Name: 在单个细胞中的线粒体DNA复制的可视化EDU信号放大 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-15T17:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学习利用EdU掺入和酪胺信号放大技术可视化培养神经元中线粒体DNA复制的方法。该技术可揭示神经元亚细胞区室中的mtDNA生物合成动态，为研究神经退行性疾病提供新工具。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金项目 NS-38849 和 DK-076160、青少年糖尿病研究基金会糖尿病并发症研究中心、神经病学研究与发现项目以及密歇根大学 A. Alfred Taubman 医学研究所的资助。本研究使用了密歇根糖尿病研究与培训中心的形态学与图像分析核心设施，该设施由美国国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所资助，基金编号为 5P60 DK-20572。作者感谢分子探针/英杰公司（Molecular Probes/Invitrogen）的 Scott T. Clarke 在多种 Click-iT EdU 标记试剂盒方面提供的宝贵建议，以及为支持 EdU 扩增技术的初步开发而慷慨捐赠的试剂。

1. 神经元的制备
<ol>
 <li>将背根神经节（DRG）神经元接种于无菌（经高压灭菌）的12 mm玻璃盖玻片上，置于24孔培养板中进行培养。</li>
 <li>通常将EdU储备液（10 mM，溶于DMSO，Click-iT EdU微孔板检测试剂盒）用培养基稀释1:100，配制成10X EdU溶液（100 μM），再将该10X溶液按1:10比例加入培养孔中（例如，将30 μL 10X EdU溶液加入终体积为300 μL的培养基中）。DRG神经元在37°C、5% CO2条件下，以终浓度10 μM EdU孵育2–24小时，具体孵育时间取决于处理因素对线粒体DNA合成速率的影响。</li>
 <li>在通风橱中，室温下以2%多聚甲醛固定DRG神经元10–15分钟，随后用1X PBS洗涤两次，每次2–5分钟，之后将样品置于新鲜的1X PBS中，于4°C保存，可保存长达1个月。</li>
 <li>用精细镊子将盖玻片转移至预设的湿盒中（Corning BioAssay培养皿，底部衬黑纸以增强对比度，外包铝箔以保护光敏组分，并用吸水纸浸湿以维持湿度），并将其放置在Parafilm M膜片上，该疏水表面可限制溶液仅覆盖盖玻片区域。以下方案适用于28个盖玻片，所有溶液按32个盖玻片用量配制（约多出14%体积）。对于含昂贵或有限组分的溶液，每张盖玻片使用75–80 μL；其余洗涤和封闭溶液则每张使用200–300 μL，以确保彻底清除前一步残留溶液。</li>
 <li>重新加入1X PBS覆盖每张盖玻片表面（200–300 μL）。按照下述说明及厂商操作手册，准备Click-iT检测和酪胺信号放大试剂盒。</li>
</ol>
Click-iT EdU 微孔板检测试剂盒的制备
Click-iT EdU 微孔板检测试剂盒中的大多数组分均为预配制，储存于 4°C [2x Click-iT 反应缓冲液（10x 组分 E）、CuSO4（100 mM，组分 F）、Click-iT EdU 固定剂（组分 D）和封闭缓冲液（2x 组分 H）]。Click-iT EdU 缓冲液添加剂（10x 组分 G）需储存于 -20°C，以防止其随时间推移变为黄褐色。该组分可耐受多次冻融循环。
应将俄勒冈绿 488 叠氮化物（组分 B）分装成小份（10–20 μL），以尽量减少冻融循环，并在 -20°C 下保存。
配制抗俄勒冈绿HRP结合物（组分I）的储备液时，向小瓶中加入75 μL的Milli Q dH2O。通过轻柔吹打或倒置混匀，避免产生泡沫，并于4°C保存。切勿涡旋振荡。
TSA试剂盒#12的配制，含HRP标记的 Goat Anti-Rabbit IgG 和Alexa Fluor 488酪胺试剂
配制酪胺储备液时，将固体材料（Alexa Fluor 488 酪胺，组分 A）溶于 150 μL DMSO（组分 B）中。反复倒置小瓶数次，以溶解附着在瓶壁上的酪胺。将储备液分装成小份（10–20 μL），于 ≤-20°C 干燥避光保存。
2. Click-iT 5-乙炔基-2-脱氧尿苷 (EdU) 标记
注意：所有溶液均使用带有200 μL吸头的橡胶头移液器轻轻吸除，以避免损失细胞。切勿使用真空管线，因其通常会过于剧烈地移除溶液。使用橡胶头移液器将200–300 μL洗涤液轻柔地覆盖在盖玻片上，以彻底清洗前一步的溶液。
<ol>
