Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para isolar uma quantidade suficiente de cardiomiócitos únicos não cardiomiócitos com alta viabilidade de um coração de camundongo pós-infarto do miocárdio (IM). Isso pode ser usado para sequenciamento subsequente de célula única, análise de citometria de fluxo e cultura de células primárias.
Abstract
O infarto do miocárdio (IAM) é uma das doenças cardiovasculares mais comuns, com mortalidade crescente em todo o mundo. Os não-cardiomiócitos representam mais da metade da população total de células cardíacas e contribuem para compensações adaptativas em caso de lesão miocárdica, incluindo respostas inflamatórias, reparo tecidual e formação de cicatrizes. Para estudar o microambiente cardíaco pós-IM, o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) é amplamente utilizado para identificar diferentes tipos de células cardíacas e comunicações intercelulares. Dentre os procedimentos de preparação da amostra de scRNA-seq, o preparo da suspensão celular é uma das etapas mais críticas, pois a viabilidade celular pode afetar a qualidade dos resultados do scRNA-seq. Portanto, projetamos um protocolo experimental para preparar uma suspensão de células não-cardiomiócitos de corações de camundongos pós-IM com um foco extra em melhorar a viabilidade celular através da escolha de enzimas digestivas leves, controle do tempo de digestão e aplicação de classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Finalmente, isolamos as células CD45+ da suspensão de células não-cardiomiócitos obtidas através deste protocolo e, em seguida, realizamos scRNA-seq.
Introduction
O infarto do miocárdio (IAM) é uma das doenças cardiovasculares mais comuns e sua mortalidade está aumentando em todo omundo1. O IM é causado por um suprimento sanguíneo insuficiente para o miocárdio circundante, que pode ser resultado de um bloqueio da artéria coronária que ocorre com a ruptura da placa aterosclerótica. Embora a intervenção coronária percutânea (ICP) tenha reduzido as taxas de mortalidade de pacientes com IAM agudo, a alta prevalência de insuficiência cardíaca pós-IAM continua sendo um problema2. A principal fisiopatologia subjacente à insuficiência cardíaca pós-IM é a resposta compensatória do organismo às lesões cardíacas, que envolve a substituição do músculo cardíaco morto por cicatrizes fibróticas não contráteis. Essas respostas adaptativas dependem significativamente da inflamação local mediada pelas interações entre múltiplos tipos celulares e células do tecido cardíaco, e essa inflamação é atualmente considerada como um potencial alvo terapêutico para reduzir a formação de cicatriz fibrótica e, assim, proteger contra a insuficiência cardíacapós-IAM3,4. Curiosamente, o microambiente no local do infarto experimenta uma transição tempo-dependente nos tipos e funções celulares infiltrantes em diferentes estágios do IM 1,5. Muitos estudos têm demonstrado que os não-cardiomiócitos (por exemplo, células imunes, fibroblastos e células endoteliais) desempenham papéis centrais na inflamação pós-infarto agudo do miocárdio e no reparo tecidual 5,6. Nos últimos anos, o sequenciamento unicelular tem sido amplamente utilizado como uma poderosa ferramenta para elucidar o envolvimento e as funções de não-cardiomiócitos no microambiente pós-IM7,8. Isso fornece informações sobre a fisiopatologia da lesão e reparo pós-IM e o desenvolvimento de terapias potenciais contra a insuficiência cardíaca pós-IAM.
O sequenciamento de RNA de alto rendimento (RNA-Seq) é uma técnica usada para estudar transcriptomas inteiros em grande detalhe usando sequenciamento de próxima geração (NGS)7,8,9. Recentemente, o desenvolvimento do scRNA-Seq revolucionou o campo da pesquisa biomédica. Em comparação com o sequenciamento convencional em massa, o scRNA-Seq analisa perfis de expressão gênica e heterogeneidade transcricional em nível unicelular 7,8. Essa técnica promove significativamente a pesquisa da fisiopatologia celular do IM 9,10 ao identificar diferentes tipos celulares circulantes no microambiente pós-IM e desvendar a interação entre cardiomiócitos e não cardiomiócitos. Esses achados contribuem ainda mais para a descoberta de novos alvos terapêuticos para a insuficiência cardíaca pós-IAM. Em geral, o experimento pós-MI baseado em scRNA-seq inclui três seções principais: (1) o estabelecimento do modelo animal pós-IM; (2) a preparação da suspensão celular; e (3) sequenciamento das amostras e análise dos dados. Notavelmente, a preparação da suspensão celular é a etapa mais crítica na preparação do experimento scRNA-Seq, pois a qualidade da suspensão celular determina a precisão dos resultados.
