Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד כמות מספקת של לא-קרדיומיוציטים בודדים עם כדאיות גבוהה מלב עכבר לאחר אוטם שריר הלב (MI). זה יכול לשמש לריצוף תא בודד לאחר מכן, ניתוח ציטומטריית זרימה, ותרבית תאים ראשונית.
Abstract
אוטם שריר הלב (MI) היא אחת ממחלות הלב וכלי הדם הנפוצות ביותר, עם תמותה גוברת ברחבי העולם. לא-קרדיומיוציטים מהווים יותר ממחצית מכלל אוכלוסיית תאי הלב, והם תורמים לפיצויים אדפטיביים על פגיעה בשריר הלב, כולל תגובות דלקתיות, תיקון רקמות והיווצרות צלקות. כדי לחקור את המיקרו-סביבה הלבבית שלאחר MI, ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) נמצא בשימוש נרחב לזיהוי סוגים שונים של תאי לב ותקשורת בין-תאית. בין ההליכים של הכנת דגימת scRNA-seq, הכנת תרחיף התא הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר, מכיוון שיכולת הקיום של התא יכולה להשפיע על איכות תוצאות scRNA-seq. לכן, תכננו פרוטוקול ניסיוני להכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים מלבבות עכברים לאחר MI עם דגש נוסף על שיפור יכולת הקיום של התא על ידי בחירת אנזימי עיכול עדינים, שליטה בזמן העיכול ויישום מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS). לבסוף, בודדנו תאי CD45+ מתרחיף התאים שאינו קרדיומיוציטים המתקבל באמצעות פרוטוקול זה, ולאחר מכן ביצענו scRNA-seq.
Introduction
אוטם שריר הלב (MI) היא אחת ממחלות הלב וכלי הדם הנפוצות ביותר, ותמותה עולה ברחבי העולם1. MI נגרמת על ידי אספקת דם לא מספקת לשריר הלב שמסביב, אשר יכול להיות תוצאה של חסימת עורקים כליליים המתרחשת עם קרע רובד טרשתי. למרות שהתערבות כלילית מלעורית (PCI) הפחיתה את שיעורי התמותה של חולי MI חריפים, השכיחות הגבוהה של אי ספיקת לב לאחר MI נותרה בעיה2. הפתופיזיולוגיה העיקרית העומדת בבסיס אי ספיקת לב לאחר MI היא תגובת הפיצוי של הגוף לפגיעות לב, הכוללת החלפת שריר הלב המת בצלקות פיברוטיות שאינן מתכווצות. תגובות אדפטיביות אלה מסתמכות באופן משמעותי על דלקת מקומית המתווכת על ידי אינטראקציות בין סוגי תאים מרובים ותאי רקמת לב, ודלקת זו נחשבת כיום כיעד טיפולי פוטנציאלי להפחתת היווצרות צלקות פיברוטיות, ובכך להגן מפני אי ספיקת לב שלאחר MI 3,4. באופן מעניין, המיקרו-סביבה באתר אוטם חווה מעבר תלוי זמן בסוגי התאים החודרים ובתפקודים בשלבים שונים של MI 1,5. מחקרים רבים הראו כי לא-קרדיומיוציטים (למשל, תאי מערכת החיסון, פיברובלסטים ותאי אנדותל) ממלאים תפקידים מרכזיים בדלקת שלאחר MI ובתיקון רקמות 5,6. בשנים האחרונות, ריצוף חד-תאי נמצא בשימוש נרחב ככלי רב עוצמה להבהרת המעורבות והתפקודים של לא-קרדיומיוציטים במיקרו-סביבה 7,8 שלאחר MI. זה מספק תובנות לגבי הפתופיזיולוגיה של פציעה ותיקון לאחר MI ופיתוח טיפולים פוטנציאליים נגד אי ספיקת לב לאחר MI.
