Summary
여기에서 우리는 심근 경색 후(MI) 마우스 심장에서 높은 생존력을 가진 충분한 양의 단일 비심근 세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이는 후속 단일 세포 시퀀싱, 유세포 분석 및 일차 세포 배양에 사용할 수 있습니다.
Abstract
심근경색증(MI)은 전 세계적으로 사망률이 증가하고 있는 가장 흔한 심혈관 질환 중 하나입니다. 비심근세포는 전체 심장 세포 집단의 절반 이상을 차지하며 염증 반응, 조직 복구 및 흉터 형성을 포함하여 심근 손상 시 적응 보상에 기여합니다. MI 후 심장 미세 환경을 연구하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 다양한 심장 세포 유형과 세포 간 통신을 식별하는 데 널리 사용됩니다. scRNA-seq 샘플 준비 절차 중 세포 현탁액을 준비하는 것은 세포 생존율이 scRNA-seq 결과의 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 따라서 우리는 약한 소화 효소를 선택하고, 소화 시간을 제어하고, 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 적용하여 세포 생존율을 향상시키는 데 추가로 중점을 두고 MI 후 마우스 심장에서 비심근세포 세포 현탁액을 준비하기 위한 실험 프로토콜을 설계했습니다. 마지막으로, 우리는 이 프로토콜을 통해 얻은 비심근세포 세포 현탁액에서 CD45+ 세포를 분리한 다음 scRNA-seq를 수행했습니다.
Introduction
심근경색증(Myocardial infarction, MI)은 가장 흔한 심혈관 질환 중 하나이며, 전 세계적으로 그 사망률이 증가하고 있다1. MI는 주변 심근으로의 혈액 공급이 불충분하여 발생하며, 이는 죽상동맥경화반 파열과 함께 발생하는 관상동맥 막힘의 결과일 수 있습니다. 경피적 관상동맥 중재술(PCI)이 급성 심근경색 환자의 사망률을 감소시켰지만, 심근경색 후 심부전의 높은 유병률은 여전히 문제로 남아 있다2. MI 후 심부전의 기초가 되는 주요 병태생리학은 죽은 심장 근육을 비수축성 섬유성 흉터로 대체하는 것을 포함하는 심장 손상에 대한 신체의 보상 반응입니다. 이러한 적응 반응은 여러 세포 유형과 심장 조직 세포 사이의 상호 작용에 의해 매개되는 국소 염증에 크게 의존하며, 이 염증은 이제 섬유성 흉터 형성을 감소시켜 MI 후 심부전을 예방하기 위한 잠재적인 치료 표적으로 간주됩니다 3,4. 흥미롭게도, 경색 부위의 미세환경은 MI 1,5의 상이한 단계에서 침윤 세포 유형 및 기능에서 시간 의존적 전이를 경험한다. 많은 연구에서 비심근세포(예: 면역 세포, 섬유아세포, 내피 세포)가 MI 후 염증 및 조직 복구에 중심적인 역할을 하는 것으로 나타났습니다 5,6. 최근 몇 년 동안, 단세포 시퀀싱은 MI 이후 미세 환경에서 비심근세포의 침범 및 기능을 설명하기 위한 강력한 도구로서 널리 사용되어 왔다 7,8. 이것은 MI 후 손상 및 복구의 병태생리학에 대한 통찰력과 MI 후 심부전에 대한 잠재적 치료법 개발에 대한 통찰력을 제공합니다.
고처리량 RNA 염기서열분석(RNA-Sequencing)은 차세대 염기서열분석(NGS)7,8,9을 사용하여 전체 전사체를 매우 자세히 연구하는 데 사용되는 기술입니다. 최근 scRNA-Seq의 개발은 생물의학 연구 분야에 혁명을 일으켰습니다. 기존의 대량 염기서열 분석과 비교하여 scRNA-Seq는 단일 세포 수준 7,8에서 유전자 발현 프로필과 전사 이질성을 분석합니다. 이 기술은 MI 후 미세 환경에서 다양한 순환 세포 유형을 식별하고 심근 세포와 비심근 세포 간의 상호 작용을 밝혀냄으로써 MI 9,10의 세포 병태생리학 연구를 크게 촉진합니다. 이러한 발견은 MI 후 심부전에 대한 새로운 치료 표적을 밝히는 데 더욱 기여합니다. 일반적으로, scRNA-seq-기반 MI 후 실험은 3개의 주요 섹션을 포함한다: (1) MI 후 동물 모델의 확립; (2) 세포 현탁액의 제조; (3) 샘플 시퀀싱 및 데이터 분석. 주목할 만한 것은, 세포 현탁액의 품질이 결과의 정확성을 결정하기 때문에 scRNA-Seq 실험의 준비에서 세포 현탁액을 준비하는 것이 가장 중요한 단계라는 것입니다.