Este protocolo é projetado para extrair uma suspensão de células não-cardiomiócitos do tecido cardíaco pós-IM; Significativamente, os detalhes específicos para manter a viabilidade e resolução da célula são incluídos. Enquanto isso, os equipamentos utilizados nesse protocolo, como kits cirúrgicos para camundongos, ventiladores de roedores e centrífugas, podem ser encontrados na maioria dos centros de experimentação animal e laboratórios biomédicos, e, portanto, o custo do experimento desse protocolo é relativamente baixo. Além disso, se considerados os momentos e locais de infarto como variáveis, esse protocolo pode ser aplicado para simular uma ampla gama de cenários clínicos, especialmente para as complicações pós-IM.
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Protocol
Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório na Universidade de Zhejiang e foram aprovados pelo Comitê Consultivo Animal da Universidade de Zhejiang.
1. Cirurgia de ligadura da artéria coronária descendente anterior (ligadura da ADA)
NOTA: Camundongos C57BL/6J machos com oito semanas de idade foram utilizados como modelos. Os corações foram colhidos 2 semanas após o IM. A cirurgia de ligadura da artéria coronária descendente anterior foi realizada como previamente descrito e demonstrado11.
- Desinfetar os instrumentais cirúrgicos com etanol 70% antes da cirurgia.
- Pesar o rato e, em seguida, anestesiar o rato com injeções intraperitoneais de pentobarbital sódico a 1% (50 mg/kg). Observe o reflexo de pinça dos pés e meça a frequência respiratória para avaliar a profundidade da anestesia durante o procedimento.
- Coloque o rato na mesa de operação com uma almofada de aquecimento a 37 °C. Use pomada oftálmica para evitar a desidratação ocular.
- Depilar o peito e o pescoço precordiais esquerdos com creme depilatório e usar cotonetes para remover os pelos. Desinfetar a pele com iodóforo, seguido de álcool a 70% para limpar a área três vezes.
- Realizar uma incisão cervical mediana (0,8-1,0 cm) ao microscópio. Separe a pele, o músculo e o tecido ao redor da traqueia e, em seguida, insira uma cânula de 20 G na traqueia.
NOTA: Observe ao inserir a cânula na traqueia sob visão microscópica para garantir que o tubo não seja inserido no esôfago. - Conecte o mouse a um ventilador de roedores regulado para 0,2 mL de volume corrente com 150 golpes por minuto.
- Incisar obliquamente o tórax do rato ao longo da linha hemiclavicular com uma tesoura estéril. Dissecar o tecido subcutâneo para expor as costelas.
- Use tesoura estéril para cortar a pele obliquamente ao longo da linha hemiclavicular esquerda (0,8-1,0 cm). Realizar toracotomia esquerda para separar a terceira e quarta costelas para expor o coração. Use um afastador de costela para uma visão clara.
- Abrir o pericárdio com pinça curva e, em seguida, ligar a artéria descendente anterior esquerda (abaixo do apêndice do átrio esquerdo) usando uma sutura de seda 7-0. Uma parede anterior pálida do ventrículo esquerdo indica que a perfusão miocárdica é interrompida com sucesso.
- Solte o afastador de costelas e costurar a incisão torácica em camadas com uma sutura de seda 5-0 enquanto expele ar do tórax. Costurar a incisão do pescoço com uma sutura de seda de sutura 5-0.
- Remova o tubo traqueal do camundongo assim que sua respiração espontânea for restaurada. Injetar intraperitonealmente 0,5 mL de solução salina estéril pré-aquecida. Injetar buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 12 h por via subcutânea para minimizar a dor.
- Finalmente, coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento para aguardar a reanimação. Monitore o mouse para garantir que ele não sofra de dispneia excessiva ou hemorragia por meio da observação visual.
- Devolva o rato à sua gaiola depois de acordar. Durante a primeira semana, monitore o mouse diariamente para verificar se sua mobilidade, higiene e hábitos alimentares estão adequados. De acordo com as necessidades do experimento, colher o coração em diferentes momentos após o IM.
OBS: Neste protocolo, a suspensão unicelular foi preparada com o coração 2 semanas após o IM.
2. Preparo da suspensão unicelular cardíaca
- Preparação das soluções e mídias
- Tampão de dissociação do tecido cardíaco: Misturar 10 mg de colagenase IV (600 U/mL), 5 mg de dispase II (0,5 U/mL) e 50 μL de DNase I (100 μg/mL) em 5 mL de RPMI 1640. Pré-aqueça este meio a 37 °C em banho-maria antes de usar.
- Tampão de lavagem celular: Preparar BSA a 1% ou FBS a 10% em solução salina tamponada com fosfato (PBS, PH 7.4) e manter a 4 °C ou no gelo.
- Solução de perfusão: Pré-resfriar PBS (PH 7.4) como solução de perfusão.
- Tampão de lise de hemácias (RBC): Use o tampão de lise de hemácias conforme mencionado pelo fabricante.
