三维人体皮肤重建模型:一种工具来研究正常皮肤恶性黑色素瘤进展
August 3rd, 2011
在这份报告中，我们描述了皮肤三维重建模型模仿人体皮肤结构和组成。使用皮肤重建模型被查处的黑素细胞的生理，黑色素瘤的进展和皮肤干细胞的命运。该模型也可作为临床前药物评估工具。
该程序的总体目标是生成 3D 人体皮肤重建，用于黑色素细胞、黑色素瘤和皮肤干细胞生物学的研究。这是通过首先用中和的牛胶原蛋白包被组织培养托盘的插入物来实现的。第二步是用成纤维细胞和胶原蛋白制作细胞真皮区室。
接下来，用与黑色素细胞或黑色素瘤细胞混合的角质形成细胞制作表皮隔室。该程序的最后一步是在第 18 天收获皮肤重建，并将皮肤重建移植到小鼠身上。最终，移植物的免疫组织化学和免疫荧光分析显示含有黑色素细胞的正常皮肤的结构、正常干细胞的迁移和分化以及分期特异性黑色素瘤表型。
我们在 20 年前开发了皮肤重建模型，因为我们在研究的早期发现，在培养皿上培养的正常黑色素细胞或黑色素瘤细胞的行为与组织环境中的细胞行为非常不同。因此，皮肤重建模型非常适合我们观察细胞如何从皮肤的一个隔室移动到任何其他位置。将先前制备的脱细胞层胶原蛋白混合物置于冰上，然后将 1 毫升稻草黄溶液加入每个插入物中。
孔组织培养托盘在室温下孵育托盘 30 分钟，以使凝胶凝固。在此期间，凝胶在 5 分钟后固化胰蛋白酶、眼睛、含有 0.25% tripsin EDTA 的培养瓶中的人原始纤维细胞时，溶液的颜色应从黄色变为粉红色。添加含有 10% FBS 的 DMEM 以中和化过程。
在室温下以 200 G 离心 5 分钟收集分离的细胞，然后以 4.5 倍 10 倍/1.5 mL 的比例重悬细胞至第 5 个细胞。补充有 10% FBS 的 DMEM。接下来，用先前制备的细胞层胶原蛋白混合物填充 50 毫升试管，并将试管放在冰上。
向试管中加入 1.5 毫升成纤维细胞悬液并混合。将 3 毫升稻草黄色细胞层溶液添加到每个无细胞层涂层插入物中。然后在孵育期间，将组织培养盘在 37°C 下在 5% 二氧化碳组织培养箱中孵育 45 分钟。
细胞层溶液的颜色也应从黄色变为粉红色。顶层凝胶凝固后，在组织培养盘中插入物内侧添加 2 毫升含有 10% FBS 的 DMEM，在插入物外侧添加 10 毫升。将组织培养盘孵育四天。
在第四天检查凝胶是否收缩，在孵育的第四天，从每个小室的内部和外部吸出培养基。在插入物的内侧加入 2 毫升洗涤培养基，在插入物的外部加入 10 毫升，以洗掉普通血清。然后将托盘在 37 摄氏度下孵育 1 小时以生成表皮。
首先胰蛋白酶是人角质形成细胞。然后在 5 分钟后，在 200 G 下旋转分离的细胞 5 分钟后，使用大豆胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶。Reus 将细胞沉淀以 4.17 乘以 10 的倍悬液悬浮在皮肤中，至每毫升 6 个细胞。
收获角质形成细胞后重建培养基 1。胰蛋白酶冰敷人黑色素细胞 1 到 2 分钟。同样，用大豆胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶。
然后在与以前相同的条件下旋转细胞后，以每毫升 8.3 倍 10 至第五个细胞重悬于皮肤中。也重建培养基 1。接下来，从真皮层制备的组织培养盘的每个插入物的内侧和外侧去除洗涤介质。
通过添加 1.5 毫升皮肤更换洗涤介质，重建培养基，每个插入物的内侧 1 毫升，外侧 10 毫升。然后将 600 微升的角质形成细胞悬液与 600 微升的黑色素细胞悬液混合。分配 200 μL 混合细胞悬液。
一滴一滴地滴到每个插件的内部。将组织培养盘在 37 摄氏度下孵育两天。孵育细胞后，吸出皮肤，从每个插入物的内部和外部重建培养基 1，然后加入 2 毫升皮肤，重建培养基，2 毫升到插入物的内侧和 10 毫升到插入物的外部。
然后将重建物在 37 摄氏度下再孵育两天。在第二个两天的孵育后，吸出皮肤，从每个插入物的内部和外部重建培养基 2。现在加入 7.5 毫升皮肤，仅将培养基 3 重建到插入物的外部。
将重建物放回培养箱中并更换皮肤。每隔一天重建培养基 3，直到第 18 天。在孵育的第 18 天，从皮肤重建加载的组织培养盘的插入物的内侧和外侧吸出培养基。
用镊子从托盘中取出插入物。用手术刀刀片在靠近边缘的圆圈中画出一个圆圈，切出包括聚碳酸酯过滤器的结构。然后将重建物放入过滤器中的坚硬表面上，并用刀片将它们切成两半。
将重建的一半放在黑色 TBS 活检纸上，然后将纸放入组织学盒中。将整个包埋盒浸泡在 10% 福尔马林中 4 小时以上。然后将盒放入 70% 乙醇中并储存在 4 摄氏度，直到您准备好处理石蜡包埋的重建。
将重建的另一半放入 4 摄氏度的 50% 蔗糖中 1 至 2 小时。然后将蔗糖改为两磨牙，然后在 4 摄氏度下再存放 1 到 2 小时。用最佳切削温度、冷冻介质或 OCT 填充基模的一半。
避免任何气泡。用镊子抓住重建的边缘，并从蔗糖中取出重建。将其放在 Kim 湿巾上，直到蔗糖被吸收。
使用镊子和抹刀，将重建物转移到 OCT 顶部的船上。用更多的 OCT 覆盖重建物的顶部，直到船完全装满。同样，避免气泡。
将船均匀地放在碎干冰上，让 OCT 完全冻结。然后包裹基模和箔纸并将其存放在零下 70 摄氏度，直到您准备好用低温恒温器切割它。为了准备在小鼠上移植皮肤重建，用液氮填充容器，并将 5 毫升 DMEM 添加到 50 毫升试管中。
在烧杯中装满 600 毫升自来水，然后将烧杯放在热板顶部加热。然后选择一只 6 周龄左右的雌性滑行无毛近交老鼠。用 isof fluorine 麻醉小鼠后。
在整个手术过程中使用鼻锥保持麻醉。使用无菌眼用润滑剂并提供热支持以防止体温过低。接下来，用复合安息香酊剂和酒精制备拭子清洁小鼠皮肤。
