Name: 激光显微切割的从细胞的一个子集基因表达分析中的应用果蝇永光盘 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 59 s
Description: 了解激光显微切割技术如何用于分析果蝇翅芽中特定区域的基因表达差异。该方法结合RNA干扰和定量RT-PCR，帮助研究人员精确比较沉默与非沉默组织的转录组特征，揭示发育过程中的基因调控机制。

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作者感谢意大利那不勒斯费德里科二世大学那不勒斯 AMRA 卓越中心的 Chiara Campanella 教授提供激光显微切割仪的使用机会，以及 Vincenzo Vicidomini 先生在三维动画制作中给予的大力支持。

第1部分. 特异且局部化RNAi处理的Drosophila成虫盘翅芽组织的制备。
在本实验中，我们使用的生物材料是来自转基因幼虫的Drosophila成虫盘组织，这些幼虫通过GAL4/UAS系统实现了特定区域的基因沉默1。这些幼虫来源于两个亲本品系之间的遗传杂交：其中一个品系携带GAL4驱动元件，另一个品系携带UAS响应元件。驱动品系不仅可在特定的时间和/或空间模式下表达GAL4，同时还携带一个UAS-GFP报告基因，用于可视化GAL4的表达区域。UAS响应品系则在UAS序列的控制下表达一段可靶向目标基因（记为基因X）的发夹结构RNA（hpRNA），从而实现特异性沉默2。当hpRNA X在细胞内表达后，会被切割生成能够特异性沉默目标基因的小干扰RNA（siRNA）。在同时携带驱动和响应转基因的幼虫后代中，UAS介导的沉默结构仅在表达GAL4蛋白的细胞中转录，从而实现对目标基因X的空间限制性沉默。
在众多可能的应用中，我们采用该方法在engrailed-GAL4（en）驱动子的控制下，对一个选定的目的基因（基因X）进行沉默，该驱动子可在翅成虫盘后区室中引发特异性沉默3，该区域的范围由UAS-GFP转基因的表达标记。
将已沉默的成虫盘翅盘手工解剖分离，注意清除周围污染组织，尤其是附着的气管。每个分离出的翅盘随即迅速而轻柔地转移至预先处理过的无RNase解剖框中，以便立即对选定区域进行激光显微切割。
第2部分. 从翅盘中被沉默的（后部）和未被沉默的（前部）区室中进行激光显微切割选定区域。
当翅成虫盘置于膜上后，即可对沉默区域（后部；GFP标记）和非沉默区域（前部；无GFP标记）进行特定部位的激光显微切割。操作时绘制一个可同时容纳翅成虫盘GFP阳性侧和GFP阴性侧的区域。在显微切割仪下，我们首先将激光束聚焦于GFP阳性组织，沿选定的边界进行切割。显微切割仪以设定的速度和功率自动完成切割，但也可手动精细调整，直至所选组织区域落入下方收集管中。该收集管内含有少量TRI Reagent，以便GFP阳性组织可直接用于后续RNA提取。
随后，我们将切割区域移至翅盘中相反的、GFP阴性的一侧，以从未被沉默的GFP阴性组织中分离出相应的区域。再次完成自动切割后，我们继续手动优化切割边缘。切割完成后，GFP阴性组织也被收集至TRI试剂中，准备进行RNA提取。
第3部分. 从显微切割组织区域中提取RNA并进行转录谱分析。
我们将离心管旋转以使液体脱离管盖，并加入TRI Reagent至1 ml，随后按照标准的TRI Reagent方案进行RNA提取。为了收集足够的材料，我们对100个成虫盘进行了重复切割操作。从约100个区域（每个区域约5000 μm2）开始，共获得1.5 μg的RNA。随后通过RT-PCR检测沉默与未沉默样品中GFP的表达情况，以验证手动解剖的准确性，cDNA合成使用Super Script III（Invitrogen）并以随机六聚体引物进行。后续定量分析采用Real Time RT-PCR，利用Master Mix（Invitrogen）检测目标基因X的表达水平及其调控通路中潜在靶基因的表达情况。

<ol><li>Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. Dahmann, C. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2008).</li>
<li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+disc+development+in+the+fly%3A+the+early+stages.+%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Wing disc development in the fly: the early stages. </a> Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).</li>
<li>Martin, F. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+the+control+of+growth+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 133, 4421-4426 (2006).</li>
<li>Tabata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+morphogen+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of morphogen gradients.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).</li>
<li>Moreno, E. &amp, Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dMyc+transforms+cells+into+super-competitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">dMyc transforms cells into super-competitors.</a> Cell. 117, 117-129 (2004).</li>
</ol>