OBS: Consulte a Tabela de Materiais para obter a lista de reagentes e equipamentos utilizados neste estudo.
- Eutanasiar o camundongo por uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (150 mg/kg).
- Dissecção cardíaca
- Coloque o rato em decúbito dorsal fixando os membros posteriores no lugar com fita adesiva.
- Borrife o corpo com etanol a 70% e, em seguida, corte verticalmente através da pele abdominal e músculos, evitando perfurar o fígado. Abra cuidadosamente o tórax, evitando perfurar o coração.
- Use o PBS pré-resfriado (PH 7,4) para perfundir o ventrículo esquerdo até que o fluido de perfusão incolor seja observado (aproximadamente 15 mL de PBS [pH 7,4] são necessários).
- Levante suavemente o coração do tórax com pinças e corte o excesso de tecido preso à parte externa do coração com tesoura oftálmica. Colocar o coração em 1 mL de PBS pré-resfriado (PH 7,4) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Dissociação enzimática do tecido cardíaco
- Transfira o coração de camundongo para um poço de uma placa de 24 poços com 150 μL do tampão de dissociação do tecido cardíaco colocado no gelo e corte-o em pequenos pedaços (~1 mm) com uma tesoura.
- Transfira o tecido cardíaco picado para um tubo de centrífuga de 15 mL com 5 mL do tampão de dissociação tecidual.
NOTA: O volume recomendado do tampão de dissociação do tecido cardíaco é de 5 mL/coração. - Colocar o tubo da centrífuga no agitador alternativo termostático eléctrico a 125 rpm durante 1 h a 37 °C. Pipetar a suspensão de tecido para cima e para baixo 10 vezes a cada 20 min.
- Filtrar a suspensão celular através de um filtro celular de 70 μm para remover o tecido não digerido e aglomerados. Adicione 25 mL do tampão de lavagem celular para enxaguar o tubo original e, em seguida, transfira-o para enxaguar o filtro celular. Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm para remover ainda mais os aglomerados celulares.
- Centrifugar a suspensão da célula filtrada a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda a amostra celular em 1x tampão de lise eritrocitária por 5 min à temperatura ambiente (TR).
- Adicionar quatro vezes mais volume do tampão de lavagem celular e centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mL do tampão de lavagem celular. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL do tampão de lavagem celular.
- Misturar 18 μL da suspensão celular com 2 μL de solução corante laranja de acridina (AO)/iodeto de propídio (PI) (9:1) e adicionar 10 μL da mistura a uma lâmina de câmara de contagem. Avalie o número de células e a viabilidade usando um contador automático de células.
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Representative Results
Uma suspensão unicelular com alta vitalidade foi obtida com a aplicação da seção 2 deste protocolo. No entanto, fragmentos celulares ainda puderam ser observados (Figura 1A); portanto, a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) foi realizada para melhorar ainda mais a qualidade16. Após o FACS, o tamanho médio das células diminui de 9,6 μm para 9,1 μm ( Tabela 1), o que sugere que a proporção de fragmentos celulares pode ser efetivamente reduzida na suspensão celular pelo FACS (Figura 1B). A estratégia de gating utilizada para a FACS é mostrada na Figura 1C.
Além das imagens da Figura 1, a concentração celular, o tamanho médio e a viabilidade celular foram medidos por um contador de células (Tabela 1). As diferenças nas concentrações celulares foram devidas ao volume de suspensão celular. Notavelmente, o tamanho médio das células diminuiu após o FACS (Tabela 1), o que mostra que o FACS pode efetivamente reduzir a aglomeração celular e remover fragmentos celulares.
ScRNA-seq foi realizado para estudar o microambiente imunológico cardíaco enquanto se verificava a qualidade da suspensão celular obtida através deste protocolo. Depois de preparar a suspensão de célula única, primeiramente classificamos as células que expressaram a proteína CD45 de superfície, que é um marcador comum para uma ampla gama de células imunes. Em seguida, realizamos scRNA-seq em células CD45+ utilizando a plataforma 10X Genomics17. Dessa forma, reunimos 14.217 células individuais de três amostras de coração saudável em um conjunto de dados mesclados após o controle de qualidade (Tabela 2). O agrupamento não supervisionado e a redução na dimensionalidade de incorporação de vizinhos estocásticos distribuídos em t (t-SNE) mostraram uma separação óbvia de sete tipos de células imunes (Figura 2). Além disso, cada tipo de célula imune apresentou alta expressão de marcadores clássicos. Conclusivamente, esses resultados mostram que a suspensão unicelular preparada por este protocolo tem alta potência para sequenciamento unicelular.