ריצוף RNA בתפוקה גבוהה (RNA-Seq) היא טכניקה המשמשת לחקר תעתיקים שלמים בפירוט רב באמצעות ריצוף הדור הבא (NGS)7,8,9. לאחרונה, הפיתוח של scRNA-Seq חולל מהפכה בתחום המחקר הביו-רפואי. בהשוואה לריצוף קונבנציונלי בתפזורת, scRNA-Seq מנתח פרופילי ביטוי גנים והטרוגניות שעתוק ברמת התא הבודד 7,8. טכניקה זו מקדמת באופן משמעותי את המחקר של הפתופיזיולוגיה התאית של MI 9,10 על ידי זיהוי סוגי תאים שונים במחזור הדם במיקרו-סביבה שלאחר MI וחשיפת האינטראקציה בין קרדיומיוציטים ושאינם קרדיומיוציטים. ממצאים אלה תורמים עוד יותר לחשיפת מטרות טיפוליות חדשות לאי ספיקת לב לאחר MI. באופן כללי, ניסוי הפוסט-MI מבוסס scRNA-seq כולל שלושה חלקים עיקריים: (1) ביסוס מודל בעלי חיים פוסט-MI; (2) הכנת השעיית התא; ו-(3) ריצוף מדגם וניתוח נתונים. באופן בולט, הכנת תרחיף התא היא השלב הקריטי ביותר בהכנת ניסוי scRNA-Seq מכיוון שאיכות תרחיף התא קובעת את דיוק התוצאות.
פרוטוקול זה נועד לחלץ תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים מרקמת הלב שלאחר MI; באופן משמעותי, הפרטים הספציפיים לשמירה על כדאיות התא ורזולוציה נכללים. בינתיים, את הציוד המשמש בפרוטוקול זה, כגון ערכות ניתוח לעכברים, מנשמי מכרסמים וצנטריפוגות, ניתן למצוא ברוב מרכזי הניסויים בבעלי חיים ובמעבדות ביו-רפואיות, ולכן עלות הניסוי של פרוטוקול זה נמוכה יחסית. יתר על כן, אם לוקחים בחשבון נקודות זמן ואתרים של אוטם כמשתנים, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לדמות מגוון רחב של תרחישים קליניים, במיוחד עבור סיבוכים לאחר MI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת ג'ג'יאנג ואושרו על ידי הוועדה המייעצת לבעלי חיים באוניברסיטת ג'ג'יאנג.
1. ניתוח קשירת עורקים כליליים יורדת קדמית שמאלית (קשירת LAD)
הערה: עכברי C57BL/6J זכרים בני שמונה שבועות שימשו כמודלים. הלבבות נקצרו שבועיים לאחר MI. ניתוח קשירת עורקים כליליים יורד קדמי שמאלי בוצע כמתואר קודם והדגים11.
- יש לחטא את כלי הניתוח באתנול 70% לפני הניתוח.
- לשקול את העכבר, ולאחר מכן להרדים את העכבר עם זריקות intraperitoneal של 1% נתרן pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג). שימו לב לרפלקס צביטת הבוהן ומדדו את קצב הנשימה כדי להעריך את עומק ההרדמה במהלך ההליך.
- הניחו את העכבר על שולחן הניתוחים עם כרית חימום בטמפרטורה של 37°C. השתמש משחה אופתלמית כדי למנוע התייבשות העין.
- לנטרל את החזה והצוואר השמאלי שלו עם קרם depilatory, ולהשתמש בצמר גפן כדי להסיר שערות. יש לחטא את עורו ביודופור, ולאחר מכן לשתות 70% אלכוהול כדי לנקות את האזור שלוש פעמים.
- ביצוע חתך צוואר הרחם בקו האמצע (0.8-1.0 ס"מ) תחת מיקרוסקופ. הפרידו את העור, השרירים והרקמה המקיפים את קנה הנשימה, ולאחר מכן הכניסו צינורית 20 גרם לקנה הנשימה.
