一个皮肤刺激测试（SIT），使用的表皮重建人表皮（RHE）型号

表皮是由 Matt Tech Corporation 开发的正常人类细胞衍生的人类表皮体外重建模型。EC VM 验证的表皮皮肤刺激性测试方案取代了传统的基于动物的测试，适用于将与人体皮肤接触的产品，例如化妆品、原材料和工业试剂。该测试从皮肤刺激试剂盒和表皮组织到达实验室的第 0 天开始，随后在过夜孵育后预处理检测培养基。

在第 1 天，表皮组织的非典型表面用推定的刺激性化合物暴露 1 小时，然后在第 2 天通过洗涤步骤去除刺激物。孵育 24 小时后，将培养插入片段置于新鲜培养基中，旧培养基可用于分析释放的细胞因子和趋化因子。该组织与一种称为 MTT 的化合物反应，该化合物被线粒体还原酶转化为深紫色的毛瘤和盐。

提供细胞活力读数。样品中缺乏深紫色是活力降低的指标。当测试化合物的热量公制读数低于阴性对照的 50% 时，该测试化合物可归类为刺激物。

嗨，我是来自 Matt Corporation 的 Helena Kava。今天，我们将向您展示使用重建的人体皮肤模型表皮进行体外皮肤刺激测试的程序。根据监管要求，该程序可用作体内快速皮肤刺激试验的全部或部分替代。

这种新的体外程序可用于化学品和原材料的危险识别和标记。那么让我们开始吧。表皮来源于人表皮角质形成细胞培养物，形成人表皮的三维、多层和高度分化模型。

这些组织具有有丝分裂和代谢活性，在结构和生化上都与体内对应物非常相似，并且像人类表皮一样具有保证的可重复性。表皮由有组织的基底棘状和颗粒层以及多层角质层组成。后者包含细胞间 lam Miller 脂质层，其排列模式类似于体内发现的脂质层。

这些组织在无血清培养基中培养。每个组织都在单个细胞培养小室中生长。提供其他配置，包括 96 孔高通量规格。

在这个过程中的特定时间点，生活用纸生产大约需要三周时间才能完成，组织被提升到气液界面，所有液体都从组织的 APIC 表面去除。N 的组织仅通过基底外侧表面进食，该表面与 mat tech 的专有培养基保持接触。典型的表皮试剂盒包含 24 个组织，每个组织直径为 9 毫米，位于其自身的组织培养插入物中，以及足够的检测培养基来执行此皮肤刺激测试。

24 个插入物牢固地固定在中等注入的 AGA 玫瑰凝胶上，标准 24 孔板的每个孔中有一个组织，在开始测试化学品之前，运输要在 3 到 4 摄氏度的温度下过夜运输。使用 EPIDERM 测试系统，按照书面方案中的说明准备和消毒检测中使用的所有仪器和工具。棉签等部分材料应采用无菌包装或高压灭菌。

应使用 70% 乙醇对镊子等器械进行消毒，并使用紫外线或伽马射线照射对洗衣瓶进行消毒。测定中使用的两种关键溶液应为预先制备的 DPBS 和 5% SDS 溶液。在蒸馏水中，将使用大约 2 升无菌 DPBS pH 7 进行测定，一个试剂盒包含 24 个表皮组织。

无菌 DPBS 用作阴性对照和洗涤溶液。应制备 5% SDS 并用作阳性对照。收到 EPIDERM EPI 200 SIT 试剂盒后开始进行皮肤刺激试验。

确保检查所有套件组件的完整性，并立即联系 Mat Tech 公司，如果一切就绪，请继续下一步。开始检测时，让试剂盒随附的检测培养基达到室温。不要在层流罩中预热。

为每三个表皮组织插入物准备一个无菌六孔板，并在无菌条件下将 0.9 毫升检测培养基移液到每个孔中。在无菌气流下打开装有 24 孔板的塑料袋，其中包含表皮组织。取下无菌纱布，用无菌镊子小心地取出每个含有表皮组织的插入物。