在鼠标顶部标记一条线，以保持相同的位置以供以后缝合。使用虹膜剪刀和镊子在小鼠背部剪下圆伤口床，然后用无菌纱布海绵覆盖伤口床。将圆形小鼠皮肤放入 50 毫升 DMEM 管中。
将试管浸入液氮容器中，直到所有培养基和组织完全冻结。接下来，在装有热水的烧杯中解冻试管，直至完全解冻。重复此作，冷冻和解冻过程 3 次。
使用手术刀片从插入物上分离皮肤重建物。非常小心地去除膜，然后将皮肤重建转移到小鼠伤口床的顶部。现在，将鼠标皮肤放在皮肤重建的顶部。
确保第一缝合线位于先前标记的标记的顶部，第二缝线位于底部。然后在皮肤重建的两侧再使用两根缝合线来固定小鼠皮肤。嫁接后清洁鼠标皮肤，然后将鼠标放入新的笼子中。
在第 18 天。皮肤重建的表皮由分层的角质形成细胞层组成，未分化的基底层和顺序分化的层是垂直方向的。用黑色素细胞标记物对重建切片进行染色。
黑色箭头表示的 S 100 表明黑色素细胞在表皮的基底层排列，并通过树突延伸与多个角质形成细胞交流。真皮区室包含嵌入胶原蛋白的成纤维细胞，1 型基质沉积了胶原蛋白，4 表示将表皮与真皮分开的基底膜。下图说明了表皮中多层角质形成细胞是如何发育的。
当用 GFP 慢病毒载体标记的真皮干细胞包埋成纤维细胞时。在 1 型胶原蛋白基质中，它们迁移到表皮并在第 5 天分化为黑色素细胞。接种角质形成细胞后，单个细胞开始从球体中迁移出来。
请注意，表皮仍然由单层组成。在第八天。少数细胞到达表皮真皮界面。
到第 10 天，GFP 阳性细胞在基底膜位置紧密对齐，如图所示。表皮中迁移的 GFP 阳性细胞表达黑色素细胞标志物 HMB 45。当不同阶段的黑色素瘤细胞系被纳入皮肤重建时，细胞的行为反映了它们的体内特征。
在这里，如图所示，可以看到在 2D 培养物中生长的正常黑色素细胞和黑色素瘤细胞。正常黑色素细胞的位置和生长速度在皮肤重建中受到严格控制，如图所示，径向生长期，原发性黑色素瘤主要在表皮中增殖，而垂直生长期黑色素瘤侵袭性生长到真皮中，如图所示。最后，可以在这里看到转移性黑色素瘤侵入真皮深处的方式。
我们对正常皮肤的研究为更好地了解黑色素瘤的发展和进展奠定了基础。
概述
本报告描述了一种模拟人类皮肤结构和组成的三维皮肤重建模型。该模型已被用于研究黑素细胞生理学、黑色素瘤进展和真皮干细胞命运，作为药物评估的有价值的临床前工具。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 肿瘤学
背景
- 皮肤重建模型的开发是为了更好地理解组织环境中的细胞行为。
- 正常黑素细胞和黑色素瘤细胞在培养中表现出与体内不同的行为。
- 该模型允许观察皮肤组分内的细胞迁移和分化。
- 该模型已开发了超过20年，为皮肤生物学提供了见解。
研究目的
- 生成3D人类皮肤重建用于研究黑素细胞和黑色素瘤生物学。
- 研究不同皮肤细胞类型之间的相互作用。
- 评估该模型在临床前药物测试中的实用性。
使用的方法
- 用中和的牛胶原涂层组织培养托盘。
- 使用成纤维细胞和胶原创建细胞真皮隔室。
- 用角质细胞与黑素细胞或黑色素瘤细胞混合形成表皮隔室。
- 对移植的皮肤重建进行免疫组织化学和免疫荧光分析。
主要结果
- 皮肤重建成功模仿了正常人类皮肤的结构。
- 黑素细胞和干细胞在模型中表现出迁移和分化。
- 在重建的皮肤中观察到阶段特异性的黑色素瘤表型。
- 该模型在临床前药物评估中被证明是有效的。
结论
- 3D皮肤重建模型是研究皮肤生物学的有价值工具。
- 它提供了关于黑素细胞行为和黑色素瘤进展的见解。
- 该模型可以促进新的治疗策略的开发和测试。
常见问题
Executive Industry Relevance
The three-dimensional human skin reconstruct model enables predictive, human-relevant investigation of melanocyte biology and melanoma progression, overcoming translational limitations of 2D cultures and murine systems. This model supports mechanistic de-risking and target validation for early-stage oncology and dermatology pipelines. Its ability to recapitulate native cell-cell and cell-matrix interactions provides a robust platform for portfolio triage and preclinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of melanocyte homeostasis and melanoma initiation in a physiologically relevant context.
- Supports functional validation of targets by modeling cell migration, differentiation, and tumor progression.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing stage-specific melanoma phenotypes in human-like tissue architecture.
Screening & Assay Development
- Provides a validated 3D system for quantitative assessment of cell behavior and compound effects.