 <li>在室温下，于加盖的湿盒中，使用含0.1% Triton-X-100的1× PBS溶液对细胞进行10分钟的透化处理。使用1% Triton-X-100储备液。
 <ul>
 <li>通过将300 μL 1% Triton-X-100储备液加入2700 μL 1× PBS中，配制3000 μL的0.1% Triton-X-100溶液。</li>
 <li>每张盖玻片使用75–80 μL。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>移除Triton X-100溶液，并用1× PBS洗涤两次。</li>
 <li>在室温下，使用含1% H2O2的1× PBS溶液孵育30分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。用1× PBS稀释30% H2O2溶液。该溶液应新鲜配制，但可在上述第3.1步的10分钟透化期间配制。
 <ul>
 <li>通过将100 μL 30% H2O2加入2900 μL 1× PBS中，配制3000 μL的1% H2O2溶液。</li>
 <li>每张盖玻片使用75–80 μL。</li>
 <li>移除过氧化物酶处理液，并用1× PBS洗涤两次。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Click-iT EdU反应
 <ul>
 <li>对于32张盖玻片（32 × 80 μL = 2560 μL），共需2560 μL反应液。2×反应液配制量为1280 μL，即总反应体积的一半。</li>
 <li>在开始后续5分钟固定步骤（见下文第3.5步）之前，新鲜配制Click-iT反应混合液。</li>
 <li>通过移液器反复吹打混匀反应液。配制时切勿涡旋震荡。 
 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td>2×反应混合液 
 组分来自Click-iT EdU微孔板检测试剂盒</td>
 <td>半体积：1280 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Milli Q dH2O</td>
 <td> 1132.8 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2× Click-iT反应缓冲液（10×组分E）</td>
 <td> 100.3 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Click-iT EdU缓冲液添加剂（10×组分G）</td>
 <td> 25.6 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CuSO4（100 mM，组分F）</td>
 <td> 25.6 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oregon Green叠氮化物（组分A）</td>
 <td> 6.4 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总计</td>
 <td>1290.7 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
 注：上述所用体积与Click-iT EdU微孔板检测试剂盒说明书中的推荐体积成比例。最终反应混合液体积略大于1280 μL。</li>
 <li>在使用前，将2× Click-iT反应液与等体积的Click-iT EdU固定液（组分D）混合稀释。混合后可确保所有盖玻片获得均一的反应溶液。</li>
 <li>将1290.7 μL Click-iT EdU固定液（组分D）加入1290.7 μL反应混合液中。每张盖玻片使用75–80 μL。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>用Click-iT EdU固定液（组分D）对神经元进行5分钟的后固定，室温孵育。</li>
 <li>移除固定液，加入上述步骤3.4配制的反应混合液。避光覆盖后，室温孵育25分钟。轻柔移除反应混合液，用稀释后的1×封闭缓冲液（2×组分H）洗涤两次。
 <ul>
 <li>将2600 μL封闭缓冲液（2×组分H）与等体积的MilliQ dH2O（2600 μL）混合，配制5200 μL的1×封闭缓冲液。每张盖玻片使用75–80 μL。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>在落射荧光显微镜下，观察有丝分裂活跃的对照细胞核中Oregon Green的染色情况。</li>