根据在未沉默的翅成虫盘的前/后区室中达到的基础表达水平，发现所选基因X在沉默后其活性降低至40%。相反，其一个假定靶基因（基因Y）显著上调（增加7倍），由此我们验证了基因X负调控该靶基因的假设。
我们得出结论，上述实验方法可成功应用于验证多种调控通路的假定靶点。
此外，我们推测，提高RNA提取的得率可快速实现通过微阵列分析对局部转录谱进行表征，这将有助于更深入地了解重要的生物学过程。例如，形态发生梯度的局部形成4, 5，或细胞竞争过程中潜在的转录转换6（其中可通过差异性GFP表达来可视化“失败”和“胜出”细胞克隆），均可得到更具体的研究。无论何种应用，该方法均有助于在天然组织环境中明确定义不同细胞区域的转录响应。

<table><tbody><tr><td>DEPC 水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>TRI试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>预混液</td><td>Invitrogen</td><td>11761100</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr><tr><td>Dream Taq</td><td>Fermentas</td><td>EP0701</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;果蝇品系&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;果蝇UAS沉默品系可从VDRC RNAi品系库中获得 &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;. GAL4驱动品系的集合可从布卢明顿果蝇资源中心（印第安纳大学）获取&lt;em&gt;, &lt;/em&gt;美国&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;仪器设备&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;所需设备包括激光显微切割仪（Leica LMD6000）、Coulter Microfuge 22R（Beckman）、PCR仪（BIO-RAD My Cycler）、实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD iQ5）。 &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;工具&lt;/p&gt;&lt;p 类=&quot;jove_content&quot;&gt;所需工具包括：玻璃凹玻片、毛刷、显微解剖镊、悬滴载玻片、固定在注射器针头上的昆虫针、带聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的金属框架、塑料管（50 ml、05 ml、0.25 ml）。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;果蝇UAS沉默品系可从VDRC RNAi品系库中获得 &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;. GAL4驱动品系的集合可从布卢明顿果蝇资源中心（印第安纳大学）获取&lt;em&gt;, &lt;/em&gt;美国&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;仪器设备&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;所需设备包括激光显微切割仪（Leica LMD6000）、Coulter Microfuge 22R（Beckman）、PCR仪（BIO-RAD My Cycler）、实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD iQ5）。 &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;工具&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;所需工具包括：玻璃凹玻片、毛刷、显微解剖镊、悬滴载玻片、固定在注射器针头上的昆虫针、带PET膜的金属框架、塑料管（50 ml、05 ml、0.25 ml）。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;仪器设备&lt;/p&gt;&lt;p 类=&quot;jove_content&quot;&gt;所需设备包括激光显微切割仪（Leica LMD6000）、Coulter Microfuge 22R（Beckman）、PCR仪（BIO-RAD My Cycler）、实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD iQ5）。 &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;工具&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;所需工具包括：玻璃凹玻片、毛刷、显微解剖镊、悬滴载玻片、固定在注射器针头上的昆虫针、带聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的金属框架、塑料管（50 ml、05 ml、0.25 ml）。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;所需设备包括激光显微切割仪（Leica LMD6000）、Coulter Microfuge 22R（Beckman）、PCR仪（BIO-RAD My Cycler）、实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD iQ5）。 &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;工具&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;所需工具包括：玻璃凹玻片、毛刷、显微解剖镊子、悬滴载玻片、固定在注射器针头上的昆虫针、带PET膜的金属框架、塑料管（50 ml、05 ml、0.25 ml）。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;工具&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;所需工具包括：玻璃凹玻片、毛刷、显微解剖镊子、悬滴载玻片、固定在注射器针头上的昆虫针、带PET膜的金属框架、塑料管（50 ml、05 ml、0.25 ml）。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;所需工具包括：玻璃凹玻片、毛刷、显微解剖镊、悬滴载玻片、固定在注射器针头上的昆虫针、带PET膜的金属框架、塑料管（50 ml、05 ml、0.25 ml）。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

