三维人类皮肤重建模型：研究正常皮肤与黑色素瘤进展的工具

本实验的总体目标是构建一种三维人皮肤重建模型，用于黑素细胞、黑色素瘤及皮肤干细胞生物学的研究。首先，用中和的牛胶原蛋白包被组织培养板的插入物；第二步，利用成纤维细胞与胶原蛋白构建含细胞的真皮层结构。

接下来，由角质形成细胞与黑素细胞或黑色素瘤细胞混合构建表皮区室。该实验程序的最后一步是在第18天收获皮肤重建组织，并将重建的皮肤移植到小鼠体内。最终，通过移植组织的免疫组织化学和免疫荧光分析，可观察到含有黑素细胞的正常皮肤结构、正常干细胞的迁移与分化，以及分期特异性的黑色素瘤表型。

20年前，我们开发了皮肤重建模型，因为在早期研究中我们发现，培养在培养皿中的正常黑素细胞或黑色素瘤细胞的行为，与处于组织环境中的细胞大不相同。因此，皮肤重建模型非常适合用于观察细胞如何从皮肤的一个区室迁移至另一个位置。将先前制备好的无细胞层胶原混合物置于冰上，然后取一毫升淡黄色溶液加入六孔插入式培养板的每个插件中。

将组织培养板置于室温下孵育30分钟，使凝胶充分凝固。在此期间，溶液颜色应由黄色变为粉红色。凝胶凝固的同时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA对人成纤维细胞从培养瓶中进行消化5分钟。随后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基以中和消化过程。

在室温下以200 × g离心5分钟收集悬浮细胞，然后将细胞重悬于含10% FBS的DMEM中，密度为每1.5毫升含4.5 × 10⁵个细胞。接下来，用先前制备的细胞层胶原混合物填充一个50毫升离心管，并将该管置于冰上。

向试管中加入1.5毫升的成纤维细胞悬液并混匀。每孔加入3毫升淡黄色细胞层溶液至无细胞层包被的插入式培养小室中。随后将组织培养板置于含5%二氧化碳的组织培养孵箱中，在37摄氏度下孵育45分钟，在孵育期间保持条件稳定。

细胞层溶液的颜色也应由黄色变为粉红色。待上层凝胶凝固后，在组织培养板的插入物内侧加入含有10%FBS的2毫升DMEM，外侧加入10毫升。将组织培养板孵育四天。

在孵育的第四天检查凝胶是否收缩，从每个插入物的内侧和外侧吸出培养基。在插入物内侧加入 2 毫升洗涤培养基，外侧加入 10 毫升，以洗去常规血清。然后将培养板在 37 °C 下孵育 1 小时，以生成表皮。

首先，用胰蛋白酶处理人角质形成细胞。然后，孵育5分钟后，在200 × g离心5分钟以收集脱落的细胞，随后使用大豆胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶。最后，将细胞沉淀重悬于皮肤培养基中，浓度为每毫升4.17 × 10⁶个细胞。

在收获角质形成细胞后，重新构建培养基。将人黑素细胞在冰上用胰蛋白酶消化一到两分钟。再次使用大豆胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶。

然后在与之前相同的条件下离心细胞，将黑色素细胞沉淀重悬于皮肤中，浓度为每毫升8.3 × 10⁵个细胞，并同时重新配制皮肤重建培养基一。接下来，从已制备的真皮层组织培养板的每个插入物的内侧和外侧均移除洗涤培养基。

通过向每个插入物的内部加入1.5毫升皮肤重建培养基、外部加入10毫升培养基来更换洗涤液。然后将600微升角质形成细胞悬液与600微升黑素细胞悬液混合。取200微升混合后的细胞悬液进行接种。

逐滴加入每个插入物的内部。将组织培养板在37摄氏度下孵育两天。孵育细胞后，吸除每个插入物内外的皮肤重建培养基一，然后在插入物内部加入2毫升皮肤重建培养基二，在外部加入10毫升皮肤重建培养基二。

然后将重建组织在37摄氏度下再孵育两天。第二次孵育两天后，从每个插入物的内部和外部吸出皮肤重建培养基二。现在仅向插入物的外部加入7.5毫升皮肤重建培养基三。

将重建组织放回培养箱中，并更换皮肤。每隔一天更换一次重建培养基，直至第18天。在培养的第18天，吸出皮肤重建组织培养板中插入物内部和外部的培养基。

用镊子将插入物从托盘中取出。用手术刀沿靠近边缘处划出一个圆形，切下包含聚碳酸酯滤膜的构建物。然后将带有滤膜的重建组织放在硬质表面上，用刀片将其切成两半。

将重建组织的一半置于黑色TBS活检纸上，然后将纸放入组织学包埋盒中。将整个包埋盒浸入10%福尔马林中固定超过四小时。随后将包埋盒转移至70%乙醇中，并在4°C下保存，直至准备进行石蜡包埋处理。

