Summary
Qui, descriviamo un protocollo per isolare una quantità sufficiente di singoli non cardiomiociti con elevata vitalità da un cuore di topo post-infarto miocardico (MI). Questo può essere utilizzato per il successivo sequenziamento di singole cellule, l'analisi della citometria a flusso e la coltura cellulare primaria.
Abstract
L'infarto miocardico (IM) è una delle malattie cardiovascolari più comuni, con un aumento della mortalità in tutto il mondo. I non cardiomiociti rappresentano oltre la metà della popolazione totale di cellule cardiache e contribuiscono alle compensazioni adattative in caso di lesioni miocardiche, comprese le risposte infiammatorie, la riparazione dei tessuti e la formazione di cicatrici. Per studiare il microambiente cardiaco post-MI, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) è ampiamente utilizzato per identificare diversi tipi di cellule cardiache e comunicazioni intercellulari. Tra le procedure di preparazione del campione di scRNA-seq, la preparazione della sospensione cellulare è uno dei passaggi più critici, perché la vitalità cellulare può influenzare la qualità dei risultati di scRNA-seq. Pertanto, abbiamo progettato un protocollo sperimentale per preparare una sospensione di cellule non cardiomiocitarie da cuori di topo post-MI con una particolare attenzione al miglioramento della vitalità cellulare scegliendo enzimi digestivi lievi, controllando il tempo di digestione e applicando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Infine, abbiamo isolato le cellule CD45+ dalla sospensione di cellule non cardiomiocitarie ottenuta attraverso questo protocollo, e quindi abbiamo eseguito scRNA-seq.
Introduction
L'infarto miocardico (IM) è una delle malattie cardiovascolari più comuni e la sua mortalità aumenta in tutto il mondo1. L'infarto miocardico è causato da un insufficiente apporto di sangue al miocardio circostante, che può essere il risultato di un blocco dell'arteria coronaria che si verifica con la rottura della placca aterosclerotica. Sebbene l'intervento coronarico percutaneo (PCI) abbia ridotto i tassi di mortalità dei pazienti con infarto miocardico acuto, l'alta prevalenza di insufficienza cardiaca post infarto miocardico rimane un problema2. La fisiopatologia chiave alla base dell'insufficienza cardiaca post-MI è la risposta compensativa del corpo alle lesioni cardiache, che comporta la sostituzione del muscolo cardiaco morto con cicatrici fibrotiche non contrattili. Queste risposte adattative si basano significativamente sull'infiammazione locale mediata dalle interazioni tra più tipi di cellule e cellule del tessuto cardiaco, e questa infiammazione è ora considerata come un potenziale bersaglio terapeutico per ridurre la formazione di cicatrici fibrotiche e, quindi, proteggere dall'insufficienza cardiaca post-MI 3,4. È interessante notare che il microambiente nel sito dell'infarto sperimenta una transizione dipendente dal tempo nei tipi di cellule infiltranti e funzioni in diversi stadi di MI 1,5. Molti studi hanno dimostrato che i non-cardiomiociti (ad esempio, cellule immunitarie, fibroblasti e cellule endoteliali) svolgono un ruolo centrale nell'infiammazione post-MI e nella riparazione dei tessuti 5,6. Negli ultimi anni, il sequenziamento a singola cellula è stato ampiamente utilizzato come potente strumento per chiarire i coinvolgimenti e le funzioni dei non cardiomiociti nell'ambiente post-MI 7,8. Ciò fornisce approfondimenti sulla fisiopatologia della lesione e riparazione post-MI e sullo sviluppo di potenziali terapie contro l'insufficienza cardiaca post-MI.