이 프로토콜은 MI 후 심장 조직으로부터 비심근세포 세포 현탁액을 추출하도록 설계되었습니다. 중요한 것은 세포 생존율 및 분해능을 유지하기 위한 구체적인 세부 사항이 포함되어 있다는 것입니다. 한편, 생쥐용 수술 키트, 설치류 인공호흡기, 원심분리기 등 이 프로토콜에 사용되는 장비는 대부분의 동물 실험 센터 및 생물 의학 실험실에서 찾을 수 있으므로 이 프로토콜의 실험 비용은 상대적으로 저렴합니다. 또한, 경색의 시점과 부위를 변수로 고려하는 경우 이 프로토콜을 적용하여 광범위한 임상 시나리오, 특히 MI 후 합병증을 시뮬레이션할 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험은 절강 대학의 실험 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며 절강 대학의 동물 자문위원회의 승인을 받았습니다.
1. 좌전하행 관상동맥결찰술(LAD 결찰술) 수술
참고: 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 모델로 사용했습니다. MI 2주 후에 심장을 적출하였다. 좌전하행 관상동맥 결찰술은 앞서 기술하고 입증한 바와 같이 수행하였다11.
- 수술 전에 수술 도구를 70% 에탄올로 소독하십시오.
- 마우스의 무게를 측정한 다음 1% 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다. 발가락 핀치 반사를 관찰하고 호흡수를 측정하여 시술 중 마취 깊이를 평가합니다.
- 37°C 가열 패드가 있는 수술대에 마우스를 놓습니다. 눈의 탈수를 예방하기 위해 안과 용 연고를 사용하십시오.
- 제모 크림으로 왼쪽 전두엽 가슴과 목을 제모하고 면봉으로 털을 제거합니다. iodophor로 피부를 소독 한 다음 70 % 알코올로 해당 부위를 세 번 청소하십시오.
- 현미경으로 정중선 자궁 경부 절개 (0.8-1.0 cm)를 수행하십시오. 기관을 둘러싼 피부, 근육 및 조직을 분리한 다음 20G 캐뉼라를 기관에 삽입합니다.
알림: 캐뉼라를 기관에 삽입하는 동안 관찰 현미경으로 view 튜브가 식도에 삽입되지 않았는지 확인하십시오. - 분당 150회 일회 호흡량 0.2mL로 설정된 설치류 인공호흡기에 마우스를 연결합니다.
- 멸균 가위로 중간 쇄골 라인을 따라 마우스 가슴을 비스듬히 절개합니다. 피하 조직을 해부하여 갈비뼈를 노출시킵니다.
- 멸균 가위를 사용하여 왼쪽 중간 쇄골 선 (0.8-1.0cm)을 따라 비스듬히 피부를 자릅니다. 왼쪽 개흉술을 시행하여 세 번째와 네 번째 갈비뼈를 분리하여 심장을 노출시킵니다. 선명한 시야를 위해 리브 리트랙터를 사용하십시오.
- 구부러진 집게로 심낭을 연 다음 7-0 실크 봉합사를 사용하여 왼쪽 전방 하행 동맥(좌심방 부속기 아래)을 결찰합니다. 좌심실의 창백한 전벽은 심근 관류가 성공적으로 중단되었음을 나타냅니다.
- 갈비뼈 견인기를 풀고 흉부 절개 부위를 5-0 실크 봉합사로 층으로 꿰매면서 가슴에서 공기를 배출합니다. 5-0 봉합사 실크 봉합사로 목 절개 부위를 꿰매십시오.
