评价以下电离辐射的空间分布的γH2AX
August 7th, 2010
微观分析γH2AX灶，形成以下丝氨酸139磷酸化H2AX在DNA双链断裂，已成为辐射生物学中的一个非常宝贵的工具。在这里，我们使用一种抗体，单甲基化的组蛋白H3赖氨酸4作为一个积极抄写常染色质的表观遗传标记，以评估辐射诱导γH2AX形成的细胞核内的空间分布。
您好，我是 Raja Ti，正在贝克 IDI 心脏和糖尿病研究所攻读博士学位。我将带您完成 Eastern 修饰的 3D 图解所涉及的步骤，这些图示标记了新心肌细胞中的 DNA 损伤和色度凝聚。DNA 包裹在核区周围。
每个核小体由四种不同类型的组蛋白组成，H 2 A、H 2 b、H 3 和 H 4 radi。DNA 的形成断裂，这是以 H 2 X 的 PHO 为标志的，H 2 X 的这种 pho 主要发生在以 H 3、K、4 的甲基化为标志的肌酸中。现在，我们将查看细胞免疫标记中含有磷酸盐层 H 2 X 和甲基化 H 3 K 4 修饰的 3D 图示。
让我们开始吧。我们首先将细胞悬液的 E 层放入 15 mil 中。将Falcon管S用PB香味洗涤两次，浓度为1 50 G并进行复苏。
悬浮在新鲜培养基中，以查看辐射对细胞事件的直接影响。在放疗前和放疗期间，将细胞留在眼睛上 5 到 10 分钟。将细胞暴露于伽马射线或 X 射线 辐射后，将 3 毫升细胞悬液分配到每个 GU 中，每个 GU 为 6 个。
用于峰值 gamma H 的孔板 2 X 在 37 摄氏度下孵育细胞 30 分钟至 1 小时。我们使用胞嘧啶任务将非贴壁细胞放在载玻片上。组装胞嘧啶夹时，确保整个过滤线与漏斗重合。
分配一个 50 微升，将此细胞悬液拭除到每个胞嘧啶中，最后将胞嘧啶夹放入胞嘧啶任务中，并以 500 RPM 旋转 5 分钟。取下胞嘧啶夹，将载玻片与滤卡分开。不要让细胞风干太久，因为它可能会影响荧光素染色的背景。
使用液体封闭针画圆圈 在每个涂片周围，我们用 4% 多聚体头在室温下固定细胞 5 分钟。与乙醇或 ol 相比，使用 4% 多聚甲醛头观察到更好的固定。使用 Triton X 100 的 PPS 渗透池在室温下风滑行 5 分钟。
与双胞胎 80 相比，我们观察到 Triton X 100 在细胞中信号更好。用 PP S3 观察细胞，每次观察细胞 5 分钟。在室温下将细胞封闭在一个人的 BSA 中 10 分钟，与其他封闭剂和时间相比，重复 3 次。
BSA 最有效 在最大限度地减少一抗的非特异性结合方面，我们使用了两种一抗，用 1% BSA 以 500 分之一稀释，每个玻片上含有约 50 μL 的一抗。与 4°C 下过夜孵育相比，在室温下孵育一抗 60 分钟可减少背景染色。用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
Alexa floor 4 88，好的防鼠和 Alexa floor 5 46 字防兔。二抗用于同时保留不同的标志物。使用在不同物种中产生的抗体。
向每张玻片中加入大约 50 μL 稀释的二抗。在室温下孵育细胞 90 分钟。建议在潮湿室中孵育细胞，因为这会防止细胞和抗体干燥用 PB S3 洗涤玻片 5 次，每次 5 分钟。
向每张载玻片中加入 50 μL 的 PBS 中 topo three 的 500 分稀释液。用 PBS 洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟。去除载玻片上多余的水分并添加 Antifa 溶液。
建议在添加 Antifa 溶液之前不要完全干燥细胞。将盖玻片放在载玻片上。应服用 K 以避免形成任何气泡。
将载玻片放在黑暗潮湿的腔室中过夜。用指甲油密封载玻片，以防止细胞干燥。获得的图像 共聚焦显微镜 揭示。
更好的空间分辨率消失了，氦激光用于图像采集。一个 63 油排放物 两个镜头 优于更高或更低放大倍率的镜头。缩放系数为 3 或 4 将产生更高分辨率的图像。
对于来自许多单元格的 FO 帐户，最好使用 8 的扫描速度，即 1024 像素单元格的图像大小 1024。当对多个通道进行成像时，与帧扫描相比，建议使用顺序线扫描采集。为避免样品漂白，调整检测器增益和放大器偏移以降低小鼠和信号饱和。
由于 Kama HX X four 的尺寸可能小于 0.5 微米，因此建议采集至少 0.5 微米的图像。在喷射系列图案中，需要沿射流轴图像的步长，使用标记优先和标记丢失图案。为了说明不同蛋白质之间的空间关系，建议使用扫描速度 6，图像大小为 2048 和 2 48 像素，首先使用 metamor。
秒可以从各种共聚焦显微镜上采集的图像中计数。直接从文件菜单或使用账单编号打开 gamma hgx 图像标签。标签。转到 process （进程） 菜单，然后选择 Stack arithmatic （堆栈算术）。
选择 maximum projection （最大投影） 并选择要包含的计划。然后点击 Ok.现在选择 top hat 并选择 Gamma H two X image 作为源图像应用。
平帽滤波器和生成的图像将是杂色较少且焦点强度变化较少的二进制图像。转到 regions 并选择 region drawing tool 并在 nuclei 周围绘制区域。转到处理、菜单和出售阈值图像。
选择 Include threshold （包含阈值） 并设置阈值下限和上限值。影响 4 个数字的通常是阈值。最佳阈值是最小化背景包含并最大化 foray 包含的值。
这可以通过使用不同的阈值对入射次数进行计数来实现。然后将 foray number 与肉眼计数进行比较。选择 DPI 图像并转到区域菜单，然后选择传输区域选项。
现在我们已经准备好了相应的 foray 和 nuclear 图像以供计数。大多数核区域都转移到了大礼帽。转到测量、菜单并选择综合分析或 IMA，选择测量所有区域，然后单击测量以获取 FTE 编号。
现在，可以使用 Log data 选项将每个区域的 FTE 编号导出到电子表格中。打开之前为每个通道创建的 Jet 投影仪图像。转到 display 并选择 color align。
为每个通道选择相应的源图像，为所有三个通道创建图像图像。进行线扫描分析以说明细胞核中不同标志物的空间定位。转到 测量工具栏 命令并选择 线扫描分析 干线穿过单元格。
这将创建一个图表，显示沿线每个通道的荧光强度，并表示不同标记物彼此之间的距离。要从堆栈创建 3D 图像，请转到 To a stack （到堆栈） 菜单，然后选择 3D reconstruction （3D 重建）。选择 3D reconstruction type maximum（最大 3D 重建类型）。
选择旋转计划，选择 jet calibration distance。通常，用户指定 click okay 来创建 3D 重建。我们的 Immuno fluor 和染色以及图像分析方案到此结束。
综上所述，免疫荧光共聚焦显微镜是两种用于细胞核中不同 C 标志物和 γ H 两个 X foy 的三维视觉的技术。感谢观看。
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概述
本研究聚焦于γH2AX焦点的分析，这是辐射生物学中DNA双链断裂的关键指标。通过利用对第4位赖氨酸单甲基组蛋白H3的抗体，研究评估了辐射暴露后核内γH2AX形成的空间分布。
关键研究组成部分
科学领域
- 辐射生物学
- DNA损伤反应
- 表观遗传学
背景
- γH2AX焦点的形成是对DNA损伤的反应。
- H2AX在Ser-139位点的磷酸化是一个关键标记。
- 组蛋白H3在第4位赖氨酸的单甲基化表示活跃的转录。
- 理解DNA损伤的空间分布对于辐射研究至关重要。
研究目的
- 分析γH2AX焦点在辐射响应中的形成。
- 评估表观遗传标记在DNA损伤反应中的作用。
- 可视化这些标记在核内的空间分布。
使用的方法
- γH2AX焦点的显微镜分析。
- 使用抗体检测单甲基组蛋白H3。
- 3D插图技术用于可视化核修饰。
- 评估辐射对染色质结构的影响。