Il sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento (RNA-Seq) è una tecnica utilizzata per studiare interi trascrittomi in grande dettaglio utilizzando il sequenziamento di nuova generazione (NGS)7,8,9. Recentemente, lo sviluppo di scRNA-Seq ha rivoluzionato il campo della ricerca biomedica. Rispetto al sequenziamento di massa convenzionale, scRNA-Seq analizza i profili di espressione genica e l'eterogeneità trascrizionale a livello di singola cellula 7,8. Questa tecnica promuove significativamente la ricerca della fisiopatologia cellulare di MI 9,10 identificando diversi tipi di cellule circolanti nel microambiente post-MI e scoprendo l'interazione tra cardiomiociti e non cardiomiociti. Questi risultati contribuiscono ulteriormente a scoprire nuovi bersagli terapeutici per l'insufficienza cardiaca post-infarto miocardico. In generale, l'esperimento post-MI basato su scRNA-seq comprende tre sezioni principali: (1) la creazione di un modello animale post-MI; 2) la preparazione della sospensione cellulare; e (3) sequenziamento del campione e analisi dei dati. In particolare, la preparazione della sospensione cellulare è il passo più critico nella preparazione dell'esperimento scRNA-Seq perché la qualità della sospensione cellulare determina l'accuratezza dei risultati.
Questo protocollo è progettato per estrarre una sospensione di cellule non cardiomiocitarie dal tessuto cardiaco post-MI; Significativamente, sono inclusi i dettagli specifici per mantenere la vitalità e la risoluzione delle cellule. Nel frattempo, le attrezzature utilizzate in questo protocollo, come kit chirurgici per topi, ventilatori per roditori e centrifughe, possono essere trovate nella maggior parte dei centri di sperimentazione animale e dei laboratori biomedici e, quindi, il costo dell'esperimento di questo protocollo è relativamente basso. Inoltre, se si considerano i punti temporali e i siti di infarto come variabili, questo protocollo può essere applicato per simulare una vasta gamma di scenari clinici, in particolare per le complicanze post-infarto.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio presso l'Università di Zhejiang e sono stati approvati dal Comitato consultivo per gli animali dell'Università di Zhejiang.
1. Chirurgia della legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (legatura LAD)
NOTA: sono stati utilizzati come modelli topi maschi C57BL / 6J di otto settimane. I cuori sono stati raccolti 2 settimane dopo l'infarto miocardico. L'intervento chirurgico di legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra è stato eseguito come descritto in precedenza e dimostrato11.
- Disinfettare gli strumenti chirurgici con etanolo al 70% prima dell'intervento chirurgico.
- Pesare il topo e quindi anestetizzare il topo con iniezioni intraperitoneali di pentobarbital sodico all'1% (50 mg/kg). Osservare il riflesso del dito del piede e misurare la frequenza respiratoria per valutare la profondità dell'anestesia durante la procedura.
- Posizionare il mouse sul tavolo operatorio con un termoforo a 37 °C. Utilizzare unguento oftalmico per prevenire la disidratazione degli occhi.
- Depilare il petto e il collo precordiali sinistro con crema depilatoria e utilizzare tamponi di cotone per rimuovere i peli. Disinfettare la pelle con iodoporo, seguito da alcol al 70% per pulire l'area tre volte.
- Eseguire un'incisione cervicale della linea mediana (0,8-1,0 cm) al microscopio. Separare la pelle, i muscoli e il tessuto che circonda la trachea, quindi inserire una cannula da 20 G nella trachea.
NOTA: Osservare durante l'inserimento della cannula nella trachea sotto la vista microscopica per assicurarsi che il tubo non sia inserito nell'esofago. - Collegare il mouse a un ventilatore per roditori impostato a 0,2 mL di volume corrente con 150 colpi al minuto.
- Incidi il torace del topo obliquamente lungo la linea medioclavicolare con una forbice sterile. Sezionare il tessuto sottocutaneo per esporre le costole.
- Utilizzare forbici sterili per tagliare la pelle obliquamente lungo la linea medio-clavicolare sinistra (0,8-1,0 cm). Eseguire toracotomia sinistra per separare la terza e la quarta costola per esporre il cuore. Utilizzare un divaricatore di costole per una visione chiara.
- Aprire il pericardio con una pinza curva, quindi ligare l'arteria discendente anteriore sinistra (sotto l'appendice sinistra dell'atrio) usando una sutura di seta 7-0. Una parete anteriore pallida del ventricolo sinistro indica che la perfusione miocardica è stata interrotta con successo.
