Name: 评价以下电离辐射的空间分布的γH2AX (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学习利用免疫荧光和共聚焦显微镜技术检测γH2AX焦点，分析电离辐射诱导的DNA双链断裂在细胞核内的空间分布特征。该方法结合组蛋白H3K4甲基化标记，为辐射生物学研究提供三维可视化手段。

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感谢澳大利亚核科学与工程研究所的支持。TCK 获得了 AINSE 奖项资助。表观基因组医学实验室由澳大利亚国家健康与医学研究委员会（566559）资助。本研究由生物医学成像开发有限公司合作研究中心（CRC）资助，该中心根据澳大利亚政府合作研究中心（CRC）计划建立并获得支持。LM 获得了墨尔本研究奖学金（墨尔本大学）以及生物医学成像 CRC 补充奖学金的支持。莫纳什显微成像中心（Stephen Cody 博士和 Iśka Carmichael 博士）对本研究提供了 invaluable 的支持。

细胞准备
<ol>
<li>	人红白血病 K562 细胞在添加了 10% (v/v) 胎牛血清和 20 mg/ml 庆大霉素的 RPMI-1640 培养基中，于 37°C、含 5% CO2 的湿润环境中培养。</li>
<li>	在染色前约 18 小时，将处于对数生长期的细胞（最佳密度为 5 × 105 个细胞/ml）用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，重悬于新鲜培养基中，并放回 37°C、5% CO2 环境中。</li>
<li>	用 PBS 以约 1500 rpm 离心 5 分钟洗涤细胞两次，并重悬于新鲜培养基中。</li>
<li>	计数细胞，并将细胞密度调整至约 5 × 105 个细胞/ml。</li>
</ol>
可通过自动化方法（例如使用孔径为5至20微米的Sysmex或Coulter计数仪）或使用台盼蓝排染法结合血细胞计数板进行细胞计数。 
过量的细胞（&gt;800 个细胞/cm²2可能导致染色不均。

照射与免疫荧光染色
<ol>
<li>	组装细胞离心涂片夹、滤纸卡和载玻片，并进行适当的标记。</li>
</ol>
组装细胞离心装置时，应确保滤纸卡上的孔与漏斗对齐。
<ol start="2">
<li>将细胞暴露于γ射线或X射线照射下（本示例中为2 Gy）。</li>
</ol>
为防止照射过程中形成焦点，在照射前和照射期间将细胞置于冰上 5 到 10 分钟。
照射后，将细胞在37°C、5% CO2条件下孵育所需时间（γH2AX水平峰值通常在30分钟至1小时之间；本示例中为1小时）。
<ol start="3">
<li>	用预冷的PBS洗涤细胞两次，离心后重悬于新鲜PBS中。</li>
<li>	取100至150 μL细胞悬液加入每个细胞离心涂片装置的漏斗中，以500 rpm离心5分钟。</li>
<li>	将载玻片从细胞离心涂片装置中取出，让细胞在空气中适度干燥约15分钟。</li>
</ol>
切勿让细胞完全干燥，以免细胞形态发生解体。
<ol start="6">
<li>用疏水性笔在细胞周围画一个圆圈。</li>
<li>在室温（RT）下用4%多聚甲醛固定细胞5分钟。</li>
</ol>
根据我们的经验，使用多聚甲醛固定优于使用乙醇或甲醇固定。悬浮细胞在室温下固定5分钟即可，而贴壁细胞则需要更长的固定时间（15至20分钟）才能达到最佳固定效果。