</ol>
3. EdU 信号的酪胺信号放大（TSA）
<ol>
 <li>向每个盖玻片中加入 1% TSA 封闭液，并在室温下孵育 30 分钟。
 <ul>
 <li>通过称取 0.06 g TSA Blocking Reagent（TSA 试剂盒 #12，组分 D）并将其加入 6000 μL 1× PBS 中，配制 6000 μL 的 1% TSA 封闭液。涡旋混匀。在 1% TSA 封闭液中添加 5% 小牛血清通常有助于减少非特异性结合。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>短暂离心抗俄勒冈绿-辣根过氧化物酶偶联抗体原液（Click-iT EdU 微孔板检测试剂盒组分 I），该抗体需在 TSA 前 2–24 小时配制完成。将一抗用 1% TSA 封闭液按 1:300 稀释，轻轻颠倒或移液器吹打混匀。切勿涡旋，以免破坏 HRP 偶联抗体。吸除 1% TSA 封闭液，向每个盖玻片中加入 75 μL 抗体稀释液，4°C 过夜孵育。
 <ul>
 <li>该抗体可使用更高浓度，例如 1:150，但因其供应量有限，应节约使用。同样，在 1% TSA 封闭液中添加 5% 小牛血清通常有助于减少抗俄勒冈绿-辣根过氧化物酶偶联抗体的非特异性结合。</li>
 <li>通过将 8.53 μL 的兔抗俄勒冈绿-HRP 原液（Click-iT EdU 微孔板检测试剂盒）加入 2560 μL 1% TSA 封闭液中，配制 2560 μL 的 1:300 抗体稀释液。通过轻柔移液或颠倒混匀。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>次日，吸除抗体溶液，并用 1× PBS 洗涤三次。将盖玻片在最后一次洗涤液中继续孵育 30–60 分钟，室温下以确保未结合的一抗被彻底清除。</li>
 <li>配制 2560 μL 的酪胺反应液（适用于 32 个盖玻片 × 80 μL）。
 <ul>
 <li>通过将 2 μL 的 30% H2O2（TSA 试剂盒 #12，组分 F）加入 398 μL 放大缓冲液（TSA 试剂盒 #12，组分 E）中，配制 400 μL 的 0.15% H2O2 溶液（100×）。该溶液应在使用前立即配制。</li>
 <li>配制最终体积为 2560 μL 的反应液，包含以下组分：
 <ul>
 <li>25.6 μL 酪胺-488（TSA 试剂盒组分 A）</li>
 <li>2508.8 μL 放大缓冲液（TSA 试剂盒组分 E）</li>
 <li>25.6 μL 0.15% H2O2（来自上一步，最终浓度为 0.0015% H2O2）</li>
 <li>吸除 1× PBS，加入酪胺反应液，室温孵育 15 分钟。</li>
 </ul>
 </li>
 </ul>
 </li>
 <li>吸除酪胺反应液，用 1× PBS 洗涤三次，最后一次洗涤中继续孵育 30–60 分钟，室温下，方法同前。</li>
 <li>在落射荧光显微镜下检查线粒体 DNA 标记情况。
 <ul>
 <li>使用抗荧光淬灭封片剂（如含 DAPI 的 ProLong Gold）将盖玻片封固于载玻片上。或者，EdU 标记与放大反应后可继续进行标准的荧光免疫细胞化学染色，以标记其他细胞标志物。</li>
 </ul>
 </li>
</ol>
4. 代表性结果：线粒体DNA复制的可视化作为线粒体生物发生的标志
我们关注感觉神经元（图1）如何调控线粒体的数量。本方案将使用荧光标记物标记新合成的线粒体DNA（mtDNA），以此作为检测新生线粒体的方法。通过掺入合成核苷酸EdU，随后进行Oregon Green-叠氮化物的点击化学反应，并利用Alexa Fluor 488酪胺进行信号放大，最终实现对mtDNA的绿色荧光标记（图2）。若操作正确，放大后的绿色荧光信号将显著高于背景荧光（如细胞自发荧光或HRP-TSA反应的副产物）。
该技术旨在标记新复制的线粒体DNA（mtDNA），以在神经元的亚细胞区室中可视化并定量分析mtDNA的生物合成过程（图3）。EdU标记可用于后续的荧光免疫细胞化学染色，以标记其他细胞标志物，例如神经丝蛋白（图3D）。
TSA 反应也可使用其他荧光 Alexa Fluor 酪胺，例如 Alexa Fluor 594-酪胺。这会导致细胞核中 Oregon Green-叠氮化物点击反应产生绿色荧光信号，但线粒体 DNA（mtDNA）中无绿色信号，因为在 TSA 之前无法检测到该信号。使用 Alexa Fluor 594-酪胺进行扩增可增强细胞核标记，并以红色荧光信号显示掺入 mtDNA 的 EdU（图 4）。类似的扩增程序可用于可视化 BrdU 掺入新合成的 mtDNA（图 5），但该方法需要额外步骤，通过强酸（HCl）或酶消化来恢复 BrdU 抗原表位，而 EdU 标记则无需此步骤。