- Rilasciare il divaricatore della costola e cucire l'incisione toracica a strati con una sutura di seta 5-0 mentre si espelle l'aria dal torace. Cucire l'incisione del collo con una sutura di seta di sutura 5-0.
- Rimuovere il tubo tracheale dal topo una volta ripristinata la respirazione spontanea. Iniettare per via intraperitoneale 0,5 ml di soluzione salina sterile preriscaldata. Iniettare buprenorfina (0,1 mg/kg) ogni 12 ore per via sottocutanea per ridurre al minimo il dolore.
- Infine, posizionare il mouse sulla piastra riscaldante per attendere la rianimazione. Monitorare il mouse per assicurarsi che non soffra di eccessiva dispnea o emorragia attraverso l'osservazione visiva.
- Riportare il topo nella sua gabbia dopo che si è svegliato. Per la prima settimana, monitorare il topo quotidianamente per verificare che la sua mobilità, toelettatura e abitudini alimentari siano adeguate. Secondo le esigenze dell'esperimento, raccogliere il cuore in diversi punti temporali dopo l'infarto miocardico.
NOTA: In questo protocollo, la sospensione unicellulare è stata preparata con il cuore 2 settimane dopo l'infarto miocardico.
2. Preparazione della sospensione cardiaca monocellulare
- Preparazione delle soluzioni e dei supporti
- Tampone di dissociazione del tessuto cardiaco: Mescolare 10 mg di collagenasi IV (600 U/mL), 5 mg di dispasi II (0,5 U/mL) e 50 μL di DNasi I (100 μg/mL) in 5 mL di RPMI 1640. Preriscaldare questo mezzo a 37 °C a bagnomaria prima dell'uso.
- Tampone di lavaggio cellulare: preparare l'1% di BSA o il 10% di FBS in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, PH 7.4) e conservare a 4 °C o su ghiaccio.
- Soluzione di perfusione: PBS pre-freddo (PH 7.4) come soluzione di perfusione.
- Tampone di lisi dei globuli rossi (RBC): Utilizzare il tampone di lisi RBC come menzionato dal produttore.
NOTA: Fare riferimento alla tabella dei materiali per l'elenco dei reagenti e delle apparecchiature utilizzate in questo studio.
- Eutanasia del topo mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (150 mg/kg).
- Dissezione cardiaca
- Posizionare il mouse in posizione supina fissando gli arti posteriori in posizione con del nastro adesivo.
- Spruzzare il corpo con etanolo al 70% e quindi tagliare verticalmente attraverso la pelle addominale e i muscoli evitando di perforare il fegato. Apri con attenzione il torace evitando di perforare il cuore.
- Utilizzare il PBS pre-raffreddato (PH 7.4) per perfondere il ventricolo sinistro fino a quando non si osserva il fluido di perfusione incolore (sono necessari circa 15 ml di PBS [pH 7,4]).
- Sollevare delicatamente il cuore dal torace con una pinza e tagliare via il tessuto in eccesso attaccato all'esterno del cuore con le forbici oftalmiche. Posizionare il cuore in 1 mL di PBS pre-raffreddato (PH 7,4) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
- Dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco
- Trasferire il cuore del topo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 150 μL del tampone di dissociazione del tessuto cardiaco posto sul ghiaccio e tagliarlo in piccoli pezzi (~ 1 mm) con una forbice.
- Trasferire il tessuto cardiaco tritato in una provetta da centrifuga da 15 ml con 5 ml di tampone di dissociazione tissutale.
NOTA: Il volume raccomandato del tampone di dissociazione del tessuto cardiaco è di 5 ml/cuore. - Posizionare il tubo della centrifuga nell'agitatore alternativo termostatico elettricamente a 125 giri/min per 1 h a 37 °C. Pipet la sospensione di tessuto su e giù 10 volte ogni 20 minuti.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm per rimuovere il tessuto non digerito e i grumi. Aggiungere 25 ml del tampone di lavaggio cellulare per risciacquare il tubo originale, quindi trasferirlo per risciacquare il filtro cellulare. Quindi, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm per rimuovere ulteriormente i grumi di cellule.