- 자발 호흡이 회복되면 마우스에서 기관 튜브를 제거합니다. 미리 데워진 멸균 식염수 0.5mL를 복강 주사합니다. 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 12시간마다 피하 주사하여 통증을 최소화합니다.
- 마지막으로 마우스를 가열 패드에 올려 놓고 소생술을 기다립니다. 육안 관찰을 통해 마우스가 과도한 호흡곤란이나 출혈을 겪지 않도록 모니터링합니다.
- 깨어난 후 마우스를 케이지로 되돌립니다. 첫 주 동안 매일 마우스를 모니터링하여 이동성, 몸단장 및 식습관이 적절한지 확인합니다. 실험의 필요에 따라 MI 후 다른 시점에서 심장을 수확합니다.
참고: 이 프로토콜에서, 단세포 현탁액은 MI 2주 후에 심장과 함께 준비되었다.
2. 심장 단세포 현탁액의 제조
- 용액 및 매체 준비
- 심장 조직 해리 완충액: 5mL의 RPMI 1640에 10mg의 콜라게나제 IV(600U/mL), 5mg의 디스파아제 II(0.5U/mL) 및 50μL의 DNase I(100μg/mL)을 혼합합니다. 사용하기 전에 이 매체를 수조에서 37°C로 예열합니다.
- 세포 세척 완충액: 인산염 완충 식염수(PBS, PH 7.4)에 1% BSA 또는 10% FBS를 준비하고 4°C 또는 얼음 위에 보관합니다.
- 관류 용액: PBS(PH 7.4)를 관류 용액으로 사전 냉각합니다.
- 적혈구(RBC) 용해 완충액: 제조업체에서 언급한 RBC 용해 완충액을 사용하십시오.
알림: 이 연구에 사용된 시약 및 장비 목록은 재료 표를 참조하십시오.
- 복강 내 펜토바르비탈 나트륨(150mg/kg) 주사로 마우스를 안락사시킵니다.
- 심장 해부
- 접착 테이프로 뒷다리를 제자리에 고정하여 마우스를 앙와위 자세로 놓습니다.
- 몸에 70 % 에탄올을 뿌린 다음 간을 뚫지 않고 복부 피부와 근육을 수직으로 자릅니다. 심장에 구멍이 뚫리지 않도록 조심스럽게 흉부를 엽니다.
- 사전 냉각된 PBS(PH 7.4)를 사용하여 무색 관류액이 관찰될 때까지 좌심실을 관류합니다(약 15mL의 PBS[pH 7.4]가 필요함).
- 집게로 흉부에서 심장을 부드럽게 들어 올리고 안과 용 가위로 심장 바깥쪽에 붙어있는 과도한 조직을 잘라냅니다. 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 1mL의 미리 냉각된 PBS(PH 7.4)에 심장을 넣습니다.
- 심장 조직의 효소 해리
- 마우스 심장을 얼음 위에 놓인 심장 조직 해리 완충액 150μL가 담긴 24웰 플레이트의 한 웰로 옮기고 가위로 작은 조각(~1mm)으로 자릅니다.
- 다진 심장 조직을 5mL의 조직 해리 완충액이 있는 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
참고: 권장되는 심장 조직 해리 완충액 부피는 심장당 5mL입니다. - 원심분리기 튜브를 125°C에서 1시간 동안 37rpm의 전기 자동 온도 조절 왕복 셰이커에 넣습니다. 조직 현탁액을 20분마다 10회 위아래로 피펫합니다.
- 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과하여 소화되지 않은 조직과 덩어리를 제거합니다. 세포 세척 완충액 25mL를 넣어 원래 튜브를 헹군 다음 옮겨 세포 여과기를 헹굽니다. 다음으로, 세포 현탁액을 40μm 세포 여과기를 통해 여과하여 세포 덩어리를 추가로 제거합니다.
- 여과된 세포 현탁액을 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 버리고, 실온(RT)에서 5분 동안 1x RBC 용해 완충액에 세포 샘플을 재현탁시킨다.
- 4배 더 많은 부피의 세포 세척 완충액을 첨가하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 제거하고, 세포를 10 mL의 세포 세척 완충액에 재현탁시켰다. 4 °C에서 5분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 세포 세척 완충액에 재현탁시켰다.
