RNAi筛选参与宿主因素牛痘病毒感染使用果蝇细胞

该程序的总体目标是利用高通量 RNAI 筛选来识别与病毒感染有关的宿主因子。这是通过首先在 384 孔板中通过 RNAI 耗尽目标基因来实现的。接下来，用感兴趣的病毒染色剂攻击细胞以获取病毒蛋白，并通过免疫荧光显微镜测量病毒感染。

最后，进行自动图像分析以识别候选基因以进行验证和进一步研究。最终，通过使用免疫荧光显微镜定量感染细胞的百分比，可以获得显示感染变化的结果。这允许发现与病毒感染有关的新型细胞因子。

虽然这种方法可以提供对病毒宿主相互作用的见解，但它也可以应用于任何受益于使用感兴趣细胞过程的视觉读数的系统的研究。不熟悉这种方法的个体应该会有一个陡峭的学习曲线，因为在实现可重复感染的同时最大限度地减少变异性需要相当大的优化。为了确保结果的可重复性，必须对整个筛选中使用的每种试剂使用单个批号。在 25 摄氏度下培养 S 2D RSC 果蝇细胞并完成 Schneider 培养基，细胞应处于对数期。

对于层流罩中的实验，通过严格的移液将半贴壁细胞从培养瓶中移出。依靠血细胞仪将实验所需的 125% 细胞转移到 300 G 的 50 mL 锥形管沉淀中，持续 5 分钟。吸出超级命名，将沉淀以 1.7 倍的终浓度重悬于无血清 Schneider 培养基中每毫升 6 个细胞中。

使用经过消毒和灌注的自动液体处理系统。在这里，基质孔配合以最大限度地减少板的可变性。在 Eloqua 之前的 384 孔板的每个孔中加入 10 μL 细胞悬液，每孔 250 ng 双链 RNA Spin 细胞以 300 G 的浓度添加到板上，反应时间为 1 分钟。

将板在 25 摄氏度下孵育 45 分钟。向每个培养基中加入 20 微升完全 Schneider 培养基。将培养基以 300 G 离心 1 分钟，以尽量减少蒸发的影响。

储存盘子和加湿的密封容器，内衬浸水的纸巾。在 25 摄氏度下孵育 3 天，以便在 BSL 2 生物安全柜中实现强大的敲低效果。在感染细胞之前，通过 0.8 微米注射器过滤器过滤粗痘苗病毒原液。

清除细胞碎片。在含有 2% 血清的 Schneider 培养基中稀释病毒，以获得感染的多样性。两个素数的缩写 MOI。

灭菌的井与稀释的病毒配合，直到管道中没有气泡。使用带有真空歧管的无菌多通道抽吸器，从双链 RNA 处理的果蝇细胞板中轻轻去除培养基。将 30 μL 稀释的病毒分配到每个板中。

将板以 300 G 离心 1 分钟。将板放回加湿容器中，并在 25 摄氏度下孵育 48 小时。在 BSL 中，两个生物安全柜从板中吸出培养基。

然后使用多通道移液器向每个板中加入 15 微升 4% 甲醛固定剂。在室温下孵育 15 分钟。用多通道抽吸器去除液体。

使用 WELLMADE 向每个 PBST 中加入 30 微升 PBST。在室温下孵育 10 分钟。以相同的方式进行第二次 10 分钟的 PBST 洗涤。

去除孵育块后的液体和 30 μL PBST 和 2%VSA 封闭溶液。在室温下孵育 10 分钟。使用多通道重复移液器向每个移液器中加入 15 μL 用封闭溶液稀释的一抗。

将板以 300 G 的离心力离心 1 分钟。用透明天花板薄膜密封每个板，在 4 摄氏度下孵育过夜。使用 Well Mate 和多通道吸液器在 PBST 中洗涤细胞 3 次，每次洗涤 10 分钟。

使用多通道移液器向每个容器中加入 15 μL 荧光标记的二抗和核染色。用铝箔纸盖住，以防止光照，在室温下孵育板 1 小时。像以前一样，用 PBST 洗涤细胞 3 次，每次洗涤 10 分钟。

向细胞中加入 30 微升 PBST，并用透明天花板密封。薄膜并用铝箔纸覆盖。在自动显微镜上成像之前，将密封板在 4 摄氏度下储存长达三周。

未感染的孔不显示痘苗病毒蛋白的任何染色，而代表性感染的孔包含细胞。通过免疫荧光显微镜测量的牛痘表达 β GCSE 蛋白染色阳性。自动图像分析软件使用用户设置的参数量化每张图像中的感染。

在代表性图像中，细胞核的总数和表达病毒抗原的细胞数根据局部背景上方染色的大小和强度进行计数。线的染色敲低是靶基因稳健 RNAi 耗竭的阳性对照。敲除这种抗凋亡因子会导致细胞急剧死亡。

荧光素酶的敲低是双链效应的阴性对照。RNA 处理对感染 荧光素酶的耗竭相对于未治疗的细胞对感染没有影响。敲低 β 半乳糖蛋白是减少感染的阳性对照。

由于该测定使用 β 半乳糖蛋白水平作为感染的读数，因此 β 半乳糖的消耗会导致感染细胞的百分比降低。敲除细胞因子 RAB 5 导致感染细胞的百分比降低。由于已知 RAB 5 参与内吞作用，因此该因素可能有助于牛痘病毒进入。

看完这个视频，您应该对如何使用果蝇中的 RNAi 筛选来识别导致病毒感染的宿主因素有一个很好的了解，包括进行 RNAi、感染牛痘病毒、染色成像和 384 分析。Well Plates 不要忘记，使用 DIA 病毒可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿着实验服和防护眼镜。活病毒只能在 BSL 两个生物安全柜中打开，任何与活病毒接触的东西都应在处置前用 10% 漂白剂消毒。