ADN libre para envolver las células circundantes para formar grupos celulares13. El segundo factor esencial es usar una solución de lavado celular que contenga BSA o FBS. BSA o FBS no solo pueden proteger la actividad de las enzimas, sino también mejorar la viabilidad de las células. El último factor esencial es facilitar que el sistema de control de los bienes sobre el terreno elimine los fragmentos celulares y las células muertas. Los fragmentos celulares pueden resultar en un recuento y viabilidad celular inexactos. Estos factores juntos mejoran la viabilidad y pureza de la suspensión celular, haciéndola más compatible con la secuenciación de una sola célula.
Este protocolo describe en primer lugar la preparación de la suspensión celular para la secuenciación de una sola célula, y también incluye procedimientos adicionales para mejorar la calidad de la suspensión celular a un costo relativamente bajo. En comparación con otros protocolos utilizados por estudios previos, evitamos el uso de enzimas digestivas que pueden causar la agregación de células inducida por ADN libre, como la tripsina14. La eliminación de los restos celulares es uno de los principales desafíos para los estudios de células individuales, y algunos estudios utilizan kits de eliminación de células muertas para mejorar la viabilidad celular antes de ejecutar las muestras14,15. Sin embargo, aquí, sugerimos usar FACS para mejorar la pureza de la muestra debido a su alta efectividad en la reducción de células muertas y desechos.
La suspensión unicelular obtenida por este protocolo puede ser analizada adicionalmente por análisis de flujo o cultivo celular primario (procedimientos asépticos estándar)18. Como las enzimas digestivas son relativamente suaves, es adecuado para digerir el tejido cardíaco tomado en diferentes etapas del IM, así como el de corazones sanos. Sin embargo, este protocolo tiene ciertas limitaciones. Por ejemplo, la digestión prolongada a 37 °C promueve inevitablemente la expresión de genes de estrés19,20. Esta limitación se puede resolver mediante el uso de proteasa activa a baja temperatura o la reducción del tiempo de digestión seguido de FACS. Además, este protocolo no incluye el aislamiento de cardiomiocitos y, por lo tanto, no es adecuado para estudios sobre respuestas tisulares locales.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Fondos de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (LQ22H020010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
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