- 18 μL의 세포 현탁액을 2 μL의 아크리딘 오렌지(AO)/요오드화 프로피듐(PI) 염색 용액(9:1)과 혼합하고 혼합물 10 μL를 계수 챔버 슬라이드에 추가합니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수와 생존력을 평가합니다.
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Representative Results
높은 활력을 갖는 단일 세포 현탁액은 이 프로토콜의 섹션 2를 구현하여 얻어졌습니다. 그러나 세포 단편은 여전히 관찰 될 수 있습니다 (그림 1A). 따라서, 품질16을 더욱 향상시키기 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 수행하였다. FACS 후, 평균 세포 크기는 9.6 μm에서 9.1 μm로 감소하며 (표 1), 이는 FACS에 의해 세포 현탁액에서 세포 단편의 비율이 효과적으로 감소될 수 있음을 시사한다 (도 1B). FACS에 사용되는 게이팅 전략은 그림 1C에 나와 있습니다.
도 1의 이미지 이외에, 세포 농도, 평균 세포 크기 및 세포 생존율을 세포 계수기로 측정하였다(표 1). 세포 농도의 차이는 세포 현탁액의 부피 때문이었습니다. 현저하게, 평균 세포 크기는 FACS 후에 감소하였으며(표 1), 이는 FACS가 세포 응집을 효과적으로 감소시키고 세포 단편을 제거할 수 있음을 보여준다.
ScRNA-seq는 이 프로토콜을 통해 얻은 세포 현탁액 품질을 검증하면서 심장 면역학적 미세 환경을 연구하기 위해 수행되었습니다. 단일 세포 현탁액을 준비한 후, 먼저 광범위한 면역 세포에 대한 공통 마커인 표면 단백질 CD45를 발현하는 세포를 분류했습니다. 다음으로, 우리는 10X Genomics 플랫폼17을 사용하여 CD45+ 세포에서 scRNA-seq를 수행했습니다. 이러한 방식으로 3개의 건강한 심장 샘플에서 14,217개의 개별 세포를 품질 관리 후 병합된 데이터 세트로 풀링했습니다(표 2). t-분포 확률적 이웃 임베딩(t-SNE) 차원의 비감독 클러스터링 및 감소는 7가지 유형의 면역 세포의 명백한 분리를 보여주었습니다(그림 2). 또한, 각 면역 세포 유형은 고전적인 마커의 높은 발현을 보였다. 결론적으로, 이러한 결과는 이 프로토콜에 의해 제조된 단일 세포 현탁액이 단일 세포 시퀀싱에 대해 높은 효능을 갖는다는 것을 보여줍니다.
그림 1: 심장 단세포 현탁액에서의 세포 생존율. (A) FACS가 없는 세포 생존율. 검은색 화살촉은 세포 조각(형광 없음)을 나타냅니다. (B) FACS를 이용한 세포 생존율. 노란색 화살표는 살아있는 세포(녹색 형광)를 나타내고 빨간색 화살표는 죽은 세포(빨간색 형광)를 나타냅니다. (C) 게이팅 전략. 스케일 바: 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 3개의 마우스 심장 샘플에서 채취한 심장 CD45+ 세포의 단일 세포 RNA 염기서열 분석. (A) 표준 마커 유전자에 기초하여 확인된 면역 세포 집단을 보여주는 CD45+ 세포의 tSNE 플롯. (B) 각 하위 집단에서 차등적으로 발현된 상위 5개 유전자의 히트맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| FACS 이전 | FACS 이후 | |
| 총 세포 농도(cells/mL) | 1.51 x 106 | 3.40 엑스 105 |
| 생세포 농도(cells/mL) | 1.40 x 106 | 3.15 엑스 105 |
| 죽은 세포 농도(cells/mL) | 1.09 엑스 105 | 2.48 x 104 |
| 생존율(%) | 92.8 | 92.7 |
| 평균 세포 크기(μm) | 9.6 | 9.1 |
표 1: FACS 전후의 심장 단세포 현탁액. FACS 전후에 얻은 심장 단일 세포 현탁액의 세포 밀도는 자동 세포 계수기를 사용하여 비교됩니다.
| 견적 | |
| 예상 셀 수 | 14,217 |
| 셀당 평균 읽기 수 | 81,017 |
| 세포당 중앙값 유전자 | 1,374 |
| 검출된 총 유전자 수 | 18,424 |
| 세포당 중앙값 UMI 수 | 4,021 |
| 유효한 바코드 | 98.4% |
| 게놈에 매핑된 읽기 | 95.1% |
표 2: 품질 관리 통계. 이 표에는 건강한 마우스 심장의 단일 세포 데이터에 대한 다양한 추정치가 나열되어 있습니다.
