Name: RNAi筛选参与宿主因素牛痘病毒感染使用果蝇细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-25T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 了解利用RNAi筛选技术识别病毒感染相关宿主因子的方法，通过果蝇细胞模型进行高通量筛选。本方法结合免疫荧光显微镜检测，为研究病毒与宿主相互作用提供可靠框架。

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本研究获得了NIAID（R01AI074951、U54AI057168）和宾夕法尼亚基因组前沿研究所对SC的资助；NIH T32HG000046对TSM的资助；以及NIH T32GM07229和T32AI007324对LRS的资助。

第1部分：384孔板中的RNAi
<ol>
 <li>用于筛选的试剂标准化至关重要。我们对每一批次的Schneider's培养基、胎牛血清和染色试剂进行单独测试，然后分装并全程使用同一批次的试剂完成整个筛选过程。</li>
 <li>对于任何检测，最好测试多种不同的细胞系，以确定哪种细胞系最适合您的生物学检测读数。我们通常使用S2-DRSC细胞系。</li>
 <li>在25°C条件下，使用完全Schneider's培养基培养果蝇（Drosophila）细胞。
 <ol class="lalpha">
 <li>Schneider's培养基</li>
 <li>10% 热灭活FBS</li>
 <li>1X L-谷氨酰胺</li>
 <li>1X 青霉素/链霉素抗生素</li>
 </ol>
 </li>
 <li>果蝇（Drosophila）细胞为半贴壁细胞，每四天通过移液将细胞从培养瓶中吹打下来，并以1:10比例稀释至新的培养瓶中进行传代，无需使用胰酶消化。实验时应确保细胞处于对数生长期。</li>
 <li>通过使用自动化液体处理系统向多孔板中添加所有液体，可最大限度减少板间和日间差异。我们使用WellMate（Matrix）设备。</li>
 <li>准备WellMate管路。
 <ol class="lalpha">
 <li>用70%乙醇喷洒生物安全柜和WellMate设备。</li>
 <li>从包装中取出管路并用70%乙醇喷洒。</li>
 <li>将管路盒插入WellMate的分配位置。</li>
 <li>用25 mL 70%乙醇预冲洗管路。</li>
 <li>用乙醇对管路灭菌15分钟，再用另外25 mL乙醇预冲洗一次。</li>
 <li>用50 mL无菌PBS预冲洗管路进行润洗。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>从培养瓶中吹打下细胞并计数。离心收集细胞，使其数量比所需量多出25%（300×g，5分钟）。每孔接种的细胞数量需根据实验持续时间进行优化。当进行自动图像分析时，理想的条件是形成单层且无细胞团块的细胞层，以便于图像分割。</li>
 <li>将离心后的细胞重悬于无血清Schneider's培养基中，浓度为1.7×106 个细胞/mL。</li>
 <li>我们在384孔板中进行筛选，每孔已预先分装有市售的dsRNA文库，浓度为250 ng/孔。每块板保留若干孔作为空白对照，手动添加。我们使用靶向荧光素酶的dsRNA作为阴性对照；使用靶向Thread（dIAP）的dsRNA作为RNA干扰效果强的阳性对照，该抗凋亡因子的敲低会导致明显的细胞死亡，可快速通过视觉评估敲低效果；最后，我们使用靶向病毒报告基因（本例中为β-半乳糖苷酶）的dsRNA作为阳性对照，以验证本检测体系能够抑制病毒感染。若在接种细胞时点样dsRNA，应将1 μL dsRNA点于孔的角落以便观察，随后离心使dsRNA沉降至孔底（300×g，1分钟），再加入细胞。</li>
 <li>使用WellMate将上述制备的10 μL细胞悬液加入各孔中。</li>
 <li>将细胞离心沉降至板底（300×g，1分钟）。</li>
 <li>在25°C培养箱中孵育45分钟。</li>
 <li>加入20 μL完全Schneider's培养基，并再次离心（300×g，1分钟）。</li>
 <li>将培养板置于内衬浸湿滤纸的密闭塑料容器（Tupperware）中。由于384孔板的体积较小，蒸发可能对生物学结果产生显著影响，进而导致边缘孔的检测结果出现假象。为避免此问题，应将培养板保持在高湿度环境中。</li>
 <li>孵育三天，以实现充分的基因敲低。在此期间无需更换培养基或打开密闭容器。</li>
</ol>
第2部分：接种Vaccinia病毒
<ol>
 <li>将多通道移液器在Quatricide中灭菌15分钟，然后用70%乙醇冲洗。</li>
 <li>按上述方法准备WellMate。</li>
 <li>通过将完全培养基在无血清培养基中按1:5稀释，制备含2% FBS的Schneider培养基用于感染。</li>
 <li>用0.8 μm注射器滤器过滤粗病毒原液以去除细胞碎片，或使用纯化的病毒。</li>
 <li>将vaccinia病毒用含2%血清的Schneider培养基稀释，以获得2的感染复数（MOI）。</li>
 <li>从WellMate管路中移除PBS，并用稀释后的病毒液冲洗管路，直至其中无气泡。</li>
 <li>使用已灭菌的多通道移液器和真空 manifold 装置，轻柔地从经dsRNA处理的Drosophila细胞板中移除培养基。</li>
 <li>使用WellMate向每孔加入30 μL病毒液。</li>
 <li>将细胞板在300×g下离心1分钟。</li>
 <li>对WellMate管路进行灭菌：先用25 mL 10%次氯酸钠冲洗并静置10分钟，再用另外25 mL 10%次氯酸钠冲洗。</li>
 <li>接着用50 mL水冲洗管路，再用50 mL 70%乙醇冲洗，然后将管路放回包装中。</li>
 <li>将细胞板放回加湿的Tupperware容器中，在25°C下孵育48小时。</li>
</ol>
第3部分：染色平板
<ol>
 <li>用多通道移液器和真空 manifold 在每步去除液体，将板在 15 μL 4% 多聚甲醛/PBS 中固定 10 分钟。固定完成后，不再需要无菌设备和试剂。</li>
 <li>去除固定液，使用 WellMate 加入 30 μL PBST（PBS + 0.1% Triton-X）。孵育 10 分钟后重复一次。操作 WellMate 的方法同上，但管路无需灭菌。</li>