激光显微切割技术应用于特定细胞亚群的基因表达谱分析 果蝇 翅盘

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

组织的异质性已被证明是限制从生物样本中获取信息量的一个因素，从而影响下游分析。鉴于许多组织内部存在复杂的动态细胞关联，为了通过分子分析充分重现体内的相互作用，必须能够在其原始微环境中分析特定的细胞群体。激光显微切割技术可实现这一目标，它能够在直接显微观察下，明确识别并成功分离感兴趣的细胞，同时保持分子完整性。我们已将该技术应用于分析发育中果蝇翅盘特定区域的基因表达，翅盘是研究生长调控、细胞分化和器官发生的理想模型系统。幼虫期成虫盘在发育早期即通过谱系限制边界被划分为前区与后区、背侧与腹侧区室。利用可诱导的GAL4-UAS双元表达系统，可在转基因果蝇中通过相应的GAL4驱动子调控UAS-GFP转基因的表达，从而特异性地标记各个区室。在转基因成虫盘中，可借助荧光GFP信号引导激光切割，对离散细胞亚群进行激光显微切割后，精确测定其基因表达谱。
在众多下游应用中，我们重点关注了局部RNA干扰（RNAi）后的RNA转录谱分析。随着RNAi技术的发展，GFP标记可与特定基因的局部敲降相结合，从而能够确定特定细胞群体在基因沉默条件下的转录响应。为验证该方法，我们在一个普遍表达的基因中对后部（P）区室进行区域性沉默，随后分离出由GFP表达标记的后部区室和未标记的前部（A）区室中对应的组织区域。从显微切割获得的沉默区与非沉默区分别提取RNA，并通过定量实时荧光定量RT-PCR进行比较基因表达谱分析。我们证明，该方法可有效应用于翅盘内特定细胞亚群的精确转录组学研究 果蝇 成虫盘。事实上，尽管通常将大量制备的成虫盘作为RNA来源并假定其细胞具有同质性，但众所周知，由于位置信息的影响，这些结构内部的转录表达可能存在显著差异。利用定位的荧光GFP信号引导激光切割，可实现更精确的转录分析，并可有效地应用于多种研究场景，包括在原位环境中对不同细胞谱系进行转录谱分析。

激光显微切割技术用于分析局部RNA干扰处理的果蝇翅盘特定区室中的基因表达谱 体内从沉默区与非沉默区的等效区域提取RNA，通过定量RT-PCR分析，以确定在天然组织微生态背景下基因表达谱的差异。