<img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="胚胎期与成年期DRG细胞、显微镜图像、结构与发育阶段比较" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 用于分析的典型胚胎期（左）和成年期（右）背根神经节（DRG）神经元的代表性微分干涉差（DIC）图像。 标尺 = 10 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="EdU标记示意图；DNA合成检测；神经母细胞瘤细胞；荧光显微镜结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
 图2. 使用绿色荧光信号标记线粒体DNA中EdU的流程示意图。 该示意图展示了使用绿色荧光信号标记线粒体DNA中EdU的三步操作流程。有丝分裂活跃的F11神经母细胞瘤细胞作为阳性对照，显示了EdU在核DNA和线粒体DNA中的掺入标记模式。第一步（P1）是通过在EdU存在下孵育细胞，将胸苷类似物掺入新合成的线粒体DNA中。第二步（P2）基于点击化学反应，使用Oregon Green-叠氮化物标记已掺入的EdU。在复制了核DNA的细胞核中可观察到绿色荧光信号。最后一步（P3）是通过加入HRP偶联的兔抗Oregon Green抗体孵育，随后在过氧化氢（H2O2）存在下与Alexa Fluor 488标记的酪胺进行孵育，从而扩增Oregon Green-叠氮化物的荧光信号，以实现线粒体DNA中绿色信号的可视化。
<img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="通过EdU-OG-TSA荧光显微镜分析的胚胎期和成年期背根神经节细胞，显示神经结构。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
 图3. 背根神经节（DRG）神经元中线粒体DNA的EdU标记。 神经元经EdU孵育后，通过信号放大显示掺入EdU的线粒体DNA。代表性荧光图像叠加于透射光图像上，显示在胚胎期（A）和成年期（B-D）DRG神经元新合成的线粒体DNA中，经放大后呈绿色点状信号（EdU-OG-TSA，绿色）。EdU标记步骤完成后可进一步进行神经元标志物（如神经丝蛋白，D图中αNF，红色）的免疫荧光染色。比例尺 = 10 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="使用 Click-iT EdU 进行 DNA 标记的过程；图示荧光酪胺衍生物及细胞结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
 图 4. 标记 mtDNA 中 EdU 并产生红色荧光信号的程序示意图。 该示意图展示了在 mtDNA 中通过红色荧光信号标记 EdU 的三步法流程。有丝分裂活跃的 F11 神经母细胞瘤细胞作为阳性对照，用于展示 EdU 在核 DNA 和线粒体 DNA 中掺入后的标记模式。第一步（P1）是通过在 EdU 存在下孵育细胞，将胸苷类似物掺入新合成的 mtDNA 中。第二步（P2）基于“点击化学”反应，使用 Oregon Green-叠氮化物对已掺入的 EdU 进行标记。在复制了核 DNA 的细胞中，可在细胞核内观察到绿色信号。最后一步（P3）是通过加入与 HRP 偶联的兔抗 Oregon Green 抗体，随后在过氧化氢（H2O2）存在下加入 Alexa Fluor 594 标记的酪胺，从而对 Oregon Green-叠氮化物信号进行放大，以在 mtDNA 中可视化红色信号。
<img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="酪胺信号放大示意图；HRP 标记的山羊抗小鼠抗体，mtDNA 中 BrdU 的检测，荧光。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
 图 5. BrdU 标记及通过绿色或红色荧光信号对 mtDNA 进行酪胺信号放大。 示意图展示了利用绿色或红色荧光信号标记新合成 mtDNA 中 BrdU 的操作流程。首先需通过酸（HCl）或酶消化法恢复 BrdU 表位，而 EdU 标记则无需此步骤。接下来，孵育小鼠抗 BrdU 一抗。随后，孵育辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠抗体。最后，在过氧化氢（H2O2）存在下，使用带有绿色或红色荧光标记的酪胺对信号进行放大，以实现 mtDNA 中信号的可视化。