 <li>为检测 vaccinia 感染，我们使用由早期/晚期 vaccinia 启动子驱动的 β-半乳糖苷酶报告基因。</li>
 <li>去除液体，将细胞在封闭液（含 2% BSA 的 PBST）中孵育 10 分钟。</li>
 <li>在封闭液中稀释一抗，去除液体后使用多通道重复移液器（Matrix）向每孔加入 15 μL 抗体。</li>
 <li>将板离心（300×g，1 分钟），用透明封口膜密封，4°C 过夜孵育。</li>
 <li>去除一抗，使用 WellMate 用 PBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
 <li>在封闭液中稀释荧光标记的二抗（FITC）和细胞核染料，使用多通道重复移液器向每孔加入 15 μL。</li>
 <li>在室温避光孵育 1 小时。</li>
 <li>使用 WellMate 用 PBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
 <li>用透明封口膜密封板，加盖后可在 4°C 保存最多三周。</li>
</ol>
第4部分：成像与图像分析
<ol>
 <li>使用自动显微镜以20倍放大倍数对培养板进行成像。</li>
 <li>拍摄总细胞核（DAPI）和感染细胞（FITC）的图像。针对每个通道分别优化曝光时间，以最大化动态范围。</li>
 <li>通过采集一系列间隔为1 μm的Z轴图像序列，覆盖预期焦平面之上和之下的范围，来精细调整自动对焦功能。确定最佳焦平面后，相应地调整自动对焦设置。</li>
 <li>对整块板进行成像，每个孔至少在Hoechst通道（DAPI）和病毒通道（FITC）中各采集三幅图像。应从每个孔内的多个不同区域选择成像位点，以确保所采集的图像能够代表该孔的整体情况。</li>
 <li>使用 MetaXpress 软件编写流程以分割图像，并利用 Count Nuclei 模块计算每块孔板中细胞核染色阳性（总细胞数）和感染（FITC）的细胞总数。</li>
 <li>计算感染率（100 × FITC阳性细胞数 / 总细胞数），并进行对数转换。</li>
 <li>为筛选候选物，我们采用基于每块板的中位数和四分位距的稳健 Z 分数。该方法对异常值和非对称数据不敏感，因此在识别弱或中等程度的阳性结果时具有更高的检出能力10。对于每块板，首先从经对数转换的数据中减去中位数，然后将所得数值除以 0.74 倍的四分位距（即第 75 百分位数与第 25 百分位数之间的差值）th 百分位数和25th 百分位数）。0.74 系数用于近似标准正态分布。</li>
 <li>稳健Z分数是衡量与平板中位数之间距离的指标，单位为标准差。例如，稳健Z分数为2表示该孔的感染率与平板中位数相差约2个标准差，或p&lt;0.05.</li>
 <li>分析细胞数量以鉴定细胞毒性候选物。计算细胞核计数的稳健Z分数。稳健Z分数&lt;-2 在重复筛选中被视为具有细胞毒性。</li>
 <li>感染百分比具有较强 Z 分数的孔 &gt;2 或 &lt;-2，进行两次重复筛选（p&lt;细胞毒性较低且效果显著（0.0025）的化合物被视为初筛中的潜在候选物。</li>
 <li>使用独立的试剂对阳性候选基因进行验证。针对目的基因的mRNA另一区域设计并生成dsRNA，然后按照上述方法进行测试。</li>
 <li>那些具有两个独立dsRNA产生相同表型的基因可被考虑用于进一步研究。</li>
</ol>
第5部分：感染率的代表性图像及解读
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="荧光显微镜：未感染细胞与痘苗病毒感染细胞的比较，病毒感染影响分析，对比研究" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 未感染的孔中未显示任何染色 痘苗病毒 病毒蛋白，而一个具有代表性的感染孔中的细胞则呈阳性染色 痘苗病毒表达的β-半乳糖苷酶（βgal）蛋白，通过免疫荧光显微镜检测。病毒=绿色，细胞核=蓝色。
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="通过荧光显微镜进行细胞分析；细胞核及痘苗病毒感染检测；图像处理结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 自动化图像分析软件根据用户设定的参数，对每张图像中的感染情况进行定量分析。在一幅代表性图像中，基于染色强度相对于局部背景染色的大小，对细胞核总数以及表达病毒抗原的细胞数量进行计数。
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="dsRNA 实验；荧光显微镜图像比较未处理与 thread 处理的结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 图 3. thread (dIAP) 的敲低可作为目标基因有效 RNAi 耗竭的阳性对照。该抗凋亡因子的敲低可导致显著的细胞死亡。细胞核=蓝色。
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="荧光显微镜比较未处理与荧光素酶dsRNA处理对细胞样本的影响。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 荧光素酶的敲低用作双链RNA处理对感染影响的阴性对照。与未处理细胞相比，荧光素酶的耗竭对感染无影响。病毒=绿色，细胞核=蓝色。
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="dsRNA 荧光素酶 vs βgal 实验结果；荧光显微镜图像；基因沉默分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5. βgal 蛋白的敲低作为感染减少的阳性对照，因为该检测以 βgal 蛋白水平作为感染程度的读数。βgal 的耗竭导致感染细胞百分比下降。病毒=绿色，细胞核=蓝色。
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="RNA干扰效应；显微镜图像；dsRNA荧光素酶，Rab5；细胞荧光分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 图6. 细胞因子Rab5的敲低导致感染细胞百分比下降。由于Rab5已知参与内吞作用，该因子可能有助于vaccinia病毒的进入。此结果代表筛选中的一个异常值示例。病毒=绿色，细胞核=蓝色。