我们发现，染色后立即观察比将固定后的切片在-20°C下保存效果更好，后者通常会导致较高的背景荧光。
<ol start="8">
<li>	用 PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。</li>
<li>	用 0.1% Triton-X 100 在室温下对细胞进行通透处理，持续 5 分钟。</li>
</ol>
与Tween-80相比，我们通常在使用Triton-X 100进行细胞通透处理的细胞中观察到更好的信号。根据细胞类型的不同，可能需要调整通透处理的时间。例如，在K562细胞中，室温下通透5分钟已足够，而在贴壁细胞中则需要15分钟的通透处理。
<ol start="10">
<li>	用 PBS 清洗细胞三次，每次 5 分钟。</li>
<li>	在室温下用 1% BSA 封闭细胞 30 分钟（每次 10 分钟，共 3 次）。</li>
</ol>
我们比较了使用血清（来源于与二抗相同的物种）和PBS中的牛血清白蛋白进行封闭的效果。与血清相比，BSA在减少二抗的非特异性结合方面更为有效。我们还比较了不同的封闭时间，包括在4°C过夜封闭，以及在室温下分别进行3次10分钟和3次20分钟的封闭步骤，结果确定室温下3次10分钟的封闭为最佳方案。
<ol start="12">
<li>向每张切片加入 50 μL 一抗（用 1% BSA 按 1:500 稀释）。</li>
</ol>
室温下与一抗孵育60分钟，与4°C过夜孵育相比，可降低背景染色。
<ol start="13">
<li>	要同时染色不同的标记物，请使用来自不同物种的抗体（例如，本实验中使用小鼠抗-γH2AX和兔抗-甲基化H3K4）。</li>
<li>	在室温下，于摇床上以250 rpm孵育一抗90分钟。</li>
</ol>
所有孵育步骤均在加湿的染色槽中进行。
<ol start="15">
<li>	用 PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。</li>
<li>	向每张玻片加入 50 μL（用 1% BSA 按 1:1000 稀释）的二抗。</li>
</ol>
在同一张切片上对不同标记物进行染色时，应使用针对不同物种（根据一抗来源）且具有不同荧光发射波长的二抗（例如，本实验中使用抗小鼠Alexa 488（绿色）和抗兔Alexa-546（红色））。
<ol start="17">
<li>	将细胞在室温下于250 rpm的摇床上孵育60分钟。</li>
</ol>
建议将细胞置于避光湿润的孵育盒中孵育，以避免二抗褪色和干燥。
<ol start="18">
<li>	用 PBS 清洗细胞，每次 5 分钟，共清洗三次。</li>
<li>	向每张载玻片上加入 50 μL TOPRO-3（用 PBS 按 1:500 稀释）。</li>
<li>	用 PBS 清洗载玻片，每次 5 分钟，共清洗三次。</li>
<li>	去除载玻片上多余的液体，然后加入抗荧光淬灭剂。</li>
</ol>
建议在加入抗荧光淬灭剂溶液之前，不要将细胞完全干燥。
<ol start="22">
<li> 盖上盖玻片，用指甲油封片，于室温避光处静置过夜。</li>
</ol>
建议使用共聚焦显微镜专用的1.5号盖玻片（厚度为0.16–0.19微米）和透明指甲油。
放置盖玻片时应小心操作，避免产生气泡。