Figura 1: Viabilidade celular na suspensão cardíaca unicelular. (A) Viabilidade celular sem FACS. As pontas de seta pretas indicam fragmentos celulares (sem fluorescência). (B) Viabilidade celular com FACS. A seta amarela indica células vivas (fluorescência verde) e a seta vermelha indica células mortas (fluorescência vermelha). (C) Estratégia de gating. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sequenciamento de RNA de célula única de células CD45+ cardíacas de três amostras de coração de camundongo. (A) Gráfico de tSNE de células CD45+ mostrando as populações de células imunes identificadas com base em genes marcadores canônicos. (B) Mapa de calor dos cinco principais genes diferencialmente expressos em cada subpopulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Antes do FACS | Após o FACS | |
| Concentração celular total (células/mL) | 1,51 x 106 | 3,40 x 105 |
| Concentração de células vivas (células/mL) | 1,40 x 106 | 3,15 x 105 |
| Concentração de células mortas (células/mL) | 1,09 x 105 | 2,48 x 104 |
| Viabilidade (%) | 92.8 | 92.7 |
| Tamanho celular médio (μm) | 9.6 | 9.1 |
Tabela 1: Suspensão cardíaca unicelular antes e após a SACS. As densidades celulares da suspensão cardíaca unicelular obtidas antes e após a FACS são comparadas usando um contador de células automatizado.
| Estimativas | |
| Número estimado de células | 14,217 |
| Leituras médias por célula | 81,017 |
| Genes medianos por célula | 1,374 |
| Total de genes detectados | 18,424 |
| Contagens UMI medianas por célula | 4,021 |
| Códigos de barras válidos | 98.4% |
| Leituras mapeadas para o genoma | 95.1% |
Tabela 2: Estatísticas de controle de qualidade. A tabela lista as diferentes estimativas dos dados de célula única de corações de camundongos saudáveis.
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Discussion
O objetivo deste artigo foi descrever um protocolo para isolar cardiomiócitos únicos de corações de camundongos pós-IM. O protocolo pode ser aplicado para isolar diferentes tipos de células no microambiente pós-IM com alta qualidade, incluindo células imunes, células endoteliais e fibroblastos. Três fatores essenciais são cruciais para a obtenção de uma suspensão celular de alta qualidade para o sequenciamento de uma única célula. A primeira é a configuração da digestão enzimática. É importante controlar o tempo de digestão e o volume e concentração das enzimas digestivas para garantir a viabilidade celular e a eficiência do isolamento. Neste caso, aumentamos adequadamente a concentração da enzima e prolongamos o tempo de digestão. Aqui, recomendamos uma duração de digestão de 45 min a 1 h. Uma duração mais curta pode aumentar a viabilidade celular, mas pode levar à digestão insuficiente do tecido cardíaco e pode aumentar a quantidade de aglomerados celulares. Além disso, usamos DNase I para prevenir a agregação celular, pois as células líticas podem liberar DNA livre para envolver as células circundantes para formar aglomerados celulares13. O segundo fator essencial é o uso de uma solução de lavagem celular contendo BSA ou FBS. BSA ou FBS pode não só proteger a atividade das enzimas, mas também melhorar a viabilidade das células. O último fator essencial é facilitar a FACS para eliminar fragmentos celulares e células mortas. Fragmentos celulares podem resultar em uma contagem e viabilidade celular imprecisas. Esses fatores juntos aumentam a viabilidade e a pureza da suspensão celular, tornando-a mais compatível com o sequenciamento de célula única.
Este protocolo descreve primeiramente a preparação da suspensão celular para sequenciamento de célula única, e também inclui procedimentos adicionais para melhorar a qualidade da suspensão celular a um custo relativamente baixo. Em comparação com outros protocolos utilizados por estudos anteriores, evitamos o uso de enzimas digestivas que podem causar a agregação de células induzida pelo DNA livre, como a tripsina14. A remoção dos restos celulares é um dos grandes desafios para estudos unicelulares, e alguns estudos utilizam kits de remoção de células mortas para melhorar a viabilidade celular antes da execução dasamostras14,15. No entanto, aqui, sugerimos o uso de FACS para aumentar a pureza da amostra devido à sua alta eficácia na redução de células mortas e detritos.
A suspensão unicelular obtida por esse protocolo pode ser posteriormente analisada por análise de fluxo ou cultura de células primárias (procedimentos assépticos padrão)18. Como as enzimas digestivas são relativamente leves, é adequado para digerir o tecido cardíaco tomado em diferentes estágios do IM, bem como o de corações saudáveis. No entanto, esse protocolo apresenta algumas limitações. Por exemplo, a digestão prolongada a 37 °C promove inevitavelmente a expressão de genes de estresse 19,20. Esta limitação pode ser resolvida com o uso de protease ativa a baixa temperatura ou reduzindo o tempo de digestão seguido de FACS. Além disso, esse protocolo não inclui o isolamento de cardiomiócitos e, portanto, não é adequado para estudos de respostas teciduais locais.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos Fundos de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (LQ22H020010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
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