<ol><li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li>
<li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li>
<li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells%3A+regulation+of+viral+transcription+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li>
<li>Sessions, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+insect+and+human+dengue+virus+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of insect and human dengue virus host factors.</a> Nature. 458, 1047-1050 (2009).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells%3A+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li>
<li>Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454, 890-893 (2008).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li>
<li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在Drosophila中进行全基因组RNAi筛选，为研究病毒感染的细胞组分提供了一种稳健且高效的方法。多种哺乳动物病毒能够感染Drosophila细胞，这些系统可用于鉴定宿主固有免疫应答的相关组分，以及病毒复制所必需的宿主蛋白因子，后者可能成为新的治疗靶点。在开展筛选之前，必须针对细胞类型、细胞数量和感染水平对检测方法进行仔细优化，并设置良好的对照，包括阳性和阴性的病毒及细胞靶标11。在开始筛选前，应确保阳性对照与阴性对照之间具有足够的区分度，以最大化检测的动态范围。筛选完成后，可将候选基因按功能类别进行分类，以确定哪些宿主机制参与了病毒感染过程。对于如vaccinia病毒等哺乳动物病毒，应在二级分析中通过RNAi验证其哺乳动物同源基因的功能贡献。综上所述，这些稳健的筛选方法将有助于我们深入理解病毒与其宿主细胞相互作用的复杂机制。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>施耐德&amp;rsquo;s 培养基</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11720</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100X</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（pen/strep）</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;筛选&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>全基因组dsRNA文库</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384孔板，黑色，透明底</td><td>康宁</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>铝封膜</td><td>康宁</td><td>6569</td><td></td></tr><tr><td>清晰封口</td><td>德文特科学</td><td>B1212-4</td><td></td></tr><tr><td>Well Mate</td><td>Matlab</td><td>201-10001</td><td></td></tr><tr><td>24针歧管</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-101</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>荧光标记的二抗</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageXpressMicro 自动化显微镜</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress 图像分析软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rnai 筛选参与痘苗病毒（vaccinia）感染的宿主因子：利用果蝇（drosophila）细胞