用无菌纱布或滤纸轻轻吸干，去除粘附在插入物外侧的任何残留 aros。然后在接下来的 5 分钟内将组织放入空的无菌 24 孔板中。目视检查嵌件。

记录表面的任何组织缺损和过多的水分。不要使用有缺陷的组织或组织。完全被液体覆盖。

最佳组织插入物。应具有干燥的表面，表面无脱落、不平整的部分或过多的液体。接下来，使用无菌棉签小心擦干组织表面。

尽量不要直接接触纸巾。毛细管效应足以在表面干燥后去除表面的水分。将 3 张纸巾转移到每 6 张纸巾的顶行。

孔板预装了 0.9 mL 检测培养基。释放嵌件下方的任何气泡。接下来，将包含插入片段的 6 孔板放入培养箱中 1 小时。

37 摄氏度下预孵育。在第一个预孵育期结束时，将插入片段从上孔转移到六孔板的下孔中。将板放回培养箱中进行过夜预孵育。

将其余的分析培养基放入冰箱中。在过夜预孵育后，可以将测试化学品涂在表皮组织插入物上。在开始化学暴露测定之前，将所有必要的设备、溶液和测试化学品置于室温下。

在无菌罩中，用 70% 乙醇擦拭所有非无菌材料瓶，然后再将其放入罩内。阴性对照、无菌 DPBS 阳性对照和 5%SDS 和蒸馏水也应置于通风橱和室温中。应留出一个大瓶以供浪费。

准备一个 6。通过每孔仅用 0.9 毫升检测培养基填充上行，将每种化学品的孔板。用组织编号和化学名称标记每个板。

在计划接触化学品前大约 5 分钟。从培养箱中取出包含预处理组织的 6 孔板。然后目视评估组织表面。

使用无菌棉签去除水分，不要按压组织表面。最后，在六个孔板盖上贴上测试材料代码或名称的标签。在一次测试运行中，请勿测试超过 6 种化学品，包括阴性对照和阳性对照，一式三份。

使用化学应用和一分钟的洗涤间隔来处理已知的测试物质。请按照材料安全数据表或 MSDS 中给出的说明处理编码或未知样品。遵循化学品安全指南并使用通风柜。

戴上手套并每隔一分钟用化学品保护眼睛和面部剂量组织，以便于暴露后冲洗测试化学品，将带有剂量组织的板放在层流罩中，直到最后一个组织给药。在整个过程中，将使用一个穿过移液器的球来作组织和测试化合物。本生灯燃烧可用于产生球形尖端，以测试液体化学品。

30 微升液体测试品直接分配到组织上，并立即启动计时器，使其计数。将尼龙网放在组织表面 当计时器到达一分钟时，加入第二种液体化合物。每种测试化学品使用三张纸巾，记住每隔一分钟添加一次每种化合物。

对于半固体检测，使用外置活塞式移液器将 30 μL 直接分配到组织上。如有必要，用牧场移液管涂抹化学品以匹配组织的大小。在应用固体物质前不久，用 25 微升无菌 DPBS 润湿组织表面，以改善组织表面与测试化学品的接触，将细磨测试材料填充 25 毫克锋利的应用勺中。

将固体测试化学品涂抹在组织表面。如有必要，使用移液管上方的无菌球将勺子完全清空。轻轻摇动嵌件以改善固体在表面上的铺展。

您也可以使用移液管上方的球来匹配组织大小。不要按压纸巾表面。最后，在给完最后一个组织后，将 DPBS 作为阴性对照和 5% SDS 作为阳性对照也一式三份地应用于组织插入物，将所有板转移 35 正负 1 分钟到加湿的 37 摄氏度培养箱中。

在此孵化期间，请确保将洗涤步骤所需的所有材料放入通风橱中。孵育 35 分钟后，从培养箱中取出所有板。将它们放入无菌罩中，等待 60 分钟，以便完成第一剂组织的化学暴露。

接下来，开始洗涤程序。用无菌 DPBS 冲洗组织 15 次。要去除任何残留的测试材料，请使用距离组织表面 1.5 厘米的恒定 DPBS 流填充组织插入物并将其清空。

确保 DPBS 流不会太弱，否则不会去除测试物质。请记住保持一分钟的时间间隔，用尼龙网清洗液清洗四组织五次，并用尖锐的镊子小心地取下网眼。然后在第 15 次之后继续进行剩余的 10 次洗涤，使用洗涤瓶冲洗，将插入物完全浸入 3 次和 150 毫升 DPBS 中，然后摇晃以去除剩余的测试材料。