图像采集
<ol>
<li>	使用蔡司 LSM510 Meta 共聚焦显微镜，通过标准的 GFP（绿色，488 nm）、PI（红色，543 nm）和远红（蓝色，633 nm）激光获取图像。</li>
</ol>
使用共聚焦显微镜获取的图像展现出更优的空间分辨率。
由于γH2AX焦点的尺寸可能小于 0.5 μicrons，建议至少以以下参数获取图像 0.5 μicroZ轴方向的步进尺寸。
与更高或更低放大倍数的物镜相比，优先选用63倍油镜物镜。 
对于大量细胞的焦点计数成像，建议使用扫描速度为8、图像尺寸为1024 × 1024像素的设置。为了清晰展示不同核蛋白之间的空间关系，推荐使用扫描速度为6、图像尺寸为2048 × 2048像素的设置。
进行多通道成像时，建议采用线扫描采集模式，而非帧扫描。该方法可避免荧光淬灭，并获得更高的分辨率。采用逐通道扫描以防止通道间的信号串扰。

焦点计数
可以使用多种软件包进行图像分析和焦点计数（包括 Metamorph、Image-J 和 Imaris）。此处描述的是使用 Metamorph 进行焦点计数的步骤。
<ol>
<li>	直接通过文件菜单打开 γH2AX 图像堆栈，或使用构建编号堆栈选项打开。</li>
<li>	转到“处理”菜单并选择“堆栈运算”。</li>
<li>	选择“最大投影”，并选择要包含的层面，然后点击确定。</li>
<li>	将生成的图像保存为 γH2AX Tiff 文件，并打开 TOPRO-3（蓝色）图像。</li>
<li>	转到“区域”并选择一个区域绘制工具，在细胞核周围绘制区域。</li>
<li>	点击 γH2AX Tiff 图像，转到“处理”菜单并选择“形态学滤波器”。</li>
<li>	选择“Top-Hat”，并将 γH2AX 图像选为源图像。</li>
<li>	应用 Top-Hat 滤波器，生成的图像将是一幅噪声较少、焦点强度变异降低的二值图像。</li>
</ol>
选择Top-Hat值时应谨慎。可通过在应用滤波器前后对图像进行视觉比较，以获得最佳参数值。
<ol start="9">
<li>	转到处理菜单并选择阈值图像。</li>
<li>	选择包含性阈值，并设定下限和上限阈值。</li>
</ol>
通常是阈值影响着焦点数量。因此，在选择阈值时必须格外谨慎。最佳方法是：对接受低于 2 Gy γ 辐照的细胞，使用不同的阈值进行焦点计数，然后将计数结果与人工计数（目测）结果进行比较。最优阈值应能最大限度地排除背景干扰，同时最大限度地包含真实的焦点。
<ol start="11">
<li>	选择 TOPRO-3 图像，进入区域菜单并选择“转移区域”选项。将源图像设为 TOPRO-3，目标图像设为 Top-Hat，然后点击确定。</li>
<li>	当核区域被转移至 Top-Hat 图像后，进入测量菜单并选择“整合形态学分析”。</li>
<li>	在弹出窗口中选择源图像为 Top-Hat，并按面积进行测量。</li>
<li>	选择“测量所有区域”，然后点击“测量”，以获取 Top-Hat 图像中所有对应细胞核内的焦点数量。</li>
<li>	可通过使用日志数据选项，将各区域的焦点数量导出至 MS-Excel 文件中。</li>
</ol>

图像的三维重建
使用 Metamorph 从图像序列创建三维图像：
<ol>
<li>	进入堆栈菜单并选择三维重建。</li>
<li>	选择旋转角度（例如 160°, 320°）。</li>
<li>	选择三维重建类型——最大值投影。</li>
<li>	选择旋转平面（水平或垂直）。</li>
<li>	选择 Z 轴校准距离。</li>
</ol>
建议使用用户指定的Z轴距离（最佳为0.5 μm）。
<ol start="6">
<li>	单击“确定”以创建三维重建。</li>
</ol>

线扫描分析
使用 Metamorph 进行线扫描分析：
<ol>
<li>	打开单平面图像或堆叠文件。</li>
<li>	进入测量工具栏命令，选择线扫描分析。</li>
<li>	在细胞上画一条线，系统将自动显示沿线每种标记物的荧光强度和距离。</li>
</ol>
为了阐明不同染色质标记物（例如，γH2AX 焦点与组蛋白甲基化）之间的空间关系，最好绘制穿过这些标记物富集区和贫乏区的线条。

代表性数据
本实验中，我们使用了针对γH2AX焦点以及H3K4me的抗体，以评估DNA双链断裂（DSB）在活跃转录的常染色质表观遗传标志物中的空间分布情况。如图1所示，在2 Gy照射后，γH2AX焦点主要形成于H3K4me染色和DNA染料TOPRO-3染色均较弱的区域（染色较强的DNA区域提示为异染色质）。
 <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="显示细胞蛋白分布、发射光谱和分析图的荧光显微镜图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. γH2AX灶点主要在常染色质中响应电离辐射而形成。（A）人红白血病K562细胞在γ射线照射（2 Gy）后1小时的γH2AX灶点（绿色）免疫荧光图像。γH2AX灶点与代表活跃转录的常染色质的H3K4me（红色）进行对比显示。DNA用TOPRO-3染色（蓝色）。合并图像（蓝色、红色和绿色）显示γH2AX灶点被排除在异染色质区域之外。线扫描分析（荧光强度与距离的关系）表明了各标记物在单一平面上的相对分布。（B）上述合并图像三维重建后在不同平面上的切片。

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Bonner, W. M. Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li>
<li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li>
<li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp, I. liakis, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li>
<li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li>
<li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