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

病毒病原体对公共卫生构成重大威胁；病毒不仅可引发人类疾病的自然流行，还可能被用于生物恐怖主义，令人担忧。深入理解影响病毒感染的细胞因子将有助于开发亟需的治疗手段。近年来，RNA干扰（RNAi）技术的进步，结合多种生物体的全基因组测序，推动了全基因组范围、基于细胞的功能缺失筛选技术的优化。Drosophila细胞因其在该系统中RNAi操作简便且效率高，特别适用于基因组尺度的筛选1。重要的是，多种病毒均可感染Drosophila细胞，其中包括若干具有医学和农业重要性的哺乳动物病毒2,3,4。以往在Drosophila中开展的RNAi筛选已鉴定出在病毒感染多个步骤（如病毒进入、翻译和RNA复制）中所必需的宿主因子5。此外，在Drosophila细胞培养中支持病毒复制的许多细胞因子，在人类细胞感染这些病毒时同样具有限制性作用4,6,7,8,9。因此，鉴定病毒在感染过程中劫持的宿主因子，为抗病毒治疗提供了新的靶点。本文以痘苗病毒（vaccinia virus）为例，介绍一种用于鉴定参与病毒感染的细胞因子的高通量RNAi筛选通用实验方案。

通过基于细胞的全基因组功能缺失RNA干扰筛选，可以鉴定出参与病毒感染的新型宿主因子。Drosophila 细胞培养模型特别适用于该方法，因为其RNA干扰操作简便且效率高。本文以痘苗病毒（vaccinia virus）为例，展示该技术的具体应用。