הערה: יש להתבונן בעת החדרת הצינורית לקנה הנשימה במבט מיקרוסקופי כדי לוודא שהצינורית אינה מוחדרת לוושט. - חבר את העכבר למאוורר מכרסם המוגדר בנפח גאות של 0.2 מ"ל עם 150 פעימות לדקה.
- חותכים את חזה העכבר בצורה אלכסונית לאורך קו אמצע הקלאוויקולר בעזרת מספריים סטריליים. לנתח את הרקמה תת עורית כדי לחשוף את הצלעות.
- השתמש מספריים סטריליים לחתוך את העור באלכסון לאורך קו אמצע clavicular שמאל (0.8-1.0 ס"מ). בצע בית החזה השמאלי כדי להפריד את הצלעות השלישית והרביעית כדי לחשוף את הלב. השתמש במסיר צלעות לקבלת תצוגה ברורה.
- פתח את קרום הלב עם מלקחיים מעוקלים, ולאחר מכן לקשור את העורק היורד הקדמי השמאלי (מתחת לנספח אטריום שמאל) באמצעות תפר משי 7-0. קיר קדמי חיוור של החדר השמאלי מצביע על כך שזילוח שריר הלב נקטע בהצלחה.
- שחררו את מסיר הצלעות, ותפרו את חתך בית החזה בשכבות עם תפר משי 5-0 תוך הוצאת אוויר מהחזה. תפרו את החתך בצוואר בתפר משי 5-0.
- הסר את צינור קנה הנשימה מהעכבר ברגע שהנשימה הספונטנית שלו משוחזרת. הזרקה intraperitoneally 0.5 מ"ל של מלח סטרילי מחומם מראש. הזריקו buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) כל 12 שעות תת עורית כדי למזער את הכאב.
- לבסוף, הניחו את העכבר על כרית החימום כדי להמתין להחייאה. עקוב אחר העכבר כדי לוודא שהוא אינו סובל מקוצר נשימה מוגזם או דימום באמצעות תצפית חזותית.
- החזירו את העכבר לכלוב שלו לאחר שהוא מתעורר. בשבוע הראשון, עקבו אחר העכבר מדי יום כדי לוודא שהרגלי הניידות, הטיפוח והאכילה שלו מספקים. על פי צרכי הניסוי, לקצור את הלב בנקודות זמן שונות לאחר MI.
הערה: בפרוטוקול זה, התרחיף החד-תאי הוכן עם הלב שבועיים לאחר MI.
2. הכנת ההשעיה של תא בודד לב
- הכנת הפתרונות והמדיה
- חיץ דיסוציאציה של רקמת הלב: יש לערבב 10 מ"ג של collagenase IV (600 U/mL), 5 מ"ג של dispase II (0.5 U/mL) ו-50 μL של DNase I (100 מיקרוגרם/מ"ל) ב-5 מ"ל של RPMI 1640. יש לחמם מראש את הטמפרטורה הבינונית ל-37°C באמבט מים לפני השימוש.
- חיץ לשטיפת תאים: הכינו 1% BSA או 10% FBS במי מלח חוצצי פוספט (PBS, PH 7.4), ושמרו על טמפרטורה של 4°C או על קרח.
- פתרון זילוח: PBS טרום קירור (PH 7.4) כתמיסת זילוח.
- מאגר ליזה של תאי דם אדומים (RBC): השתמש במאגר הליזה של RBC כפי שצוין על-ידי היצרן.
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימת הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש במחקר זה.
- הרדימו את העכבר על ידי הזרקת נתרן פנטוברביטלי תוך צפקי (150 מ"ג/ק"ג).
- דיסקציה של הלב
- הניחו את העכבר במצב שכיבה על ידי קיבוע הגפיים האחוריות שלו במקומן בעזרת סרט הדבקה.