组织的异质性已被证明是限制从生物样本中获取信息量的一个因素，……

本文详细描述了激光显微切割技术的应用，用于实现对果蝇翅盘中基因沉默区域与非沉默区域进行比较性的RNA转录谱分析。该方法所需的生物材料为手工解剖获得的果蝇幼虫翅盘组织，主要设备为激光显微切割仪。我们使用的是LI A-L-L-M-D 6,000系统以及实时荧光定量PCR仪。我们使用了BioRad iq。所需五种小型工具包括凹形培养皿、小号画笔、显微解剖镊子、悬滴载玻片昆虫针（固定在注射器针头上）、带金属框架的聚四氟乙烯膜以及小型塑料管。该方法包含以下步骤。第一步，杂交两个合适的oph转基因品系，利用GAL4-UAS系统在子代中诱导局部且特异性的基因沉默。第二步，处理解剖载片。第三步，设置激光显微切割装置。第四步，从遗传杂交的幼虫后代中手动收集翅成虫盘。第五步，对GFP标记的成虫盘特定区域进行激光显微切割。第六步，对成虫盘中基因沉默区域与非沉默区域的对应部位进行转录谱分析，将有助于明确目标基因沉默所引发的效应。体内基因X的转录谱分析将需要从显微切割区域提取RNA，控制手动切割的准确性，通过逆转录PCR（R-T-P-C-R）评估两个样品中GFP的表达，通过实时R-T-P-C-R或微阵列分析对两个样品中沉默基因的潜在靶标表达进行定量。接下来详细介绍每个步骤。第一步，遗传杂交。遗传杂交涉及GAL4-UAS转基因品系，旨在获得在幼虫后代中基因沉默的成虫盘。通用的GAL4系统可通过RNA干扰实现特定且局部的基因沉默。一种品系在杂交中引入了驱动子转基因，该转基因以特定的时间或空间模式表达GAL4，以及一个A-U-A-S-G-F-P报告基因，用于可视化GAL4的表达区域。第二种品系引入了一个UAS响应子转基因，该转基因表达发夹沉默RNA，可在细胞中表达后特异性靶向基因X。这种RNA被切割后产生小干扰RNA，能够特异性地沉默该杂交后代中的目标基因X。UAS沉默转基因仅在表达GAL4蛋白的细胞中转录，从而诱导基因X在特定空间范围内的沉默。在众多应用中，我们重点关注了由Grailed-GAL4驱动子介导的翅盘中RNA转录谱的分析，该驱动子可在后部区室中实现特异性沉默。沉默区域由 U-A-S-G-F-P 转基因的表达标记。在后部区室中，将触发两个事件：GGFP 的表达和基因 x 的沉默。第二步，处理解剖支架以抑制RNA酶活性。在室温下，用DEPC水清洗支架载玻片和解剖工具至少一小时，然后在无菌环境中晾干。为抑制RNA酶活性，使用一个全新的、已去除RNA酶的50 ml离心管，其中装入含DEPC水的镊子、悬滴载玻片和宠物支架。两者均需用于显微解剖。盖上管盖，将其倒置，然后在室温下静置反应至少一小时。一小时后，用镊子将DEPC水转移至另一管中。将载玻片置于管内，以防滑落，随后让载玻片在管内干燥。第三步，显微解剖准备。首先，打开所有需要的设备，包括荧光灯、显微镜以及显微切割软件。警告窗口会提示您同时打开激光器。请开启激光器，并在完成显微切割系统设置的同时让激光器预热。现在需要准备用于收集组织的孔。使用Leica LMD 6,000激光切割设备时，可加载最多四个管子以收集不同的样本。就我们的目的而言，仅需两个管子。一个用于收集GFP阳性沉默组织，另一个用于收集GFP阴性单层组织，使用显微镊子操作。将两个离心管管盖中均加入20 µL Trizol试剂溶液，以保存RNA。现在显微解剖工具已准备就绪。步骤四：手工解剖果蝇幼虫的翅成像盘。按照前述方法获取幼虫后代，分离其翅成虫盘，并确保其他组织不会污染成虫盘。为实现这一目标，解剖方法与通常用于收集全部原始成虫盘的方法有显著不同。首先，用林格氏液清洗幼虫，以去除附着的培养基。然后将其转移至悬滴载玻片中，立即剪去头部，并向下牵拉口器。现在使用昆虫针小心地剥离其他组织。红色轮廓标示出需要采集的成虫盘。迅速而轻柔地将成虫盘与附着组织分离，并将每块分离的成虫盘立即转移至解剖框中进行切割。此操作需要重复进行，直至获得总共一百个翅盘。第五步，对表达GFP标记的翅盘特定区域进行激光显微切割。一旦原始翅盘位于膜上，即可开始切割。将切片框放置于支架上，并将支架固定在电动载物台上。使用LMD 6,000作为普通显微镜寻找原始的翅成虫盘。聚焦后设定切割区域。绘制一个能够覆盖圆盘两侧（GFP 阳性侧和另一侧）的椭圆形区域。选择您希望收集 GFP 阳性部分的管盖。按下“开始切割”按钮。显微解剖仪将按照您先前通过选择“移动并切割”功能所设定的速度和功率进行组织切割。您可以手动精细调整切割过程，直至未被选中的组织部分脱落。三维动画展示了显微解剖仪在操作过程中的情况：激光聚焦于组织上，沿所选轮廓进行切割。切割完成后，组织片段会落入所选的管盖中，并随之进入TRI Reagent。第一次切割后，将切割区域移至翅盘的另一侧，以切割大小相当的GFP阴性区域。在进行下一次切割前，务必选择另一个管盖，以确保GFP阳性组织与GFP阴性组织分开存放。自动切割完成后，按下开始切割按钮。在第二次切割前，根据三维动画所示手动优化切割位置。电机驱动的载物台将选定的管盖移至切割区域下方。激光束聚焦于沿选定周长切割的组织，切割完成后，组织碎片落入含有Trizol裂解液的选定管盖中。为了收集足够的材料，我们在一百个成虫盘上重复了该操作。收集完样品后，取出试管。这是一个非常关键的步骤，操作不当可能导致此前所有的努力付诸东流。因此务必小心谨慎。将瓶盖倒置盖上，然后继续实验操作。这是含有GFP阳性组织的样本。这是含有GFP阴性组织的另一个样本。第六步，转录谱分析。旋转离心管，使液体脱离管盖，加入 Try 试剂至 1 毫升。按照标准的 Try 试剂方案，从约 100 个、每个约 5,000 平方微米的区域进行 RNA 提取。我们的得率为 1.5 微克 RNA。我们在体外使用上标三合成带有随机六聚体的CD NA。通过R-T-P-C-R检测两个样本中GFP的表达，以控制手动解剖的准确性。如定量R-T-P-C-R凝胶所示。我们评估了沉默基因X的表达水平及其在基因X介导的调控通路中可能的假定靶基因的表达水平。该图展示了基因X及其一个假定靶基因的表达水平示例，相对于未成熟翅盘前后区室中的基础表达水平，将这些靶基因称为基因Y。在沉默后，发现所选基因X的活性降低至40%。相比之下，其一个假定靶基因Y显著上调，增幅达七倍，这促使我们验证了基因X负向调控基因Y的假设。我们得出结论：上述实验方法可成功应用于多种调控通路中假定靶点的验证。

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