RNAi 筛选参与痘苗病毒（Vaccinia）感染的宿主因子：利用果蝇（Drosophila）细胞

病毒病原体对公共卫生构成重大威胁；病毒不仅可引发人类疾病的自然流行，还可能被用于……

本实验的总体目标是利用高通量RNA干扰（RNAi）筛选，鉴定参与病毒感染的宿主因子。该目标通过以下步骤实现：首先在384孔板中利用RNAi技术敲低目的基因；随后，用目标病毒感染细胞，通过免疫荧光显微镜检测病毒蛋白的表达，从而评估病毒感染水平。最后，通过自动化的图像分析来鉴定候选基因，以进行验证和进一步研究。最终，可通过免疫荧光显微镜定量感染细胞的百分比，获得反映感染变化的结果。这有助于发现参与病毒感染的新型细胞因子。尽管该方法可用于研究病毒与宿主之间的相互作用，但也适用于任何需要通过可视化手段读取目标细胞过程的研究体系。初次使用该方法的研究人员应预期存在较陡峭的学习曲线，因为在尽量减少变异性的前提下实现可重复的感染需要大量的优化工作。为确保结果的可重复性，关键是在整个筛选过程中对每种试剂均使用同一批号。在25摄氏度下，使用完全Schneider培养基培养S2DRSC果蝇细胞，细胞应处于对数生长期。在超净台中进行实验时，通过剧烈吹打使半贴壁细胞从培养瓶中脱落。使用血细胞计数板计数后，将实验所需细胞数量的125%转移至50毫升锥形管中，在300 ×g离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于无血清Schneider培养基中，最终浓度为每毫升1.7×10⁶个细胞。使用已灭菌并预处理的自动化液体处理系统。此处采用矩阵孔配对法以最大限度减少酶标板间的差异。将10 µL细胞悬液加入预先包被有每孔250 ng双链RNA的384孔板的每个孔中。以300 ×g离心1分钟，使细胞沉降到孔板上。将培养板在 25 摄氏度下孵育 45 分钟。向每孔加入 20 µL 完全 Schneider 培养基。在 300 ×g 下离心培养基 1 分钟，以尽量减少蒸发的影响。将培养皿置于铺有浸水滤纸的加湿密封容器中保存。在生物安全二级柜中，于25摄氏度培养三天，以确保产生显著的基因敲低效果。在感染细胞前，使用0.8微米注射器滤器过滤粗制的痘苗病毒原液。为了去除细胞碎片。用含2%血清的Schneider培养基稀释病毒，以获得感染复数（MOI）为2'的感染条件。将灭菌后的移液槽与稀释的病毒混合，直至管路中无气泡。使用带真空泵的灭菌多通道移液器，轻轻吸除经双链RNA处理的果蝇细胞培养板中的培养基。向每孔加入30 µL稀释后的病毒。将培养板在300 ×g条件下离心1分钟。将培养板放回湿化容器中，在25 °C下孵育48小时。在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中，从培养板中吸出培养基。然后使用多通道移液器向每孔板中加入15 µL的4%多聚甲醛固定液。室温孵育15分钟。用多通道吸液器移除液体。使用WELLMADE向每个孔中加入30 µL PBST。室温孵育10分钟。以相同方式再进行一次10分钟的PBST洗涤。孵育步骤完成后，移除液体，并加入30微升含2% VSA的PBST封闭液。室温孵育10分钟。使用多通道重复移液器将用封闭液稀释的15微升一抗加入每个孔中。将培养板在300 G下离心1分钟。用透明封板膜密封各孔，于4摄氏度孵育过夜。使用多通道移液器和吸液装置，用PBST缓冲液洗涤细胞3次，每次10分钟。使用多通道移液器向每个孔中加入15 µL带荧光标记的二抗及核染料。用铝箔覆盖孔板以避光，于室温孵育1小时。用PBST按之前方法洗涤细胞，每次10分钟，共洗三次。向细胞中加入 30 微升 PBST，用透明封板膜密封，并用铝箔覆盖。将密封的板在 4 摄氏度下保存，最长可保存三周，之后在自动化显微镜下进行成像。未感染的孔中未显示任何痘苗病毒蛋白的染色，而代表性的感染孔中含有细胞。通过免疫荧光显微镜检测，可见痘苗病毒表达的β-GCSE蛋白呈染色阳性。自动化图像分析软件根据用户设定的参数，对每张图像中的感染情况进行定量分析。在代表性图像中，根据染色信号相对于局部背景的大小和强度，对细胞核总数以及表达病毒抗原的细胞数量进行计数。对 thread 基因的敲低作为靶基因有效 RNA 干扰耗竭的阳性对照。该抗凋亡因子的敲低会导致显著的细胞死亡。 荧光素酶的敲低作为双链RNA处理对感染影响的阴性对照。与未处理的细胞相比，荧光素酶的耗竭对感染无影响。β-半乳糖苷酶蛋白的敲低作为感染减少的阳性对照。由于该检测方法以β-半乳糖蛋白水平作为感染的读数，β-半乳糖蛋白的耗竭会导致感染细胞百分比下降。细胞因子RAB5的敲低也会导致感染细胞百分比下降。由于已知RAB5参与内吞作用，该因子可能在痘苗病毒进入过程中发挥作用。观看本视频后，您应充分了解如何在果蝇中利用RNAi筛选来鉴定参与病毒感染的宿主因子，包括实施RNAi、接种痘苗病毒、染色成像以及对384孔板进行分析。请务必注意，操作活病毒具有极高危险性，进行该实验时必须采取防护措施，例如穿戴实验服和护目镜。活病毒只能在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中打开，任何接触过活病毒的物品在丢弃前均须用10%次氯酸钠溶液灭菌处理。