- רססו את הגוף באתנול 70%, ולאחר מכן חתכו אנכית דרך עור הבטן והשרירים תוך הימנעות מפירסינג בכבד. פתחו בזהירות את בית החזה תוך הימנעות מניקוב הלב.
- השתמש PBS מקורר מראש (PH 7.4) כדי לנקב את החדר השמאלי עד נוזל זילוח חסר צבע הוא ציין (כ 15 מ"ל של PBS [pH 7.4] נדרש).
- הרימו בעדינות את הלב מבית החזה בעזרת מלקחיים, וחתכו את הרקמה העודפת המחוברת לחלק החיצוני של הלב בעזרת מספריים אופתלמיים. מקם את הלב ב 1 מ"ל של PBS מקורר מראש (PH 7.4) בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- דיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב
- מעבירים את לב העכבר לבאר אחת של צלחת בת 24 בארות עם 150 מיקרוליטר של חיץ הדיסוציאציה של רקמת הלב המונח על קרח, וחתכו אותו לחתיכות קטנות (~ 1 מ"מ) בעזרת מספריים.
- מעבירים את רקמת הלב הטחונה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל עם 5 מ"ל של חיץ הדיסוציאציה של הרקמה.
הערה: נפח החיץ המומלץ לדיסוציאציה של רקמת הלב הוא 5 מ"ל ללב. - הניחו את צינור הצנטריפוגה בשייקר הגומלין התרמוסטטי החשמלי ב-125 סל"ד למשך שעה אחת ב-37°C. מפטמים את מתלה הרקמה למעלה ולמטה 10 פעמים כל 20 דקות.
- סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר רקמות לא מעוכלות וגושים. הוסף 25 מ"ל של חיץ שטיפת התא כדי לשטוף את הצינור המקורי, ולאחר מכן להעביר אותו כדי לשטוף את מסננת התא. לאחר מכן, סנן את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר עוד יותר גושי תאים.
- צנטריפוגה את מתלה התא המסונן ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופר-נטנט ולאחר מכן השהו מחדש את דגימת התא במאגר ליזה RBC 1x למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הוסף נפח גדול פי ארבעה של מאגר שטיפת התא, וצנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
- הסר את supernatant, ו resuspend את התאים ב 10 מ"ל של מאגר שטיפת התא. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- הסר את supernatant, ו resuspend את התאים ב 1 מ"ל של מאגר שטיפת התא.
- ערבבו 18 μL של תרחיף התא עם 2 μL של תמיסת צביעה של תפוז אקרידין (AO)/פרופידיום יודיד (PI) (9:1), והוסיפו 10 μL של התערובת לשקופית תא ספירה. הערך את מספרי התאים ואת הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרחיף חד-תאי בעל חיוניות גבוהה הושג על ידי יישום סעיף 2 לפרוטוקול זה. אולם עדיין ניתן היה לצפות במקטעי תאים (איור 1A); לפיכך, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) בוצע כדי לשפר עוד יותר את האיכות16. לאחר FACS, גודל התא הממוצע מצטמצם מ-9.6 מיקרומטר ל-9.1 מיקרומטר ( טבלה 1), מה שמרמז על כך שניתן להפחית ביעילות את חלקם של מקטעי התאים בתרחיף התא על-ידי FACS (איור 1B). אסטרטגיית ה-gating המשמשת עבור FACS מוצגת באיור 1C.
בנוסף לתמונות באיור 1, ריכוז התא, גודל התא הממוצע ויכולת הקיום של התא נמדדו על-ידי מונה תאים (טבלה 1). ההבדלים בריכוזי התאים נבעו מנפח תרחיף התא. באופן ניכר, גודל התא הממוצע ירד לאחר FACS (טבלה 1), מה שמראה ש-FACS יכול להפחית ביעילות את הצטברות התאים ולהסיר מקטעי תאים.