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</ol>

无利益冲突声明。

我们开发了一种灵敏的检测方法，利用EdU的酪酰胺信号放大技术对单个细胞中新合成的线粒体DNA进行标记。在优化本方案的过程中，最大的问题之一是不同盖玻片之间的结果不一致。我们对Invitrogen试剂盒的操作流程进行了修改，避免在单个盖玻片上混合小体积溶液，改为配制统一的母液供所有盖玻片使用。每个12 mm圆形玻璃盖玻片使用75–80 μL的溶液，该体积既能完全覆盖盖玻片表面，又能确保样品间结果的一致性。孵育时间和试剂浓度已进行了优化，但进一步调整可能带来性能提升。
该方案设计为每个步骤仅运行一次。然而，对于首次尝试后失败的样本，部分步骤已使用新的溶液重复进行以回收样本。特别是EdU点击反应步骤（3.4-3.6）可重复进行，且不会显著增加背景荧光。抗俄勒冈绿-HRP抗体孵育步骤（4.1-4.3）和酪胺信号放大步骤（4.4-4.5）也可重复，但往往因背景荧光增强而导致信噪比较差。
最敏感的试剂是 Click-iT EdU 微孔板检测试剂盒中的 Click-iT EdU 缓冲液添加剂（组分 G）和兔抗俄勒冈绿-HRP 抗体（组分 I）。当 Click-iT EdU 缓冲液添加剂在 4°C 下储存时，会随着时间推移逐渐变黄，存放 6 至 12 个月后颜色明显加深。将 Click-iT EdU 缓冲液添加剂储存在 -20°C 可缓解这一问题。兔抗俄勒冈绿-HRP 抗体在使用 MilliQ dH2O 重悬后的 4 至 6 个月内使用，其标记和酪胺信号放大步骤效果最佳。
EdU对线粒体DNA（mtDNA）的温和标记允许与其它细胞标志物进行直接比较9-11，并提升了该技术相较于其他胸苷类似物（如5-溴-2-脱氧尿苷，BrdU）的优势；后者需要经过剧烈处理才能暴露其在DNA中的抗原表位。我们实验室11-12及其他研究团队13-15已成功使用BrdU标记mtDNA。BrdU标记技术与EdU类似，但存在一些重要差异（图5）。在完成上述透化步骤（3.1–3.2）后，需通过变性步骤恢复BrdU抗原表位（使用2 N HCl在37°C处理30分钟，随后用1× PBS洗涤三次）。然后使用抗BrdU的一抗进行标记（Vector Laboratories产品，用TSA试剂盒中的1%封闭液按1:50稀释，4°C孵育过夜）。在进行TSA步骤（上述4.3–4.5）之前，还需进行二抗孵育以放大BrdU信号（使用TSA试剂盒#2和#5中的HRP标记山羊抗小鼠IgG，用1%封闭液按1:100稀释，在室温孵育45分钟）。拥有EdU和BrdU两种胸苷类似物可用于mtDNA标记，有利于开展双重标记实验，可在脉冲标记范式中对mtDNA进行连续标记11。
本实验室利用 EdU 和 BrdU 标记线粒体 DNA（mtDNA），研究糖尿病性神经病变（糖尿病常见并发症）背景下线粒体生物合成的调控机制。我们已成功应用信号放大技术，在单个神经元中检测 mtDNA 生物合成的变化11-12。该技术还可用于探索 mtDNA 复制与转换机制的相关实验，或用于筛选抑制 mtDNA 合成的药物。此外，EdU 与 BrdU 信号放大的基本原理也可应用于其他涉及 DNA 复制或修复的研究。

<table><tbody><tr><td>12 mm 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>245 mm × 245 mm 生物检测培养皿</td><td>Corning</td><td>431111</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 10X 溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢，30% 水溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU 微孔板检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>C10214</td><td></td></tr><tr><td>TSA 试剂盒 #12，含 HRP&amp;#8212;山羊抗兔 IgG 和 Alexa Fluor 488 酪胺</td><td>Invitrogen</td><td>T20922</td><td></td></tr><tr><td>TSA 试剂盒 #15，含 HRP&amp;#8211;山羊抗兔 IgG 和 Alexa Fluor 594 酪胺</td><td>Invitrogen</td><td>T20925</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆神经丝蛋白抗体</td><td>Chemicon International</td><td>AB1981</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 BrdU 抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-B209</td><td></td></tr><tr><td>TSA 试剂盒 #2，含 HRP&amp;#8212;山羊抗小鼠 IgG 和 Alexa Fluor 488 酪胺</td><td>Invitrogen</td><td>T20912</td><td></td></tr><tr><td>TSA 试剂盒 #5，含 HRP&amp;#8212;山羊抗小鼠 IgG 和 Alexa Fluor 594 酪胺</td><td>Invitrogen</td><td>T20915</td><td></td></tr></tbody></table>