将重建样本的另一半置于4°C条件下，在50%蔗糖溶液中浸泡1至2小时。随后更换为2摩尔蔗糖溶液，并在4°C下继续保存1至2小时。向底模中加入适量的OCT包埋剂（最佳切割温度冷冻介质），填充至一半高度。

避免产生气泡。用镊子夹住重建组织的边缘，将其从蔗糖溶液中取出，放置在无尘纸巾上，直至蔗糖被完全吸收。

使用镊子和刮勺，将重建组织转移至 OCT 包埋盒中。继续添加 OCT 以覆盖重建组织的顶部，直至包埋盒完全填满，注意再次避免产生气泡。

将样本盒均匀地放置在碎干冰上，使OCT完全冻结。然后包裹住底模和铝箔，于-70摄氏度保存，直至准备使用冷冻切片机进行切片。为准备在小鼠上移植皮肤重建组织，先将容器中装入液氮，并向50毫升离心管中加入5毫升DMEM。

取一个烧杯，加入600毫升自来水，将烧杯置于加热板上加热升温。然后选择一只约六周龄的雌性skid无毛非纯系小鼠。用异氟烷麻醉小鼠后。

在整个操作过程中使用鼻罩以维持麻醉状态。涂抹无菌眼用润滑剂，并提供保温支持以防止低体温。随后，使用复合苯甲酸酊和酒精消毒棉片清洁小鼠皮肤。

在小鼠背部标记一条线，以确保后续缝合时位置一致。使用虹膜剪和镊子在小鼠背部切割出圆形创面，然后用无菌纱布覆盖创面。将圆形小鼠皮肤放入含有DMEM的50毫升离心管中。

将试管浸入液氮容器中，直至所有培养基和组织完全冻结。接着，将试管放入盛有热水的烧杯中解冻，直至完全融化。重复此冻融过程三次。

使用手术刀将皮肤重建组织从插入物上分离。非常小心地移除膜，然后将皮肤重建组织转移至小鼠伤口床的表面。现在，将小鼠皮肤放置在皮肤重建组织的上方。

确保第一根缝线位于先前标记的标记物上方，第二根位于下方。然后在皮肤重建物两侧使用另外两根缝线固定小鼠皮肤。移植后清洁小鼠皮肤，随后将小鼠放入新的笼子中。

在第18天，皮肤重建物的表皮由分层的角质形成细胞层组成，未分化的基底层和依次分化的各层呈垂直排列。使用黑色素细胞标记物对重建组织切片进行染色。

如黑色箭头所示，S100显示黑色素细胞排列在表皮的基底层，并通过树突状突起与多个角质形成细胞相连接。真皮层包含成纤维细胞，这些细胞嵌入由I型胶原沉积形成的基质中；IV型胶原指示基底膜的位置，该膜将表皮与真皮分隔开。以下图示说明了表皮中多层角质形成细胞的形成过程。

当用GFP慢病毒载体标记的真皮干细胞与成纤维细胞共同包埋于I型胶原基质中时，它们在第5天迁移至表皮并分化为黑色素细胞。接种角质形成细胞后，单个细胞开始从细胞球中迁移出来。

请注意，表皮仍由单层细胞构成。在第8天，少数细胞到达表皮-真皮交界处。

到第10天，GFP阳性细胞紧密排列在基底膜位置，如图所示。表皮中迁移的GFP阳性细胞表达黑色素细胞标志物HMB 45。当将不同阶段的黑色素瘤细胞系引入皮肤重建模型时，这些细胞的行为可反映其体内的生物学特性。

在此图中，可以观察到在二维培养条件下生长的正常黑素细胞和黑色素瘤细胞。如图所示，在皮肤重建组织中，正常黑素细胞的位置和生长速度受到严格调控；处于径向生长阶段的原发性黑色素瘤主要在表皮内增殖，而处于垂直生长阶段的黑色素瘤则会侵袭性地向真皮层生长，如本图所示。最后，此处还可观察到转移性黑色素瘤强烈侵入真皮深层的方式。

我们在正常皮肤中的研究为深入了解黑色素瘤的发生和发展奠定了基础。