鸡胚全视网膜外植体电穿孔和化学试剂处理

本协议描述的方法来剖析，实验操作和鸡胚培养全视网膜植。当高的成功率，有效性和再现性都需要测试质粒电穿孔和/或试剂的物质， 即，酶抑制剂的效应的外植体培养是有用的。

该程序的总体目标是通过实验解剖、作和培养来自鸡胚胎的整个视网膜植入物。这是通过首先从鸡胚胎中收集双眼并将它们放入培养皿中来完成的。第二步是使用细镊子去除 loga 上的巩膜和色素上皮。

接下来，用扁平圆形电极对整个视网膜解释进行质粒 DNA 电穿孔。最后一步是在培养基中孵育视网膜外表。在培养箱中的 24 孔板中。

最终，将整个视网膜植入物固定、冷冻切片，并通过免疫荧光显微镜进行分析，以可视化视网膜神经元。与现有方法（如 OVO 电作）相比，该技术的主要优点是快速、易于执行并确保结果可重复。这种方法可以帮助回答中枢神经系统发育领域的关键问题，例如神经发生如何受到特定化学试剂的影响，如酶抑制剂或孵化后靶向细胞周期的基因产物。

将所需胚胎年龄的鸡蛋放入层流罩中，并用 70% 乙醇擦拭蛋壳，以避免胚胎污染。将鸡蛋的侧面用力敲击坚硬的表面，将鸡蛋打开，然后将内容物放入 100 毫米的培养皿中。用小勺子将胚胎转移到 35 毫米的培养皿中，培养皿中含有 37 摄氏度的预热 PBS，以防止组织干燥。

接下来，将胚胎斩首，并将包含胚胎组织的 35 毫米培养皿放在双目立体视觉上。在层流罩中解剖显微镜，使用细镊子从嘴腹侧切开到眼睛。从切口部位开始，撕开整个眼睛周围的组织。

接下来，掐掉视神经，从眼眶中取出完整的眼睛。从同一胚胎中收集左眼和右眼，用作对照眼或治疗眼。使用细镊子将眼睛转移到含有预热 PBS 的新 35 毫米培养皿中。

去除眼睛周围的所有组织，包括 laga 上的巩膜。接下来，在眼睛背面的色素上皮上捏一个小切口，注意不要损伤神经视网膜。然后从切口部位开始轻轻撕开色素上皮。

将晶状体和整个视网膜留在玻璃体上。去除色素上皮，沿着眼睛前部区域瞳孔周围的睫状体和脉络膜裂小心，因为很难从这些位置去除。打开电灯，将汉堡包和汉密尔顿阶段 20 至 25 视网膜的电压设置为 15 伏特，或 26 至 27 期视网膜的 20 伏特。

接下来，将脉冲重复次数设置为 5 个 50 毫秒的脉冲，脉冲长度为 1 秒。使用可以通过地板上的脚踏板控制的脉冲发生器，因为需要双手将电极固定到位。将两个定制的桨形铂电极连接到脉冲发生器上的输出插座。

此处显示的电极由 0.1 毫米铂板 rls 制成，0.8 毫米连接线是绝缘的。使用塑料管，使用末端被切断的聚乙烯牧场移液器小心地将整个视网膜外表转移给兽医。避免使用移液器吸头，因为视网膜往往会附着在塑料上并撕裂。

接下来，使用 100 微升移液器轻轻去除视网膜解释周围的所有 PBS。注意不要触摸视网膜，以免撕裂它。向 QVE 中加入 100 微升稀释的质粒溶液，并确保整个视网膜外膜被溶液覆盖。

如果视网膜外表漂浮到顶部，请用镊子轻轻向下推。使用镊子电极将晶状体定位到镜体的任何一侧，并将视神经引导至镜体底部。接下来，将正极放在晶状体前面，将负极放在视网膜后面，不要接触组织。

通过踩下脚踏板来施加电流，检查电极上是否有气泡，表明放电成功。使用 100 微升移液器从 qve 中去除所有质粒混合物，而不会损坏视网膜。去除质粒后，质粒混合物可以重复使用 3 到 5 次。

用预热的 PBS 填充 vete。用镊子轻轻地将视网膜外膜从门壁上分离。然后使用聚乙烯通过移液器将整个视网膜外表转移到含有 1 毫升预热培养物的 24 孔板中。

培养基每孔仅孵育一个视网膜外表。在 37 摄氏度和 5% CO 2 的旋转摇床上以 50 RPM 的恒定速度孵育视网膜外膜。旋转可确保最大程度地暴露于介质中，并防止视网膜粘附到 24 孔板的底部。

培养 24 小时后，GFP 阳性细胞在完整视网膜的大部分中可见，因为电穿孔导致大面积的视网膜占据质粒并表达报告基因。切片后，沿视网膜的 ACO 基底轴很容易检测到单个 GFP 阳性细胞。整个视网膜外表可以培养约 24 小时。

潜伏期可能导致发育迟缓、形态畸形、细胞凋亡，并最终导致视网膜解体。培养 24 小时的整个视网膜外表切片为免疫染色，磷酸化组蛋白 3 出现在红色通道磷酸化组蛋白 3 标记细胞中，位于 G 2 晚期。在视网膜的顶端发现 pH 值为 3 阳性细胞，与正常的视网膜发育一致。

如此处所示，可以通过添加 CDK 一二抑制剂来阻止这种发展 在成像前与抑制剂孵育 4 小时，显着减少视网膜中 pH 值 3 阳性的数量 在其发展后。该技术已成功用于研究新 DNA 质粒中已报道的基因表达，并用化学试剂处理视网膜外植体，包括 DNA 损伤途径和细胞周期的调节因子。按照此程序，可以执行其他方法，例如 Innovo 电作，以进一步确认结果。