通过edu信号扩增在单个细胞中可视化线粒体dna复制

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

线粒体是细胞能量的关键调节因子，而线粒体生物发生是健康细胞中调控线粒体数量的重要组成部分1-3监测线粒体生物发生的一种方法是测量线粒体DNA（mtDNA）的复制速率。4我们开发了一种灵敏的技术，用于标记单个细胞中新合成的线粒体DNA（mtDNA），以研究mt游戏副本生成。该技术结合了5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）的掺入5-7 使用酪酰胺信号放大（TSA）8 在神经元亚细胞区室中可视化线粒体DNA复制的方案。EdU优于其他胸苷类似物（如5-溴-2-脱氧尿苷，BrdU），因为标记EdU所需的初始点击反应5-7 无需使用暴露BrdU表位所需的强烈酸处理或酶消化步骤。EdU的标记条件更为温和，可实现其掺入情况与其他细胞标志物的直接比较9-10可视化和定量线粒体DNA（mtDNA）生物合成的能力为研究调控线粒体生物发生的机制提供了重要工具，并有助于深入理解与药物毒性、衰老、癌症及神经退行性疾病相关的发病机制。本技术适用于感觉神经元及其他多种细胞类型。利用该技术测量mtDNA生物合成，对于进一步阐明正常细胞生理功能以及疾病状态下功能障碍的机制具有重要意义。

我们开发了一种灵敏的技术，用于标记单个细胞中新合成的线粒体DNA（mtDNA），以研究mtDNA的生物合成。该技术结合了EdU的掺入与酪胺信号放大（TSA）方法，可在神经元的亚细胞区域中可视化mtDNA的复制过程。