最后，冲洗纸巾。用无菌 DPBS 从内部插入一次，从外部插入一次。轻轻摇动插入物并将其吸干在无菌印迹纸上，从组织中去除多余的 DPBS。

接下来，将印迹的组织插入物转移到先前预装了检测培养基的新 6 孔板中。同样，请记住，所有这些步骤都必须在一分钟的间隔内完成，以保持每次曝光 60 分钟的曝光时间。冲洗完最后一张纸巾后，用无菌棉签小心擦干每张纸巾的表面。

如果表面仍然存在化学物质的痕迹，请尝试使用无菌的棉签将其去除。最后，将组织在接下来的 24 小时内在培养箱中孵育。在方法文档表中记录孵育的开始时间。

此外，在方法文档表中记录所有不同的应用。Mat Tech Corporation 提供的标准作程序附件，用于移动引擎盖中的板。将插件转移到预装有 0.9 mL 培养基的 6 孔板的下部。

从上行收集培养基，并将编辑过程输送到预先标记的 24 孔板中，然后将其置于零下 20 摄氏度。在分析之前，分析释放到培养基中的细胞因子和/或趋化因子是一个可选步骤。继续孵育 18 到正负 3 小时，MTT 测定标记 2 24 孔板，并带有化学名称或代码。

请记住，MTT 是有毒的，因此请务必戴上防护手套。处理时。通过解冻 MTT 浓缩液并用 MTT 稀释剂稀释来制备 MTT 溶液。

避光，因为 MTT 对光敏感，可在两到三个小时内使用。由于 MTT 会随着时间的推移而降解，因此在 24 孔板的每个孔中移液 300 微升 MTT 培养基。现在从培养箱中取出 6 个孔板。

在吸墨纸上吸干插入物的底部，然后将它们转移到预装有 MTT 的 24 孔板中。将 24 孔板放入培养箱中孵育 3 小时。不要忘记在 MDS 中记录 MTT 孵育的开始时间，严格遵守三个小时的孵育时间，以避免获得不同的 MTT 读数 当 MTT 孵育完成后，使用带有有毒废物收集器的抽吸泵轻轻地从所有孔中吸出 MTT 培养基。

用 DPBS 重新填充孔并吸出。同样，再重复两次冲洗，并确保在最后一次抽吸后组织干燥。洗涤后，将小室转移到新的 24 孔板中，将 2 mL 提取液轻轻移液到每个小室中，以浸入小室。

水平将上升到插入物的上边缘以上，从而从两侧完全覆盖组织。使用热封剂或多联体密封 24 孔板，以抑制提取物和蒸发。在方法文件表中记录提取的开始时间，并在室温下提取至少两个小时，并在板振荡器上轻轻摇动提取期完成后，用移液管前的注射针或球刺穿插入物，让提取物流入取出插入物的孔中。

丢弃穿孔的插入物，将孔中的溶液上下移液 3 次，直到均匀为止。每个组织也可以使用设置为 120 RPM 的平板摇床。将两个 200 微升等分试样的蓝色 forma 和溶液转移到 96 孔平底微量滴定板中。

根据本空白视频实验步骤随附的电子表格中给出的固定板设计转移副本。使用 ISO 丙醇，读取光密度或 OD 以及使用 96 纳米波长的 570 孔板分光光度计，而无需使用参考滤光片。在电子表格中输入结果以自动计算结果。

考虑到随附方案中概述的测试化学干扰造成的更正，测试化学品被标记为刺激性。如果光谱光度分析后组织活力百分比等于或小于 50%，则 NC 组织的 OD 5 70 大于或等于 1 且小于或等于 2.5。并且以阴性对照组织的百分比表示的 PC 组织的平均活力小于 20%，并且根据三个相同处理的复制体的个体百分比组织变异性计算的 SD 小于 18%产生细胞活力值的化合物小于 50%，可被视为刺激物。

我们刚刚向您展示了如何使用重建的人体皮肤模型进行经过验证的 60 分钟、42 小时的皮肤刺激测试。表皮。执行此程序时，请务必记住，测试的主要部分是在无菌或脓毒条件下进行的。如果需要修改任何方法，或者您需要更好地解释任何程序步骤，请随时与我们联系以寻求帮助和建议。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。