主要结果
- γH2AX焦点被确定为DNA双链断裂的标记。
- 展示了这些焦点在核内的空间分布。
- 组蛋白修饰与转录活性之间的相关性。
- 对辐射暴露后的表观遗传景观的洞察。
结论
- γH2AX焦点作为DNA损伤的有效指标。
- 组蛋白修饰提供了关于染色质状态的有价值信息。
- 该研究增强了对细胞对辐射反应的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding the spatial distribution of DNA damage markers like γH2AX provides mechanistic insights into chromatin context and transcriptional activity following radiation exposure. This approach supports target validation by linking epigenetic states to DNA repair pathways, enabling predictive confidence in preclinical models of genotoxic stress. The method enhances assay development for screening radiation-modifying compounds by quantifying foci formation in defined nuclear compartments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating γH2AX foci with active euchromatin marked by H3K4 methylation.
- Operational Value: Enables biological de-risking through spatial resolution of DNA damage in transcriptionally relevant chromatin regions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that alter chromatin-dependent DNA damage responses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing foci detection and co-localization with epigenetic markers.
- Quantitative Output: Delivers reproducible, imaging-based readouts of γH2AX foci formation and spatial distribution in non-adherent cells.
- Screening Relevance: Supports reliable compound evaluation by enabling high-content analysis of DNA damage in chromatin-contextualized systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects early DNA damage signaling to preclinical validation through chromatin-state-specific biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by elucidating how transcriptional activity influences γH2AX spreading post-irradiation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing disparities in damage repair between euchromatin and heterochromatin.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for genotoxic compound screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing spatial patterns of DNA damage relative to transcriptional activity.
- Screening: Enhances assay reproducibility and quantitative foci measurement for compound effect evaluation.
- Analytics: Provides integrated intensity and spatial distribution data enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Links to preclinical continuity via epigenetic biomarker alignment in radiation response models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for chromatin-contextualized DNA damage studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in DNA damage localization.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability in foci quantification and co-localization analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in genotoxicology programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on chromatin-dependent DNA damage and repair phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, confocal microscopy, and epigenetic marker detection.
- Dependent on instrumentation for 3D reconstruction, line scan analysis, and threshold-based image processing.
- Necessitates cross-team standardization for antibody validation, imaging parameters, and foci counting protocols.
- Involves adaptation considerations across cell types, particularly non-adherent and primary cell models.
- Practical limitations include signal resolution for sub-micrometer foci and potential bleaching during multi-channel acquisition.