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Discussion
이 기사는 MI 후 마우스 심장에서 단일 비심근 세포를 분리하는 프로토콜을 설명하는 것을 목표로 했습니다. 이 프로토콜은 면역 세포, 내피 세포 및 섬유아세포를 포함하여 MI 후 미세 환경에서 다양한 유형의 세포를 고품질로 분리하는 데 적용할 수 있습니다. 세 가지 필수 요소는 단일 세포 시퀀싱을 위한 고품질 세포 현탁액을 얻는 데 중요합니다. 첫 번째는 효소 소화의 설정입니다. 세포 생존력과 분리 효율을 모두 보장하기 위해 소화 시간과 소화 효소의 부피와 농도를 조절하는 것이 중요합니다. 이 경우 효소의 농도를 적절하게 높이고 소화 시간을 연장했습니다. 여기서는 45분에서 1시간의 소화 시간을 권장합니다. 지속 시간이 짧을수록 세포 생존력이 증가할 수 있지만 심장 조직 소화가 불충분하고 세포 덩어리의 양이 증가할 수 있습니다. 또한, 용해 세포가 유리 DNA를 방출하여 주변 세포를 감싸 세포 덩어리를 형성할 수 있기 때문에 세포 응집을 방지하기 위해 DNase I을 사용했습니다13. 두 번째 필수 요소는 BSA 또는 FBS가 포함된 세포 세척 용액을 사용하는 것입니다. BSA 또는 FBS는 효소의 활성을 보호할 뿐만 아니라 세포의 생존력을 향상시킬 수 있습니다. 마지막 필수 요소는 FACS가 세포 단편과 죽은 세포를 제거하는 것을 촉진하는 것입니다. 세포 단편은 부정확한 세포 수와 생존력을 초래할 수 있습니다. 이러한 요인들은 함께 세포 현탁액의 생존력과 순도를 향상시켜 단일 세포 시퀀싱과 더 잘 호환됩니다.
이 프로토콜은 먼저 단일 세포 시퀀싱을 위한 세포 현탁액 제제를 설명하며, 상대적으로 저렴한 비용으로 세포 현탁액의 품질을 향상시키기 위한 추가 절차도 포함합니다. 이전 연구에서 사용된 다른 프로토콜과 비교하여 트립신14와 같은 유리 DNA에 의해 유도된 세포의 응집을 유발할 수 있는 소화 효소의 사용을 피합니다. 세포 파편을 제거하는 것은 단일-세포 연구의 주요한 과제 중 하나이며, 일부 연구에서는 샘플을 실행하기 전에 세포 생존율을 향상시키기 위해 죽은 세포 제거 키트를 사용한다14,15. 그러나 여기서는 FACS를 사용하여 죽은 세포와 파편을 줄이는 데 매우 효과적이기 때문에 샘플 순도를 향상시키는 것이 좋습니다.
이 프로토콜에 의해 얻어진 단일 세포 현탁액은 유동 분석 또는 1차 세포 배양(표준 무균 절차)18에 의해 추가로 분석될 수 있습니다. 소화 효소가 비교적 온화하기 때문에 MI의 여러 단계에서 채취한 심장 조직과 건강한 심장에서 채취한 심장 조직을 소화하는 데 적합합니다. 그러나 이 프로토콜에는 특정 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 37°C에서의 연장된 소화는 필연적으로 스트레스 유전자19,20의 발현을 촉진한다. 이러한 한계는 저온 활성 프로테아제를 사용하거나 소화 시간을 줄인 후 FACS를 사용하여 해결할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 심근 세포 분리를 포함하지 않으므로 국소 조직 반응에 대한 연구에는 적합하지 않습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 절강성 자연 과학 기금(LQ22H020010)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
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