rnai-screening-for-host-factors-involved-vaccinia-virus-infection

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

RNAi筛选参与宿主因素牛痘病毒感染使用果蝇细胞

RNA干扰技术已被证明在分析Drosophila气管发育中基因功能方面非常有效。本文展示了姜实验室用于将dsRNA注射到果蝇胚胎中以敲低基因表达的详细实验方案。该技术有望用于筛选Drosophila组织和器官发育所必需的基因。...

通过向Drosophila胚胎注射dsRNA进行RNAi干扰

我们描述了一种增敏方法，利用基于RNAi的基因组筛选和整合的转基因，该转基因表达一种带有荧光标签的功能性蛋白质，以鉴定秀丽隐杆线虫（C.

RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

在本视频中，我们介绍了一种将正义单链RNA病毒纳米注射至成年雄性Drosophila果蝇体内的方法，并随后研究由此感染引发的抗病毒免疫反应。通过聚合酶链式反应分析，可鉴定出感染果蝇中特定基因的上调表达，表明RNA干扰和JAK/STAT信号通路等免疫反应通路被激活。...

成年果蝇胸腔内病毒纳米注射以研究宿主-病毒相互作用

本出版物旨在对从黑腹果蝇（Drosophila...

果蝇（Drosophila Melanogaster）中微小RNA种类的增强型Northern印迹检测

本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。...

全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

本方法展示了如何利用三维（3D）模型可视化病原体侵入昆虫细胞的过程。从黑腹果蝇（Drosophila）幼虫中分离的血细胞被病毒或细菌病原体感染，感染方式包括离体（ex vivo）或活体（in...

从黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫中提取血细胞用于微生物感染与分析

本文介绍了用于鉴定以下两类分子的实验方案：1）促进节肢动物传播病毒（arbovirus）复制的病毒编码免疫调节因子；2）限制节肢动物传播病毒复制的真核宿主因子。这些基于荧光和发光的检测方法使研究人员能够在信号-背景比低的简单实验体系中，快速获得节肢动物传播病毒复制的定量结果。...

利用虫媒病毒感染作为筛选工具鉴定病毒免疫调节因子和宿主抗病毒因子

本方案描述了一种我们已标准化并多年用于将特定量的核酸直接递送至蚊子和家蝇血淋巴的显微注射方法。该方案可实现极低的注射死亡率，并允许进行与剂量相关的繁殖力测定。...

蚊虫与家蝇中可重复的dsRNA显微注射及产卵生物测定

本方案描述了如何建立病毒感染 体内 在 黑腹果蝇...

Drosophila Melanogaster 中病毒感染的建立及宿主-病毒相互作用分析

本方案描述了一种在成年黑腹果蝇（Drosophila...

利用体内吞噬作用检测法评估果蝇Drosophila melanogaster的细胞免疫反应

我们介绍一种利用正向遗传学方法筛选表现出神经退行性变的黑腹果蝇（Drosophila...

体内正向遗传筛选以鉴定新型神经保护基因 黑腹果蝇

了解利用RNAi筛选技术识别病毒感染相关宿主因子的方法，通过果蝇细胞模型进行高通量筛选。本方法结合免疫荧光显微镜检测，为研究病毒与宿主相互作用提供可靠框架。

RNAi 筛选参与痘苗病毒（Vaccinia）感染的宿主因子：利用果蝇（Drosophila）细胞

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