- Enables reproducible measurement of cell localization, proliferation, and invasion across experimental conditions.
- Supports assay standardization for downstream screening of candidate therapeutics targeting skin or melanoma biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant human skin architecture, improving translational confidence over murine models.
- Allows for evaluation of stem cell migration and differentiation, supporting biomarker discovery and validation.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates by modeling metastatic potential and tumor microenvironment interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This 3D skin reconstruct model bridges early discovery, target validation, and preclinical research for skin and melanoma programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell-cell and cell-matrix interactions in human skin context.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for compound evaluation and phenotypic screening.
- Analytics: Enables immunohistochemical and immunofluorescent readouts for comparative analysis of cell states and tumor progression.
- Translational Research: Provides continuity from in vitro discovery to in vivo-like validation, enhancing predictive value for clinical translation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to diverse cell types and disease models within dermatology and oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in skin and melanoma research.
- Operational Value: Standardizes complex tissue modeling, improving reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing human-relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates targeting skin and melanoma biology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, tissue engineering, and histological analysis.
- Demands access to specialized tissue culture infrastructure and imaging platforms for endpoint analyses.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various cell types and disease models, but optimization may be needed for specific research questions.
- Limitations include the need for technical skill in 3D culture and potential variability in primary cell sources.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Dermal Layer Preparation
3:22
Generation of the Epidermis
5:21
Day 18 Skin Reconstruct Harvesting and Sectioning
7:01
Graft a Skin Reconsruct on a Mouse
8:42
Representative Skin Reconstructs of Normal Melanocytes, Dermal Stem Cells and Melanoma Tumors
10:43
Conclusion
