电离辐射后γH2AX空间分布的评估

大家好，我是 Raja Ti，目前正在贝克心脏与糖尿病研究所攻读博士学位。我将为您介绍在新生心肌细胞中进行三维可视化展示东方修饰标记的DNA损伤及染色质凝聚的各个步骤。DNA缠绕在核小体上。

每个核小体由四种不同类型的组蛋白组成，即 H2A、H2B、H3 和 H4。DNA 断裂的形成会通过 H2AX 的磷酸化（γH2AX）进行标记。这种 H2AX 的磷酸化主要发生在富含组蛋白 H3 第4位赖氨酸甲基化（H3K4me）的区域。接下来，我们将观察细胞中经 γH2AX 和甲基化的 H3K4 免疫标记的三维修饰示意图。

我们开始实验。首先将细胞悬液分装至15 mL Falcon管中，用PBS洗涤两次，每次在150 ×g条件下离心，然后重悬。

将细胞悬浮于新鲜培养基中，以观察辐射对细胞事件的即时效应。在照射前及照射过程中，将细胞置于视野中观察5至10分钟。对细胞进行γ射线或X射线照射后，将三毫升细胞悬液分别加入六孔板的每个孔中。

将细胞在37摄氏度下于峰伽马H2X培养板中孵育30分钟至1小时。我们使用Cytosine装置将非贴壁细胞置于玻片上。组装Cytosine夹具时，确保整个滤膜孔与漏斗对齐。

加入50微升，用拭子将该细胞悬液转移至每个胞嘧啶最终位置，然后将胞嘧啶夹放入胞嘧啶装置中，以500转/分钟离心5分钟。取出胞嘧啶夹，将载玻片从滤纸卡上分离。切勿让细胞干燥过久，以免影响荧光素染色的背景。

使用防液体扩散笔在每个涂片区周围画圈，随后在室温下用4%多聚甲醛固定细胞5分钟。与乙醇或甲醇相比，4%多聚甲醛的固定效果更佳。然后将载玻片用含Triton X-100的PBS在室温下对细胞进行透化处理，持续5分钟。

与使用Triton X-100处理的细胞相比，我们观察到信号有所增强。每次用PP S洗涤细胞3次，每次5分钟。在室温下用1个人份的BSA封闭细胞10分钟，并与其他封闭剂及封闭时间相比，重复此步骤3次。

在最大程度降低一抗的非特异性结合方面，BSA 效果最佳。我们使用两种一抗，用含 1% BSA 的溶液以 1:500 的比例稀释，每张载玻片加入约 50 微升的一抗溶液。室温下孵育一抗 60 分钟，相较于 4 摄氏度过夜孵育，可减少背景染色。用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟。

Alexa floor 4 88，具有良好的抗小鼠特性，Alexa floor 5 46 具有抗兔特性。使用二抗可同时标记不同的分子标志物。应选用针对不同物种产生的抗体。

每个载玻片上加入约 50 微升稀释的二抗。室温孵育细胞 90 分钟。建议将细胞置于湿盒中孵育，以防止细胞和抗体干燥，然后用 PBS 每次洗涤 5 分钟，共洗涤 3 次。

向每张载玻片加入50 µL以PBS配制的1:500稀释的topo three溶液。用PBS洗涤载玻片，每次5分钟，共洗三次。去除载玻片上多余的水分，然后加入Antifa溶液。

建议在加入Antifa溶液前不要将细胞完全干燥。将盖玻片置于载玻片上。操作时应注意避免产生气泡。

将载玻片置于黑暗湿润的孵育盒中过夜。用指甲油封片，以防止细胞干燥。在共聚焦显微镜下获取的图像显示。

更高的空间分辨率已经实现，图像采集采用氦激光。优先使用63倍油镜物镜，而非更高或更低放大倍数的物镜。设定三到四倍的缩放系数可获得分辨率更佳的图像。

对于大量细胞的荧光定量分析，建议使用8倍扫描速度和1024×1024像素的图像尺寸。进行多通道成像时，推荐采用逐线扫描顺序采集，而非逐帧扫描。为避免样品发生光漂白，应调整探测器增益和放大器偏移，以降低背景噪声和信号饱和。

由于 Kama HX X 四的尺寸可能小于 0.5 微米，建议以至少 0.5 微米的步长采集图像。沿喷流轴方向的图像需按照“标记优先”和“标记丢失”模式在喷流序列中获取。为阐明不同蛋白质之间的空间关系，建议使用 Metamor 第一，扫描速度设为六，图像尺寸设为 2048 和 248 像素。

可以从不同共聚焦显微镜获取的图像中计数第二相。通过文件菜单直接打开 gamma hgx 图像标签，或使用账单编号打开标签。转到“处理”菜单并选择“图像栈算术”。

选择最大投影并选取要包含的层面，然后单击确定。接着选择顶帽变换，并将Gamma H2X图像作为源图像进行应用。

顶部帽状滤波器及其生成的图像将是一个噪声较少且焦点强度变化降低的二值图像。进入区域菜单，选择区域绘制工具，并在细胞核周围绘制区域。进入处理菜单，选择阈值化图像。

选择包含阈值并设置较低和较高的阈值数值。通常，正是这些阈值数值会影响四个数值。最佳阈值应尽可能减少背景的包含，同时最大化目标区域的包含。

通过使用不同的阈值来统计突起数量，可最佳实现此目标。然后将突起数量与肉眼计数结果进行比较。选择DPI图像，进入区域菜单，选择转移区域选项。

现在我们已准备好用于计数的对应菌丝体图像和细胞核图像。大多数细胞核区域已转移至top hat图像中。转到“测量”菜单，选择“整合分析”（IMA），选择“测量所有区域”，然后点击“测量”以获得FTE数值。

现在可以使用日志数据选项将各区域的FTE数值导出到电子表格中。打开先前为每个通道创建的喷射投影图像。进入显示界面并选择颜色对齐。

选择每个通道对应的源图像，以生成三个通道的合并图像。通过线扫描分析来展示不同标记物在细胞核内的空间定位。进入测量工具栏命令，选择线扫描分析，在细胞上画一条直线。

这将生成一条线上各通道荧光强度的图表，表示不同标记物彼此之间的相对距离。要从图像栈生成三维图像，请进入图像栈菜单并选择三维重建，然后选择最大值投影的三维重建类型。

选择旋转方案，选择喷流校准距离。通常用户需点击“确定”以生成三维重建。至此，我们完成了免疫荧光染色与图像分析的实验方案。

总之，免疫荧光共聚焦显微镜是一种用于观察细胞核内不同C标记物和γH2AX焦点的三维可视化技术。感谢观看。