RNAi 筛选参与痘苗病毒（Vaccinia）感染的宿主因子：利用果蝇（Drosophila）细胞

本实验的总体目标是利用高通量RNA干扰（RNAi）筛选，鉴定参与病毒感染的宿主因子。该目标通过以下步骤实现：首先在384孔板中利用RNAi技术敲低目的基因；随后，用目标病毒感染细胞，通过免疫荧光显微镜检测病毒蛋白的表达，从而评估病毒感染水平。

最后，通过自动化的图像分析来鉴定候选基因，以进行验证和进一步研究。最终，可通过免疫荧光显微镜定量感染细胞的百分比，获得显示感染变化的结果。这有助于发现参与病毒感染的新型细胞因子。

尽管该方法可用于研究病毒与宿主之间的相互作用，但也适用于任何需要通过可视化手段读取目标细胞过程的研究体系。初次使用该方法的研究人员应预期存在较陡峭的学习曲线，因为要在尽量减少变异性的前提下实现可重复的感染，需要进行大量优化。为确保结果的可重复性，关键是在整个筛选过程中对每种试剂均使用同一批号。在25摄氏度下，使用完全Schneider培养基培养S2DRSC果蝇细胞，细胞应处于对数生长期。

在超净台中进行实验时，通过剧烈吹打使半贴壁细胞从培养瓶中脱落。使用血细胞计数板计数后，将实验所需细胞数量的125%转移至50毫升锥形管中，在300 ×g离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于无血清Schneider培养基中，最终浓度为每毫升1.7×10⁶个细胞。

使用已灭菌并预处理的自动化液体处理系统。此处采用矩阵孔匹配法以最大限度减少孔板间的变异性。将10 µL细胞悬液加入预先包被有每孔250 ng双链RNA的384孔板的每个孔中。以300 ×g离心1分钟使细胞沉降到孔板上。

将培养板在 25 摄氏度下孵育 45 分钟。向每孔加入 20 微升完全 Schneider 培养基。将培养基在 300 ×g 下离心 1 分钟，以尽量减少蒸发的影响。

将培养皿置于铺有浸水滤纸的加湿密封容器中保存。在生物安全二级柜中，于25摄氏度培养三天，以确保产生显著的基因敲低效果。在感染细胞前，使用0.8微米注射器滤器过滤粗制的痘苗病毒原液。

为了去除细胞碎片。用含2%血清的Schneider培养基稀释病毒，以获得感染复数（MOI）为2'的感染剂量。

将灭菌后的移液槽与稀释的病毒混合，直至管路中无气泡。使用带真空泵的灭菌多通道移液器，轻轻吸除经双链RNA处理的果蝇细胞培养板中的培养基。向每块培养板中加入30 µL稀释后的病毒。

将培养板在300 G条件下离心1分钟。将培养板放回湿化容器中，在25摄氏度下孵育48小时。在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中，从培养板中吸除培养基。

然后使用多通道移液器向每孔板中加入15 µL的4%多聚甲醛固定液。室温孵育15分钟。用多通道吸液器移除液体。

使用WELLMADE向每个孔中加入30 µL PBST。室温孵育10分钟。以相同方式再进行一次10分钟的PBST洗涤。

孵育步骤完成后，移除液体，加入30微升含2% VSA的PBST封闭液，室温孵育10分钟。使用多通道重复移液器将用封闭液稀释的一抗溶液15微升加入每个孔中。

将培养板在300 ×g离心1分钟。用透明封板膜密封各孔，于4°C孵育过夜。使用多通道移液器和洗板机，用PBST缓冲液洗涤细胞3次，每次10分钟。

使用多通道移液器向每个孔中加入15 µL带荧光标记的二抗及核染料。用铝箔覆盖孔板以避光，于室温孵育1小时。用PBST按之前方法洗涤细胞，每次10分钟，共洗三次。

向细胞中加入 30 微升 PBST，用透明封板膜密封，并用铝箔覆盖。将密封的板在 4 摄氏度下保存，最长可保存三周，之后在自动化显微镜下进行成像。

未感染的孔中未显示任何痘苗病毒蛋白的染色，而具有代表性的感染孔中含有细胞。通过免疫荧光显微镜检测，可见痘苗病毒表达的β-GCSE蛋白呈染色阳性。自动化图像分析软件根据用户设定的参数，对每张图像中的感染情况进行定量分析。

在代表性图像中，根据染色信号相对于局部背景的大小和强度，对细胞核总数以及表达病毒抗原的细胞数量进行计数。对 thread 基因的敲低作为靶基因有效 RNAi 耗竭的阳性对照。该抗凋亡因子的敲低会导致显著的细胞死亡。

荧光素酶的敲低作为双链RNA处理对感染影响的阴性对照。与未处理细胞相比，荧光素酶的耗竭对感染无影响。β-半乳糖苷酶蛋白的敲低作为感染减少的阳性对照。

由于该检测方法以β-半乳糖蛋白水平作为感染的读数，β-半乳糖蛋白的耗竭会导致感染细胞百分比下降。细胞因子RAB5的敲低也会导致感染细胞百分比下降。由于已知RAB5参与内吞作用，该因子可能在痘苗病毒进入过程中发挥作用。

观看本视频后，您应充分了解如何利用果蝇中的RNAi筛选来鉴定参与病毒感染的宿主因子，包括实施RNAi、接种痘苗病毒、染色成像以及对384孔板进行分析。请务必注意，操作活病毒具有极高危险性，进行该实验时必须采取防护措施，例如穿戴实验服和护目镜。活病毒只能在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中打开，任何接触过活病毒的物品在丢弃前均须用10%次氯酸钠溶液灭菌处理。