<table><tbody><tr><td>罗斯威尔公园纪念研究所-1640（RPMI-1640）</td><td>培养基</td><td>Invitrogen</td><td>22400071</td><td>RPMI-1640，pH 7.4 的培养基，添加 10%（v/v）胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、20&amp;#x03BC;g/ml 硫酸庆大霉素、20 mM HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N&amp;rsquo;-2-乙磺酸）</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>使用 1% BSA 封闭非特异性抗体结合位点。一抗和二抗均用 1% BSA 进行稀释。</td></tr><tr><td>PBS（不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>用于区分活细胞与死细胞。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>使用 0.1% Triton X-100 对细胞进行透化处理。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>使用 4% 多聚甲醛固定细胞。</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗磷酸化组蛋白-H2AX 抗体</td><td>一抗</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>一抗稀释比例为 1:500，溶于 1% BSA 中。</td></tr><tr><td>组蛋白 H3（单甲基化 K4）</td><td>一抗</td><td>Abcam</td><td>AB8895</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>二抗</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>二抗稀释比例为 1:500，溶于 1% BSA 中。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>二抗</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>DNA 染料</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>TOPRO3 是一种 DNA 荧光染料，其吸收波长/发射波长为 642/661 nm。若共聚焦显微镜配备 405 nm 激光器，也可使用 DAPI。</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>该甘油基封片剂必须与折射率匹配的油镜配合使用。</td></tr><tr><td>多聚赖氨酸载玻片</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（22×50 mm）</td><td>盖玻片</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶，带通气盖</td><td>培养瓶</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 4</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytofunnels</td><td></td><td>Shandon, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤纸卡</td><td></td><td>Shandon, Inc.</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>玻璃 Coplin 染色缸</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>染色槽</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>PAP 笔</td><td></td><td>Zymed Laboratories, Inc.</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Gammacell 1000 Elite 放射源</td><td>γ射线辐照仪</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦显微镜</td><td>共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td>配备三种激光器：488 nm、543 nm 和 633 nm。</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>成像分析软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

电离辐射后γh2ax空间分布的评估

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

DNA双链断裂（DSBs）发生后早期的分子响应之一，是组蛋白H2AX羧基末端SQEY基序中丝氨酸139位点（Ser-139）的磷酸化1,2。H2AX的这一磷酸化过程由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）家族蛋白介导，包括毛细血管扩张性共济失调突变蛋白（ataxia telangiectasia mutated, ATM）、DNA-蛋白激酶催化亚基以及ATM和RAD3相关蛋白（ATM and RAD3-related, ATR）3。磷酸化的H2AX形式被称为γH2AX，可从DSB位点向邻近的染色质区域扩散，形成离散的焦点结构，可通过免疫荧光显微镜清晰观察到3。对γH2AX焦点的分析与定量已被广泛用于评估DSB的形成与修复，尤其在电离辐射暴露后，以及用于评价多种辐射修饰化合物和细胞毒性化合物的效果4。
鉴于这种新生的DNA双链断裂（DSB）标记物具有极高的特异性和灵敏度，它为染色质背景下DNA损伤与修复过程的研究提供了新的见解。例如，在辐射生物学中，核心范式认为细胞核内的DNA是决定辐射敏感性的关键靶标。事实上，该领域普遍共识长期以来将染色质视为DNA损伤与修复的均一模板。然而，利用γH2AX作为DSB的分子标记，已观察到γ射线诱导的γH2AX焦点在常染色质和异染色质之间形成存在差异5-7。最近，我们使用一系列特异性识别组蛋白H3在赖氨酸9位点单、二或三甲基化（H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3）的抗体，这些修饰是组成型异染色质和转录沉默的表观遗传印记；同时还使用识别赖氨酸4位点甲基化（H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3）的抗体，这些修饰与活跃转录的常染色质区域密切相关，用以研究电离辐射后γH2AX的空间分布8。与当前染色质生物学的主流观点一致，我们的研究结果表明γH2AX的形成与活跃转录之间存在密切关联9。本文中，我们展示了在非贴壁细胞中检测和定量γH2AX焦点的免疫荧光方法，特别聚焦于其与其他表观遗传标记的共定位分析、图像分析以及三维建模。

在DNA双链断裂后，H2AX在Ser-139位点发生磷酸化，形成γH2AX焦点，其显微分析已成为辐射生物学中不可或缺的工具。本文中，我们采用针对赖氨酸4位单甲基化组蛋白H3的抗体作为活跃转录的常染色质的表观遗传标记，以评估辐射诱导的γH2AX在细胞核内的空间分布。

电离辐射后γH2AX空间分布的评估

DNA双链断裂（DSBs）发生后早期的分子响应之一是组蛋白末端SQEY基序内Ser-139位点的磷酸化...

