激光显微切割技术应用于特定细胞亚群的基因表达谱分析 果蝇 翅盘

本文详细描述了激光显微切割技术的应用，用于实现对果蝇翅盘中基因沉默区域与非沉默区域进行比较性的RNA转录谱分析。该方法所需的生物材料为手工解剖获得的果蝇幼虫翅盘组织，主要设备为激光显微切割仪。我们使用的是LI A-L-L-M-D 6,000系统以及实时荧光定量PCR仪。

我们使用了BioRad iq。所需五种小型工具包括凹形培养皿、小号画笔、显微解剖镊子、悬滴载玻片昆虫针（固定在注射器针头上）、带金属框架的聚四氟乙烯膜以及小型塑料管。该方法包含以下步骤。

第一步，杂交两个合适的oph转基因品系，利用GAL4-UAS系统在子代中诱导局部且特异性的基因沉默。第二步，处理解剖载片。第三步，设置激光显微切割装置。

第四步，从遗传杂交的幼虫后代中手动收集翅成虫盘。第五步，对GFP标记的成虫盘特定区域进行激光显微切割。第六步，对成虫盘中基因沉默区域与非沉默区域的对应部位进行转录谱分析，将有助于明确目标基因沉默所引发的效应。

体内基因X的转录谱分析将需要从显微切割区域提取RNA，控制手动切割的准确性，通过逆转录PCR（R-T-P-C-R）评估两个样品中GFP的表达，通过实时R-T-P-C-R或微阵列分析对两个样品中沉默基因的潜在靶标表达进行定量。接下来详细介绍每个步骤。

第一步，遗传杂交。遗传杂交涉及GAL4-UAS转基因品系，旨在获得在幼虫后代中基因沉默的成虫盘。通用的GAL4系统可通过RNA干扰实现特定且局部的基因沉默。

一种品系在杂交中引入了驱动子转基因，该转基因以特定的时间或空间模式表达GAL4，以及一个A-U-A-S-G-F-P报告基因，用于可视化GAL4的表达区域。第二种品系引入了一个UAS响应子转基因，该转基因表达发夹沉默RNA，可在细胞中表达后特异性靶向基因X。

这种RNA被切割后产生小干扰RNA，能够特异性地沉默该杂交后代中的目标基因X。UAS沉默转基因仅在表达GAL4蛋白的细胞中转录，从而诱导基因X在特定空间范围内的沉默。在众多应用中，我们重点关注了由Grailed-GAL4驱动子介导的翅盘中RNA转录谱的分析，该驱动子可在后部区室中实现特异性沉默。

沉默区域由 U-A-S-G-F-P 转基因的表达标记。在后部区室中，将触发两个事件：GGFP 的表达和基因 x 的沉默。

第二步，处理解剖支架以抑制RNA酶活性。在室温下，用DEPC水清洗支架载玻片和解剖工具至少一小时，然后在无菌环境中晾干。为抑制RNA酶活性，使用一个全新的、已去除RNA酶的50 ml离心管，其中装入含DEPC水的镊子、悬滴载玻片和宠物支架。

两者均需用于显微解剖。盖上管盖，将其倒置，然后在室温下静置反应至少一小时。一小时后，用镊子将DEPC水转移至另一管中。

将载玻片置于管内，以防滑落，随后让载玻片在管内干燥。第三步，显微解剖准备。

首先，打开所有需要的设备，包括荧光灯、显微镜以及显微切割软件。警告窗口会提示您同时打开激光器。请开启激光器，并在完成显微切割系统设置的同时让激光器预热。

现在需要准备用于收集组织的孔。使用Leica LMD 6,000激光切割设备时，可加载最多四个管子以收集不同的样本。就我们的目的而言，仅需两个管子。

一个用于收集GFP阳性沉默组织，另一个用于收集GFP阴性单层组织，使用显微镊子操作。将两个离心管管盖中均加入20 µL Trizol试剂溶液，以保存RNA。现在显微解剖工具已准备就绪。步骤四：手工解剖果蝇幼虫的翅成像盘。

按照前述方法获取幼虫后代，分离其翅成虫盘，并确保其他组织不会污染成虫盘。为实现这一目标，解剖方法与通常用于收集全部原始成虫盘的方法有显著不同。首先，用林格氏液清洗幼虫，以去除附着的培养基。然后将其转移至悬滴载玻片中，立即剪去头部，并向下牵拉口器。

现在使用昆虫针小心地剥离其他组织。红色轮廓标示出需要采集的成虫盘。迅速而轻柔地将成虫盘与附着组织分离，并将每块分离的成虫盘立即转移至解剖框中进行切割。

此操作需要重复进行，直至获得总共一百个翅盘。第五步，对表达GFP标记的翅盘特定区域进行激光显微切割。一旦原始翅盘位于膜上，即可开始切割。

将切片框放置于支架上，并将支架固定在电动载物台上。使用LMD 6,000作为普通显微镜寻找原始的翅成虫盘。聚焦后设定切割区域。

绘制一个能够覆盖圆盘两侧（GFP 阳性侧和另一侧）的椭圆形区域。选择您希望收集 GFP 阳性部分的管盖。按下“开始切割”按钮。

显微解剖仪将按照您先前通过选择“移动并切割”功能所设定的速度和功率进行组织切割。您可以手动精细调整切割过程，直至未被选中的组织部分脱落。三维动画展示了显微解剖仪在操作过程中的情况：激光聚焦于组织上，沿所选轮廓进行切割。

切割完成后，组织片段会落入所选的管盖中，并随之进入TRI Reagent。第一次切割后，将切割区域移至翅盘的另一侧，以切割大小相当的GFP阴性区域。在进行下一次切割前，务必选择另一个管盖，以确保GFP阳性组织与GFP阴性组织分开存放。

自动切割完成后，按下开始切割按钮。在第二次切割前，根据三维动画所示手动优化切割位置。电机驱动的载物台将选定的管盖移至切割区域下方。

激光束聚焦于沿选定周长切割的组织，切割完成后，组织碎片落入含有Trizol裂解液的选定管盖中。为了收集足够的材料，我们在一百个成虫盘上重复了该操作。收集完样品后，取出试管。

这是一个非常关键的步骤，操作不当可能导致此前所有的努力付诸东流。因此务必小心谨慎。将瓶盖倒置盖上，然后继续实验操作。

这是含有GFP阳性组织的样本。这是含有GFP阴性组织的另一个样本。第六步，转录谱分析。

旋转离心管，使液体脱离管盖，加入 Try 试剂至 1 毫升。按照标准的 Try 试剂方案，从约 100 个、每个约 5,000 平方微米的区域进行 RNA 提取。我们的得率为 1.5 微克 RNA。

我们在体外使用上标三合成带有随机六聚体的CD NA。通过R-T-P-C-R检测两个样本中GFP的表达，以控制手动解剖的准确性。如定量R-T-P-C-R凝胶所示。

我们评估了沉默基因X的表达水平及其在基因X介导的调控通路中可能的假定靶基因的表达水平。该图展示了基因X及其一个假定靶基因的表达水平示例，相对于未成熟翅盘前后区室中的基础表达水平，将这些靶基因称为基因Y。

在沉默后，发现所选基因X的活性降低至40%。相比之下，其一个假定靶基因Y显著上调，增幅达七倍，这促使我们验证了基因X负向调控基因Y的假设。我们得出结论：上述实验方法可成功应用于多种调控通路中假定靶点的验证。