- Centrifugare la sospensione di celle filtrate a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante, quindi risospendere il campione di cellule in 1x tampone di lisi RBC per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Aggiungere quattro volte più volume del tampone di lavaggio cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml del tampone di lavaggio cellulare. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL del tampone di lavaggio cellulare.
- Mescolare 18 μL della sospensione cellulare con 2 μL di soluzione colorante di acridina arancione (AO)/ioduro di propidio (PI) (9:1) e aggiungere 10 μL della miscela in un vetrino della camera di conteggio. Valutare il numero di celle e la vitalità utilizzando un contatore automatico delle celle.
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Representative Results
Una sospensione unicellulare ad alta vitalità è stata ottenuta implementando la sezione 2 di questo protocollo. Tuttavia, i frammenti cellulari potevano ancora essere osservati (Figura 1A); quindi, è stata eseguita la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per migliorare ulteriormente la qualità16. Dopo FACS, la dimensione media della cellula si riduce da 9,6 μm a 9,1 μm ( Tabella 1), il che suggerisce che la proporzione di frammenti cellulari può essere efficacemente ridotta nella sospensione cellulare da FACS (Figura 1B). La strategia di gating utilizzata per FACS è illustrata nella Figura 1C.
Oltre alle immagini nella Figura 1, la concentrazione cellulare, la dimensione media delle cellule e la vitalità cellulare sono state misurate da un contatore cellulare (Tabella 1). Le differenze nelle concentrazioni cellulari erano dovute al volume della sospensione cellulare. Evidentemente, la dimensione media delle cellule è diminuita dopo FACS (Tabella 1), il che mostra che FACS può ridurre efficacemente l'aggregazione cellulare e rimuovere frammenti cellulari.
ScRNA-seq è stato eseguito per studiare il microambiente immunologico cardiaco verificando la qualità della sospensione cellulare ottenuta attraverso questo protocollo. Dopo aver preparato la sospensione monocellulare, abbiamo prima selezionato le cellule che esprimevano la proteina di superficie CD45, che è un marker comune per una vasta gamma di cellule immunitarie. Successivamente, abbiamo eseguito scRNA-seq su cellule CD45+ utilizzando la piattaforma 10X Genomics17. In questo modo, abbiamo raggruppato 14.217 singole cellule da tre campioni di cuore sano in un set di dati unito dopo il controllo di qualità (Tabella 2). Il clustering non supervisionato e la riduzione della dimensionalità t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) hanno mostrato un'ovvia separazione di sette tipi di cellule immunitarie (Figura 2). Inoltre, ogni tipo di cellula immunitaria ha mostrato un'alta espressione di marcatori classici. In conclusione, questi risultati mostrano che la sospensione a singola cellula preparata da questo protocollo ha un'elevata potenza per il sequenziamento a singola cellula.
Figura 1: Vitalità cellulare nella sospensione cardiaca monocellulare. (A) Vitalità cellulare senza FACS. Le punte delle frecce nere indicano frammenti cellulari (nessuna fluorescenza). (B) Vitalità cellulare con FACS. La freccia gialla indica le cellule vive (fluorescenza verde) e la freccia rossa indica le cellule morte (fluorescenza rossa). (C) Strategia di gating. Barra scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di cellule cardiache CD45+ da tre campioni di cuore di topo. (A) Diagramma tSNE delle cellule CD45+ che mostra le popolazioni di cellule immunitarie identificate sulla base dei geni marcatori canonici. (B) Mappa di calore dei primi cinque geni differenzialmente espressi in ciascuna sottopopolazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Prima di FACS | Dopo FACS | |
| Concentrazione cellulare totale (cellule/ml) | 1,51 x 106 | 3,40 x 105 |
| Concentrazione di cellule vive (cellule/ml) | 1,40 x 106 | 3,15 x 105 |
| Concentrazione di cellule morte (cellule/ml) | 1,09 x 105 | 2,48 x 104 |
| Viabilità (%) | 92.8 | 92.7 |
| Dimensione media delle celle (μm) | 9.6 | 9.1 |
Tabella 1: Sospensione cardiaca monocellulare prima e dopo FACS. Le densità cellulari della sospensione cardiaca monocellulare ottenuta prima e dopo FACS vengono confrontate utilizzando un contatore cellulare automatizzato.
| Stime | |
| Numero stimato di celle | 14,217 |
| Letture medie per cella | 81,017 |
| Geni mediani per cellula | 1,374 |
| Totale geni rilevati | 18,424 |
| Conteggi UMI mediani per cella | 4,021 |
| Codici a barre validi | 98.4% |
| Legge mappato sul genoma | 95.1% |
Tabella 2: Statistiche del controllo di qualità. La tabella elenca le diverse stime dei dati a singola cellula di cuori di topo sani.