大家好，我是 Raja Ti，目前正在贝克IDI心脏与糖尿病研究所攻读博士学位。我将为您演示在新生心肌细胞中进行三维成像以观察DNA损伤及染色质凝聚的东方修饰标记的具体步骤。DNA缠绕在核小体周围。每个核小体由四种不同类型的组蛋白组成，即 H2A、H2B、H3 和 H4。DNA 断裂的形成会通过 H2AX 的磷酸化（γH2AX）进行标记。这种 H2AX 的磷酸化主要发生在富含组蛋白 H3 第4位赖氨酸甲基化（H3K4me）的区域。接下来，我们将观察细胞中经 γH2AX 和甲基化的 H3K4 免疫标记的三维修饰示意图。我们开始吧。首先，将细胞悬液的 E 份加入 15 mL Falcon 管中，用 PBS 洗涤两次，每次在 150 ×g 条件下离心，然后重悬。用新鲜培养基重悬细胞，以观察辐射对细胞事件的即时影响。在辐射前及辐射过程中，将细胞置于视野中观察5至10分钟。对细胞进行γ射线或X射线照射后，将三毫升细胞悬液分别加入六个GU中。将细胞在37摄氏度下孵育30分钟至1小时，使用微孔板检测γH2AX峰值。我们使用Cytospin将非贴壁细胞沉降到玻璃载片上。组装Cytospin离心管时，确保滤膜完全对准漏斗。加入50微升，用拭子将该细胞悬液转移至每个胞嘧啶最终位置，将胞嘧啶夹放入胞嘧啶装置中，以500转/分钟离心5分钟。取出胞嘧啶夹，将载玻片从滤纸卡上分离。切勿让细胞干燥过久，以免影响荧光素染色的背景。 使用防液体扩散笔在每个涂片区周围画圈，随后在室温下用4%多聚甲醛固定细胞5分钟。与乙醇或甲醇相比，使用4%多聚甲醛固定效果更佳。接着将载玻片用含Triton X-100的PBS在室温下孵育5分钟以通透细胞。与使用Triton X-100处理的细胞相比，我们观察到信号有所增强。每次用PP S洗涤细胞3次，每次5分钟。用BSA在室温下封闭细胞10分钟，并与其他封闭剂及封闭时间相比，重复此步骤3次。在减少一抗的非特异性结合方面，BSA 效果最佳。我们使用两种一抗，均用含 1% BSA 的溶液以 1:500 的比例稀释，每张切片大约加入 50 微升一抗溶液。室温孵育一抗 60 分钟，相较于 4 摄氏度过夜孵育，可降低背景染色。用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟。Alexa floor 4 88，具有良好的抗小鼠特性，Alexa floor 5 46 具有抗兔特性。使用二抗以同时标记不同的标志物。应使用在不同物种中产生的抗体。每个载玻片上加入约 50 µL 稀释的二抗。将细胞在室温下孵育 90 分钟。建议将细胞置于湿盒中孵育，以防止细胞和抗体干燥。用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次。向每张载玻片加入50 µL以PBS配制的1:500稀释的topo three溶液。用PBS洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤三次。去除载玻片上多余的水分，然后加入Antifa溶液。添加抗荧光淬灭剂溶液前，不建议将细胞完全干燥。将盖玻片置于载玻片上时，应注意避免产生气泡。将载玻片置于黑暗湿润的孵育盒中过夜。用指甲油封片，以防止细胞干燥。在共聚焦显微镜下获取的图像显示。更高的空间分辨率已经实现，图像采集采用氦激光器。优先选用63倍油镜物镜，而非更高或更低放大倍数的物镜。将缩放倍数设为三到四倍可获得分辨率更佳的图像。对于大量细胞的荧光定量分析，建议使用八倍扫描速度，图像尺寸设置为1024×1024像素。进行多通道成像时，推荐采用逐行顺序扫描，而非帧扫描。为避免样品发生光漂白，应调整检测器增益和放大器偏移，以降低背景噪声和信号饱和。由于 Kama HX X 四的尺寸可能小于 0.5 微米，建议沿喷流轴方向以至少 0.5 微米的步长采集图像，喷流系列图像需采用“mark first”和“mark lost”模式。为展示不同蛋白质之间的空间关系，建议使用 Metamor 第一，扫描速度设为 6，图像尺寸设为 2048 × 248 像素。可以从不同共聚焦显微镜获取的图像中计数秒。通过文件菜单直接打开 gamma hgx 图像标签，或使用票据编号打开标签。转到“处理”菜单并选择“图像栈算术”。选择最大投影并选取要包含的层面，然后单击确定。接着选择顶帽变换，并将Gamma H2X图像作为源图像进行应用。顶部帽状滤波器及其生成的图像将是一个噪声较少且焦点强度变化降低的二值图像。进入“区域”菜单，选择区域绘制工具，并在细胞核周围绘制区域。进入“处理”菜单，选择阈值化图像。选择包含阈值并设置较低和较高的阈值数值。通常，正是这些阈值数值会影响四项数值。最佳阈值应尽可能减少背景的包含，同时最大化目标区域的包含。通过使用不同的阈值来统计菌丝侵染数量，可最佳实现此目的。然后将菌丝侵染数量与肉眼计数结果进行比较。选择DPI图像，进入区域菜单，选择转移区域选项。现在我们已准备好用于计数的对应菌丝体和细胞核图像。大多数细胞核区域已转移至top hat。转到“测量”菜单，选择“整合分析”（IMA），选择“测量所有区域”，然后点击“测量”以获得FTE数值。现在可以使用日志数据选项将各区域的FTE数值导出到电子表格中。打开先前为每个通道创建的喷射投影图像。转到显示界面并选择颜色对齐。选择每个通道对应的源图像，以创建三个通道的合并图像。通过线扫描分析来展示不同标记物在细胞核内的空间定位。前往测量工具栏命令，选择线扫描分析，并在细胞上画一条直线。这将生成一条曲线图，显示各通道沿该线的荧光强度，并表示不同标记物之间的相对距离。要从图像序列创建三维图像，请进入图像序列菜单并选择三维重建，然后选择最大值投影的三维重建类型。选择旋转平面，选择射流校准距离。通常用户指定后点击“确定”以生成三维重建图像。至此，我们完成了免疫荧光染色及图像分析的实验方案。总之，免疫荧光共聚焦显微镜是一种用于观察细胞核内不同C标记物和γH2AX的三维可视化技术。感谢观看。

