激光显微切割的从细胞的一个子集基因表达分析中的应用果蝇永光盘

在此，我们提供了激光显微切割的全面描述，用于实现果蝇翼盘沉默和 uns 沉默区域的 A 比较 RNA 转录物分析。这种方法需要以人工解剖的果蝇图像盘为主要设备，以激光显微解剖器为生物材料。我们使用 LI A-L-L-M-D 6， 000 和实时 PCR 机。

我们使用了 BioRad iq。所需的五个小工具是一块凹板、一个小画笔显微解剖钳、悬挂下滑虫钳、安装在注射器针头上的金属框架、带 PET 膜的小塑料管。该方法包括以下步骤。

第一步，穿过两个合适的 oph 转基因系，以便利用 GAL four UAS 系统在后代中触发定位和特异性基因沉默。第二步，处理解剖架。第 3 步，设置激光显微解剖仪。

第四步，从遗传杂交的幼虫后代中手动收集翅膀假想盘。第 5 步，对 GFP 标记的假想盘的特定区域进行激光显微解剖。第六步，对椎间盘沉默和非实性区域的等效区域进行转录分析，将允许建立由沉默目标基因触发的效果。

称为基因 X 的体内转录分析将需要从显微解剖区域提取 RNA，控制手动解剖的准确性，通过 R-T-P-C-R 评估两个样本中 GFP 的表达，定量推定的表达。通过实时 R-T-P-C-R 或进行微阵列分析来靶向两个样品中沉默基因。现在，有关每个步骤的更多详细信息。

第一步，基因杂交。遗传杂交涉及 GAL 四种 UAS 转基因菌株，并专注于在幼虫后代中获得沉默的假想盘。Versatile GAL four 系统允许您通过 RNA 干扰触发特异性和定位基因沉默。

一个菌株在杂交中引入驱动转基因，该转基因以特定的时间或空间模式表达 GAL 4。以及 A-U-A-S-G-F-P 报告基因，可实现 GAL 四个表达域的可视化。第二个菌株引入了一个 UAS 反应基因，该转基因表达发夹沉默 RNA，能够特异性靶向在细胞中表达的基因 X。

该 RNA 被切割以产生小的干扰 RNA，它能够特异性地沉默该杂交后代中选定的基因 X。UAS 沉默转基因仅在表达 GAL 4 蛋白的细胞中转录，从而诱导 X 基因的空间限制性沉默。在各种应用中，我们专注于由 Grailed GAL four 驱动器静音的翼盘中的 RNA 转录物分析，该驱动器指导后室的特异性沉默。

沉默区以 U-A-S-G-F-P 转基因的表达为标志。在后室。将触发 GGFP 的表达和基因 x 的沉默两个事件。

第二步，处理解剖框以抑制 RNA 活性。在室温下用 DEPC 水清洗框架载玻片和解剖工具至少一小时，然后让它们在无菌室中干燥。为了抑制 RNA 活性，请使用一个全新的 50 ml 试管，该试管已不含 RNA，装满 DEPC 水，并在试管中放入镊子、悬挂滴载玻片和宠物框架。

两者都需要进行显微解剖。盖上试管，将其倒置，然后让它反应至少一小时。在室温下，一小时后，用镊子将 DEPC 水移到另一根管子中。

将载玻片固定在管内，以免它们掉落。然后让玻片在试管内干燥。第三步，显微解剖设置。

首先，打开所有需要的设备、荧光灯泡、显微镜和显微解剖软件。警告窗口将提醒您同时打开激光器。这样做，并在完成显微解剖设置时让激光预热。

现在是时候准备收集组织的井了。切。Leica LMD 6， 000 激光切割设备最多可装载四根试管以收集不同的样品。就我们的目的而言，我们只需要两根管子。

一是收集 GFP 阳性沉默组织，二是收集 GFP 阴性单组织与微胸肌。用 20 μL tri 试剂溶液填充两个管盖以保存 RNA。现在显微解剖已准备好使用第四步，手工解剖 joof 幼虫的翅膀成像盘。

如前所述，从获得的幼虫后代中分离翼盘，并确保其他组织不会污染椎间盘 为了实现这一目标，I 解剖方法与通常用于收集所有原始椎间盘大部分的方法完全不同。首先，在林格氏液中洗涤幼虫以去除粘附的培养基。然后将其转移到悬滴滑道中，切掉头部，立即将嘴向下拉。

现在使用昆虫针可以小心地解剖掉其他组织。红色轮廓显示了要收集的假想翼盘。快速轻柔地保持椎间盘没有粘附的组织 将每个分离的翼盘转移到解剖架上，以便立即切割。

需要重复此过程，直到达到 100 个翼盘的总数。第 5 步，对 GFP 标记的翼盘的特定区域进行激光显微切割。一旦原始翼盘位于膜上，您就可以继续切割。

将框架放在支架上并将支架固定在电动载物台上。使用 LMD 6， 000 作为普通显微镜寻找原始翼盘。专注于它并设置剪辑。

画一个适合圆盘两侧的椭圆形区域，GFP 正极和另一侧。选择要收集 GFP 正部分的管帽。按下 Start cut 按钮。

微型解剖器 通过选择移动和切割功能，以您之前设置的速度和功率继续切割组织。您可以手动优化切割，直到未选中的 Piece of tissue 掉落。3D 动画显示了在微型解剖器切割下发生的情况，激光聚焦在组织上，沿选定的周边进行切割。

切割完成后，组织块落在选定的管帽中，从而落入 tri 试剂中。第一次切割后，移动翼盘另一侧的切割区域，以切割等效的 GFP 负区域。在进行新的切割之前，请务必选择不同的管帽，以保持 GFP 阳性组织和 GFP 阴性组织分开。

自动切割后按下开始切割按钮。继续手动优化剪切，如第二次剪切之前的 3D 动画所示。电动载物台将选定的管帽移动到切割区域下方。

激光束聚焦在沿所选周边切割的组织上，切割完成后，组织块落在含有 Tri 试剂的选定管帽中。为了收集到足够的材料，我们在 100 个想象中的翼盘上重复了这个过程。收集样品后，卸载试管。

这是一个微妙的步骤，可能会使您失去迄今为止所做的所有工作。所以要小心。将盖子倒置，然后继续进行实验。

这是 GFP 阳性组织的那个。这是另一个具有 GFP 阴性组织的。第六步，转录分析。

旋转试管，从瓶盖上分离液体，并加入最多 1 毫升的试用试剂。按照标准 try 试剂方案从 100 个区域（每个区域约 5， 000 平方微米）中进行 RNA 提取。我们的产量为 1.5 μg RNA。

我们在体外使用上标 3 合成具有随机六边形的 CD NA。通过 R-T-P-C-R 检查两个样品中的 GFP 表达来控制手动解剖的准确性。如具有定量 R-T-P-C-R 的凝胶所示。

我们评估了沉默基因 X 的表达水平以及基因 X 介导的调节途径的可能推定靶标的表达水平。该图显示了基因 X 的表达水平及其推定靶标之一的示例。根据它们在非实心翼盘前后隔室中的基础表达水平，将它们称为基因 Y。

发现所选基因 X 的活性在沉默后降低到 40%。相比之下，发现其推定靶点之一基因 Y 显著上调，增加了 7 倍，这导致我们验证了它受基因 X 负调控的假设。