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Discussion
Questo articolo mirava a descrivere un protocollo per isolare singoli non cardiomiociti da cuori di topo post MI. Il protocollo può essere applicato per isolare diversi tipi di cellule nel microambiente post-MI con alta qualità, comprese le cellule immunitarie, le cellule endoteliali e i fibroblasti. Tre fattori essenziali sono cruciali per ottenere una sospensione cellulare di alta qualità per il sequenziamento di singole cellule. Il primo è l'impostazione della digestione enzimatica. È importante controllare il tempo di digestione e il volume e la concentrazione degli enzimi digestivi per assicurare sia la vitalità cellulare che l'efficienza di isolamento. In questo caso, abbiamo opportunamente aumentato la concentrazione dell'enzima e prolungato il tempo di digestione. Qui, si consiglia una durata della digestione da 45 minuti a 1 ora. Una durata più breve può aumentare la vitalità cellulare, ma può portare a una digestione insufficiente del tessuto cardiaco e può aumentare la quantità di grumi cellulari. Inoltre, abbiamo usato DNasi I per prevenire l'aggregazione cellulare perché le cellule litiche possono rilasciare DNA libero per avvolgere le cellule circostanti per formare grumi cellulari13. Il secondo fattore essenziale è l'utilizzo di una soluzione di lavaggio cellulare contenente BSA o FBS. BSA o FBS possono non solo proteggere l'attività degli enzimi, ma anche migliorare la vitalità delle cellule. L'ultimo fattore essenziale è facilitare FACS per eliminare frammenti cellulari e cellule morte. I frammenti cellulari possono causare un conteggio e una vitalità imprecisi delle cellule. Questi fattori insieme migliorano la vitalità e la purezza della sospensione cellulare, rendendola più compatibile con il sequenziamento a singola cellula.
Questo protocollo descrive in primo luogo la preparazione della sospensione cellulare per il sequenziamento di singole cellule e include anche procedure aggiuntive per migliorare la qualità della sospensione cellulare a un costo relativamente basso. Rispetto ad altri protocolli utilizzati da studi precedenti, evitiamo di utilizzare enzimi digestivi che possono causare l'aggregazione di cellule indotta dal DNA libero, come la tripsina14. La rimozione dei detriti cellulari è una delle maggiori sfide per gli studi a singola cellula e alcuni studi utilizzano kit di rimozione delle cellule morte per migliorare la vitalità cellulare prima di eseguire i campioni14,15. Tuttavia, qui, suggeriamo di utilizzare FACS per migliorare la purezza del campione grazie alla sua elevata efficacia nel ridurre le cellule morte e i detriti.
La sospensione unicellulare ottenuta da questo protocollo può essere ulteriormente analizzata mediante analisi a flusso o coltura cellulare primaria (procedure asettiche standard)18. Poiché gli enzimi digestivi sono relativamente miti, è adatto per digerire il tessuto cardiaco prelevato in diversi stadi dell'infarto miocardico, così come quello di cuori sani. Tuttavia, questo protocollo ha alcune limitazioni. Ad esempio, una digestione prolungata a 37 °C favorisce inevitabilmente l'espressione dei geni dello stress19,20. Questa limitazione può essere risolta utilizzando proteasi attiva a bassa temperatura o riducendo il tempo di digestione seguito da FACS. Inoltre, questo protocollo non include l'isolamento dei cardiomiociti e, quindi, non è adatto per studi sulle risposte tissutali locali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di scienze naturali della provincia di Zhejiang (LQ22H020010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
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