ScRNA-seq בוצע כדי לחקור את המיקרו-סביבה החיסונית של הלב תוך אימות איכות תרחיף התאים המתקבלת באמצעות פרוטוקול זה. לאחר הכנת התרחיף החד-תאי, מיינו תחילה את התאים המבטאים את חלבון פני השטח CD45, שהוא סמן נפוץ למגוון רחב של תאי מערכת החיסון. לאחר מכן, ביצענו scRNA-seq על תאי CD45+ באמצעות פלטפורמת 10X Genomics17. בדרך זו, איגמנו 14,217 תאים בודדים משלוש דגימות לב בריאות למערך נתונים ממוזג לאחר בקרת איכות (טבלה 2). ההתקבצות הבלתי מפוקחת וההפחתה בממדיות השכנה הסטוכסטית מבוזרת t (t-SNE) הראו הפרדה ברורה של שבעה סוגים של תאי חיסון (איור 2). יתר על כן, כל סוג תא חיסון הראה ביטוי גבוה של סמנים קלאסיים. באופן חד משמעי, תוצאות אלה מראות כי לתרחיף התא הבודד שהוכן על ידי פרוטוקול זה יש עוצמה גבוהה לריצוף תא יחיד.
איור 1: כדאיות התא בתרחיף הלב החד-תאי. (A) כדאיות התא ללא FACS. ראשי החץ השחורים מציינים שברי תאים (ללא פלואורסצנטיות). (B) כדאיות התא עם FACS. החץ הצהוב מציין תאים חיים (פלואורסצנטיות ירוקה), והחץ האדום מציין תאים מתים (פלואורסצנטיות אדומה). (ג) אסטרטגיית גאטינג. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ריצוף RNA חד-תאי של תאי CD45+ לבביים משלוש דגימות לב של עכברים. (A) תרשים tSNE של תאי CD45+ המציג את אוכלוסיות תאי החיסון שזוהו בהתבסס על גנים סמנים קנוניים. (B) מפת חום של חמשת הגנים המובילים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בכל תת-אוכלוסייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| לפני FACS | אחרי FACS | |
| ריכוז תאים כולל (תאים/מ"ל) | 1.51 x 106 | 3.40 x 105 |
| ריכוז תאים חיים (תאים/מ"ל) | 1.40 x 106 | 3.15 x 105 |
| ריכוז תאים מתים (תאים/מ"ל) | 1.09 x 105 | 2.48 x 104 |
| כדאיות (%) | 92.8 | 92.7 |
| גודל תא ממוצע (מיקרומטר) | 9.6 | 9.1 |
טבלה 1: תרחיף לב חד-תאי לפני ואחרי FACS. צפיפות התאים של תרחיף הלב החד-תאי המתקבל לפני ואחרי FACS מושווית באמצעות מונה תאים אוטומטי.
