鸡胚全视网膜外植体用于电穿孔及化学试剂处理

本实验的总体目标是对鸡胚的完整视网膜移植物进行分离、操作和体外培养。首先，取鸡胚的两只眼球置于培养皿中。第二步，使用精细镊子去除巩膜组织和色素上皮。

接下来，将整个视网膜外植体置于扁平圆形电极中进行质粒DNA的电穿孔。最后一步是将视网膜外植体置于培养皿中，在培养箱内的24孔板中用培养基孵育。

最终，将整个视网膜植入物固定后进行冷冻切片，并通过免疫荧光显微镜分析以观察视网膜神经元。与现有的方法（如体内电生理操作）相比，该技术的主要优势在于操作快速、简便，并能确保结果具有良好的可重复性。该方法有助于回答中枢神经系统发育领域的关键科学问题，例如在孵育后，特定化学试剂（如酶抑制剂）或靶向细胞周期的基因产物如何影响神经发生过程。

将处于所需胚胎发育时期的鸡蛋放入超净工作台中，用70%乙醇擦拭蛋壳，以避免胚胎污染。将鸡蛋侧面用力撞击坚硬表面，使蛋壳破裂，随后将内容物倒入100毫米的培养皿中。使用小勺将胚胎转移至含有预热至37摄氏度PBS的35毫米培养皿中，以防止组织干燥。

接下来，将胚胎去头，并将含有胚胎组织的35毫米培养皿置于体视显微镜下。在超净工作台内，使用精细镊子在眼腹侧的口部位置进行切口。从切口处开始，撕开环绕整个眼球的周围组织。

接下来，夹住视神经并从眼眶中取出完整的眼球。从同一胚胎中采集左侧和右侧眼球，用作对照眼或处理眼。使用小勺借助精细镊子将眼球转移至一个新的含有预热 PBS 的 35 毫米培养皿中。

去除眼球周围的所有组织，包括lagena上的巩膜。接着，在眼球背侧的色素上皮处轻轻剪开一个小切口，注意不要损伤神经视网膜。然后从切口处开始，轻柔地撕开色素上皮。

保持晶状体和整个视网膜与玻璃体相连。去除色素上皮层时，需小心操作，特别是在眼球前部瞳孔周围的睫状体区域以及脉络膜裂处，因为这些部位的组织较难剥离。开启电刺激装置，对于汉堡氏分期20至25期的视网膜，将电压设为15伏；对于分期26至27期的视网膜，将电压设为20伏。

接下来，将脉冲重复设置为5个50毫秒的脉冲，脉冲长度间隔为1秒。使用可通过脚踏板控制的脉冲发生器，因为双手需要同时固定电极。将两个定制的桨状铂电极连接到脉冲发生器的输出插孔上。

此处所示电极由0.1毫米铂板制成，0.8毫米连接导线已做绝缘处理。使用塑料管，借助已剪去末端的聚乙烯巴斯德吸管，小心地将整个视网膜外植体转移至记录槽中。避免使用移液器吸头，因为视网膜容易黏附在塑料表面而导致撕裂。

接下来，使用 100 微升移液器轻轻吸除视网膜外植体周围的全部 PBS。操作时注意不要触碰视网膜，以免造成撕裂。向 QVE 中加入 100 微升稀释后的质粒溶液，并确保整个视网膜外植体被溶液覆盖。

如果视网膜标本漂浮到顶部，可用镊子轻轻将其压下。使用镊子电极将晶状体调整至朝向记录槽的任意一侧，并使视神经朝向记录槽底部。接着，将正极置于晶状体前方，负极置于视网膜后方，注意不要接触组织。

通过踩下脚踏开关通电，并观察电极处是否有气泡产生，以确认放电成功。使用100微升移液器从qve中吸出全部质粒混合液，注意不要损伤视网膜。取出质粒后，质粒混合液可重复使用三至五次。

用预热的 PBS 填充培养皿。用镊子轻轻将视网膜外植体从培养皿壁上分离。然后使用聚乙烯管尖的移液器将整个视网膜外植体转移至含有 1 毫升预热培养液的 24 孔板中。

每个孔仅孵育一个视网膜外植体。将视网膜外植体置于37摄氏度、5%CO2条件下，在转速恒定为50 RPM的旋转摇床上进行孵育。旋转可确保外植体与培养基充分接触，并防止视网膜贴附于24孔板底部。

培养24小时后，由于电穿孔导致质粒被大片区域的视网膜摄取并表达报告基因，因此在大部分完整视网膜中可见GFP阳性细胞。切片后，沿视网膜ACO基底轴可轻松检测到单个GFP阳性细胞。整个视网膜外植体可再持续培养约24小时。

孵育时间过长可能导致发育延迟、形态畸形、细胞凋亡，最终导致视网膜解体。以下是一段培养24小时的完整视网膜外植体切片，经免疫染色显示磷酸化组蛋白H3（红色通道），该标记物出现在G2/M期晚期的细胞中。pH3阳性细胞位于视网膜的顶端侧，符合正常视网膜发育的特征。

如图所示，通过添加CDK1/2抑制剂可以阻断该发育过程；在成像前用该抑制剂孵育4小时，可显著减少视网膜中pH3阳性细胞的数量。该技术已成功用于研究新DNA质粒的基因表达，并用于以化学试剂处理视网膜外植体，包括DNA损伤通路和细胞周期的调控因子。在完成该操作后，可进一步采用其他方法（如体外电转染）以进一步验证实验结果。