通过EdU信号扩增在单个细胞中可视化线粒体DNA复制

线粒体是细胞能量的关键调节因子，而线粒体生物发生是健康细胞中调控线粒体数量的重要组成部分。

本实验的总体目标是对培养神经元中的线粒体DNA（M-T-D-N-A）复制进行标记和可视化观察。首先将神经元与胸腺嘧啶类似物EDU共同孵育2至24小时；第二步是通过铜催化的共价反应，利用荧光染料Alexa Fluor 488叠氮化物对掺入的含炔基EDU进行标记。该实验步骤的最后一步是通过芳酰胺信号放大步骤来扩增俄戈绿信号，以便可视化新合成的线粒体 DNA 中掺入的 EDU。最终，通过点击化学 EDU 标记与后续的撕膜信号放大相结合，可以获得显示神经元特定亚细胞区域中线粒体 DNA 复制的结果。该技术相较于现有方法（如 BRDU 标记）的主要优势在于，EDU 标记操作更简便、条件更温和，因而允许对神经元标志物进行额外的免疫荧光染色。该方法可以解答线粒体数量调控中的关键问题，例如神经元如何满足其亚细胞区室（包括胞体、轴突、树突和突触终末）中变化的能量需求。因此，该方法有助于揭示多种线粒体相关神经系统疾病（如神经病和神经退行性病变）发病机制的潜在机理。但更重要的是，该方法还可应用于其他线粒体DNA拷贝数变化可能介导疾病状态发生的系统，包括药物毒性、癌症和衰老。本视频将演示如何对生长在无菌12毫米玻璃盖玻片上的背根神经节神经元中新合成的线粒体DNA（缩写为mtDNA）进行标记。在24孔培养板中，将Click-iT EdU微孔板检测试剂盒中的10毫摩尔储备液5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（缩写为EdU）用培养基按1:100稀释，配制成10× EdU储备液。随后将10× EdU储备液直接加入各孔培养基中，将处理后的神经元置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育2至24小时。在室温下用 2% 多聚甲醛固定神经元 10 至 15 分钟。用 1× PBS 洗涤两次，每次洗涤 2 至 5 分钟。固定后的神经元可在新鲜的 1× PBS 中于 4 摄氏度保存长达一个月。按照随附文本所述准备一个湿盒。使用尖头镊子将28个固定的盖玻片（包括EDU阳性和阴性对照）转移至湿盒内多聚甲醛疏水片上。重新加入200至300微升的1×PBS，以覆盖每个盖玻片的表面。按照文中所述及试剂盒制造商的说明书准备 Click-It 检测试剂盒，用于标记线粒体 DNA。向每个盖玻片中加入 75 至 80 微升含有 0.1% Triton X 的 1× PBS 通透溶液，覆盖盖玻片并室温孵育 10 分钟。使用带有 200 微升吸头的移液球连接末端，轻柔地移除液体，避免细胞丢失。使用移液管轻轻将盖玻片淹没。加入 200 至 300 微升的 1×PBS，彻底洗去之前的溶液。每张盖玻片清洗两次。在每张盖玻片上的一倍磷酸盐缓冲液（XPBS）中加入75至80微升新鲜的1%过氧化氢。室温下避光孵育30分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。用一倍磷酸盐缓冲液（XPBS）冲洗两次，方法同前。随后，按照随文所述步骤新鲜配制点击反应混合液。上下吹打混匀。每张盖玻片加入75至80微升Click-iT EDU固定剂，对神经元进行后固定，室温孵育5分钟。在后固定孵育期间，用等体积的Click-iT EDU固定剂稀释反应混合液。将反应混合液加入每个盖玻片上，避光，室温孵育25分钟。在落射荧光显微镜下，用稀释的一倍封闭缓冲液轻轻洗涤反应混合液两次。当EDU染色完成后，在细胞核中检查异硫氰酸荧光素（orgon green）染色情况。开始进行原位杂交信号放大（TSA），向每个盖玻片加入1% TSA封闭液，在室温下孵育30分钟。将预先在2至24小时前配制的抗绿色辣根过氧化物酶偶联抗体原液短暂离心，用TSA封闭液按1:300稀释一抗，通过翻转或移液器吹打混匀，避免涡旋震荡。向每个盖玻片加入75 µL稀释后的抗体溶液，在4°C条件下孵育过夜。第二天，在室温下用一倍浓度的 XPBS 洗涤三次。将盖玻片在最后一次洗涤中继续孵育额外的 30 至 60 分钟，以确保去除未结合的一抗。在使用前，立即根据本方案的文字部分配制 IDE 反应体系。将盖玻片在室温下与IDE反应液孵育15分钟。用1×PBS洗涤三次，最后一次洗涤孵育30至60分钟，操作同前，在显微镜下观察。检查MT DNA标记情况，使用含DPI的ANTIFA封片剂将成功染色的神经元封固于玻片上。此处显示的是胚胎期和成年背根神经节神经元的代表性微分干涉相差图像，这些图像通常用于分析。这些示意图展示了使用绿色荧光信号标记 MTD NA 中 EDU 的操作流程。有丝分裂活跃的 F 11 神经母细胞瘤细胞作为阳性对照，展示了 EDU 在细胞核 DNA 和线粒体 DNA 中掺入后的标记模式，这些代表性荧光图像与明场图像叠加显示。绿色的点状信号显示了被扩增的 EDU 信号，该信号已掺入到胚胎期和成年期背根神经节神经元新合成的 M-D-D-N-A 中。EDU标记步骤可随后用于对神经丝蛋白等神经元标志物进行红色免疫荧光染色。这些示意图展示了使用红色荧光信号标记EDU和线粒体DNA（MTD NA）的操作流程。有丝分裂活跃的F 11神经母细胞瘤细胞作为阳性对照，显示了EDU掺入细胞核DNA和线粒体DNA后的标记模式。该示意图展示了使用绿色或红色荧光信号对新合成的线粒体DNA（M-T-D-N-A）进行BrdU标记的操作流程。在进行该实验时，重要的是需使用有丝分裂活跃的细胞设置对照，以在进入扩增步骤以可视化线粒体DNA标记之前，确认EdU标记及细胞核染色的成功。在完成该流程后，还可进一步开展其他实验方法，例如标准免疫荧光染色，以探究线粒体DNA合成在特定神经元亚群或神经元特定区室中的调控机制。由于该技术的发展，神经生物学领域的研究人员将能够借助正常生理状态的培养模型以及模拟疾病损伤的培养模型，深入探索线粒体数量的调控机制。神经系统状态。

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