| הערכות | |
| מספר תאים משוער | 14,217 |
| ממוצע קריאות לכל תא | 81,017 |
| חציון גנים לתא | 1,374 |
| סה"כ גנים שזוהו | 18,424 |
| חציון UMI נחשב לכל תא | 4,021 |
| ברקודים חוקיים | 98.4% |
| קורא ממופה לגנום | 95.1% |
טבלה 2: סטטיסטיקה של בקרת איכות. הטבלה מפרטת את האומדנים השונים של נתוני התא הבודד של לבבות עכברים בריאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול לבידוד יחיד שאינו קרדיומיוציטים מלבבות עכברים לאחר MI. ניתן ליישם את הפרוטוקול כדי לבודד סוגים שונים של תאים במיקרו-סביבה שלאחר MI באיכות גבוהה, כולל תאי מערכת החיסון, תאי אנדותל ופיברובלסטים. שלושה גורמים חיוניים חיוניים להשגת תרחיף תאים איכותי לריצוף תא יחיד. הראשון הוא הגדרת העיכול האנזימטי. חשוב לשלוט בזמן העיכול ובנפח ובריכוז של אנזימי העיכול כדי להבטיח הן את יכולת הקיום של התאים והן את יעילות הבידוד. במקרה זה, הגדלנו כראוי את ריכוז האנזים והארכנו את זמן העיכול. כאן, אנו ממליצים על משך העיכול של 45 דקות עד 1 שעות. משך זמן קצר יותר עשוי להגדיל את יכולת הקיום של התא, אך עלול להוביל לעיכול לא מספיק של רקמת הלב ולהגדיל את כמות גושי התאים. נוסף על כך, השתמשנו בדנ"ז I כדי למנוע צבירת תאים מאחר שתאים ליטיים יכולים לשחרר דנ"א חופשי כדי לעטוף את התאים הסובבים אותם וליצור גושי תאים13. הגורם החיוני השני הוא שימוש בתמיסת שטיפת תאים המכילה BSA או FBS. BSA או FBS יכולים לא רק להגן על פעילות האנזימים, אלא גם לשפר את הכדאיות של התאים. הגורם החיוני האחרון הוא הקלה על FACS כדי לחסל שברי תאים ותאים מתים. מקטעי תאים עלולים לגרום לספירת תאים לא מדויקת ולכדאיות. גורמים אלה יחד משפרים את הכדאיות והטוהר של תרחיף התא, מה שהופך אותו תואם יותר לריצוף תא יחיד.
פרוטוקול זה מתאר תחילה את הכנת תרחיף התא לריצוף תא בודד, והוא כולל גם הליכים נוספים לשיפור איכות תרחיף התא בעלות נמוכה יחסית. בהשוואה לפרוטוקולים אחרים ששימשו מחקרים קודמים, אנו נמנעים משימוש באנזימי עיכול שיכולים לגרום לצבירה של תאים המושרים על ידי דנ"א חופשי, כגון טריפסין14. סילוק פסולת התא הוא אחד האתגרים העיקריים במחקרים על תאים בודדים, וכמה מחקרים משתמשים בערכות להסרת תאים מתים כדי לשפר את כדאיות התא לפני הרצת הדגימות14,15. עם זאת, כאן, אנו ממליצים להשתמש ב- FACS כדי לשפר את טוהר הדגימה בשל יעילותו הגבוהה בהפחתת תאים מתים ופסולת.
התרחיף החד-תאי המתקבל על ידי פרוטוקול זה ניתן לניתוח נוסף על ידי ניתוח זרימה או תרבית תאים ראשונית (הליכים אספטיים סטנדרטיים)18. מכיוון שאנזימי העיכול קלים יחסית, הוא מתאים לעיכול רקמת לב שנלקחה בשלבים שונים של MI, כמו גם זו מלב בריא. עם זאת, לפרוטוקול זה יש מגבלות מסוימות. לדוגמה, עיכול ממושך ב 37 ° C בהכרח מקדם את הביטוי של גנים מתח19,20. מגבלה זו יכולה להיפתר על ידי שימוש בפרוטאז פעיל בטמפרטורה נמוכה או הפחתת זמן העיכול ואחריו FACS. כמו כן, פרוטוקול זה אינו כולל בידוד קרדיומיוציטים, ולכן הוא אינו מתאים למחקרים על תגובות רקמות מקומיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מדעי הטבע של פרובינציית ג'ג'יאנג (LQ22H020010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Gu, J., et al. Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).
- Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Tzahor, E., Dimmeler, S. A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment. Science. 377 (6610), 4443 (2022).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Massaia, A., et al. Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
- Jin, K., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction. Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).
- Tombor, L. S., et al. Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction. Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).
- Gladka, M. M., et al. Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Garcia-Flores, V., et al. Preparation of single-cell suspensions from the human placenta. Nature Protocols. , (2022).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Hua, X., et al. Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis. Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).
- Grindberg, R. V., et al.
- Vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, 935-936 (2017).