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科研

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Biology

生物学

评价以下电离辐射的空间分布的γH2AX

利用γH2AX形成作为分子标志物来定量DNA双链断裂，已成为辐射生物学中不可或缺的工具。本文展示了使用免疫荧光法对细胞经辐射暴露后γH2AX焦点进行定量分析的方法。...

电离辐射后γH2AX焦点的定量分析

基于γH2AX焦点对DNA双链断裂进行定量已成为一种不可或缺的工具，尤其在辐射生物学中，可用于评估组织的放射敏感性以及辐射修饰化合物的作用效果。本文展示了在组织样本中利用免疫荧光法对γH2AX焦点进行定量的方法。...

组织样本中γH2AX焦点的定量分析

一种用于评估慢性因素可能诱导的DNA损伤水平及DNA修复能力变化的实验方案 体内 通过流式细胞术检测磷酸化组蛋白H2AX（DNA双链断裂的标志物），展示小鼠脾淋巴细胞中低剂量辐射的影响。...

测量慢性处理后小鼠脾细胞中的DNA损伤与修复 体内 暴露于极低剂量的β射线和γ射线

本文提供了一种通过γH2AX和53BP1的免疫荧光显微镜分析DNA双链断裂的实验方案。...

γH2AX与53BP1免疫荧光显微镜检测用于分析DNA双链断裂的形成与修复

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。...

通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

该方法结合了DNA双链断裂（DSBs）的定量分析、细胞周期分布和细胞凋亡检测，能够实现针对细胞周期特异性的DSB诱导与修复评估，以及修复失败所导致后果的分析。...

细胞周期特异性检测基因毒性应激后γH2AX与细胞凋亡的流式细胞术方法

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。...

可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

本方案介绍了外周血淋巴细胞中γ-H2AX焦点检测的载玻片制备及自动化计数方法。为展示该检测方法及其灵敏度，分离后的淋巴ocytes接受了辐照处理...

一种用于人外周血淋巴细胞γ-H2AX焦点检测的自动化显微评分方法

本方案介绍了一种通过同时检测博来霉素处理的人外周血淋巴细胞间期细胞核中γH2AX和53BP1焦点，以评估DNA双链断裂形成与修复的方法。...

人外周淋巴细胞中γH2AX与53BP1的双重免疫荧光染色

本文介绍一种在DNA损伤位点检测蛋白质相互作用的简单快速方案。...

邻近连接测定法定位DNA损伤位点中的蛋白质

学习利用免疫荧光和共聚焦显微镜技术检测γH2AX焦点，分析电离辐射诱导的DNA双链断裂在细胞核内的空间分布特征。该方法结合组蛋白H3K4甲基化标记，为辐射生物学研究提供三维可视化手段。

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