FSL构建体：一种在不影响细胞/病毒体活力的前提下，通过多种生物标记物修饰其表面的简易方法

本实验的总体目标是利用生物活性构建物对活细胞或S的表面进行无害且快速的标记。首先制备功能化间隔物、脂质或FSL构建物溶液，然后将等体积的构建物溶液与细胞或VIRs溶液混合。

第三步是将混合物在 37 摄氏度下孵育 60 分钟。最后一步是洗涤经修饰的细胞或 cytes 或修饰的 VIRs 或 VIRs，并像常规一样用于实验。最终，可通过所有常规实验分析技术（包括流式细胞术、显微镜检查和凝集反应）对表面修饰的活细胞或 S 进行可视化观察。

与共价标记等现有方法相比，该技术的主要优势在于其快速、稳健、灵活，且不会影响修饰细胞或Varian的活力。首先，为制备FSL构建体的储备液，向产品瓶中加入1毫升稀释剂，以重悬干燥的FSL产品，制成1毫克/毫升的储备溶液。将小瓶超声处理30秒，将储备液分装至每份100微升的无菌容器中，并于2至8摄氏度保存，最多可保存一周。

为准备用于插入的FSL构建体工作液，在使用前再次将溶液超声处理30秒，以混匀可能存在的聚集体，然后将FSL构建体和缓冲液稀释至所需浓度。将工作液在2至8摄氏度保存，最多可保存一周。在无脂培养基或PBS中重悬后，离心细胞以去除未结合的脂质，用于FSL修饰。随后将细胞重悬于100微升稀释液中，并在相同条件下洗涤对照组细胞，获得100微升未修饰的细胞。

根据需要加入100微升适当稀释的FSL溶液。同时，使用无关的FSL溶液和/或PBS制备阴性对照。然后在37°C孵育一小时，孵育后对所有细胞亚群进行后续处理。

用无脂培养基或 PBS 将所有细胞洗涤两次，以去除任何游离的 FSL 结构，并在无脂培养基中制备适当的悬浮液。一旦 FSL 修饰过程完成，这些细胞可以在 4 至 8 摄氏度下像花朵一样保存。FSL 结构包含三个主要组分：功能头部（F），其可以是多种生物功能基团。

设计间隔基团RS，用于使功能头部远离膜结构，以提高水分散性，并确保其不与人血清及DAL脂质或L发生反应，从而使该构建体能够自发地整合到表面四。以下五张图像展示了典型的FSL基团。活体小鼠胚胎在无血清细胞培养基中，通过37摄氏度孵育两小时的方法，直接用FSL荧光素标记，随后洗涤并进行荧光显微镜观察。

在第一张图像中，可以看到一个未使用ZOP PALITA的二细胞镜像胚胎。胚胎中部的强染色代表典型的极体染色。在接下来的两张图像中，展示了未使用ZOP PALITA的四细胞和八细胞镜像胚胎，其中位于显微镜焦平面之外的细胞呈现出模糊的染色现象。

在此最后一张图像中，显示了一个 zop palita 自由 16 细胞镜像胚胎的图像，接下来的一系列图像展示了完整镜像囊胚期胚胎，这些胚胎为受精后四到五天的 FSL 荧光素标记的活体镜像胚胎，同时标记了胚胎和 zop LUCITA。图中还展示了斑马鱼的 FSL 荧光素标记。第一张图像是受精后 52 小时斑马鱼幼鱼的微血管造影图像，其中已将 FSL 荧光素直接注入循环系统。

此处可观察到斑马鱼血管系统的染色情况。FSL 荧光素、异质性斑马鱼肾组织细胞或 ZK 细胞在体外生成后，显微注射至受精后 52 小时的斑马鱼受体体内。注射后两小时，通过荧光下延时显微成像对 ZK 细胞进行活体观察。图中显示的是单帧视频图像，其中移动缓慢或静止的大细胞以橙色箭头标示，而因快速移动呈现模糊状的细胞以绿色箭头标示。本图像展示了通过将斑马鱼胚胎浸入含 FSL 荧光素的培养基中最多五天，经口服摄取该结构实现 FSL 荧光素标记的结果。

左侧经 FSL 荧光素处理的斑马鱼明场显微图像对应于右侧相邻的荧光图像。荧光信号主要定位于肠道区域。在此展示的未经处理的对照胚胎中未观察到染色。

此处将水疱性口炎病毒（VSV）在37摄氏度下用10微克/毫升的FSL荧光素直接标记两小时，随后用4%多聚甲醛固定，再通过流式扫描分析，显示无需对VSV病毒颗粒进行纯化。FSL标记后必须进行此操作。该直方图显示了感染了经FSL荧光素标记的人流感病毒A/波多黎各/8/1934（H1N1）的猪睾丸细胞。

未感染且不发荧光的细胞由黑线表示，而H1N1冠状病毒与猪细胞融合后产生荧光，由红线表示。在接下来的一系列图像中，细胞首先在37摄氏度下用FSL生物素标记1小时，随后洗涤，并与荧光素四标记的亲和素反应，再次洗涤后进行湿封片，用于荧光显微镜观察。第一张图像显示的是小鼠胚泡的共聚焦显微镜合成图像，而本图展示的是上一幅图像中胚胎的中央共聚焦切片。

此处为活动的人类精子。由于精子的运动，图像出现模糊。在此图中，可观察到插入后经4%多聚甲醛固定的、形态更清晰的人类精子代表性图像。

使用FSL生物素标记的人类红细胞经4%多聚甲醛固定后，在插入前后的FSL标记不受影响，如下方两幅图所示。在此处，可见经4%多聚甲醛固定的RL 95人子宫内膜癌细胞；而在另一幅图像中，RL 95人子宫内膜癌细胞未经固定。两幅图像中，无论是否固定，标记效果几乎无差异。

静脉输注细胞后两小时采集的血样中观察到的FSL生物素标记红细胞如左图所示，右图为同一视野下通过光学显微镜观察的细胞图像，而通过荧光显微镜观察时，两个标记细胞呈绿色，可被识别。通过计算标记细胞与未标记细胞的比例，可作为细胞存活率的指标。最后一张FSL生物素标记细胞图像显示的是通过与阻断珠结合而实现可视化的活体人子宫内膜生物素标记细胞。

这最后一组图像展示了FSL构建体与血型标志物的相互作用。第一张图像显示了用500微克/毫升浓度的FSLG包被的人类红细胞GLI细胞，与不同稀释度的人类血清进行反应的结果。人类红细胞本身不会与Xena抗原GALI抗原发生天然反应。

因此，可利用细胞来定量血清中的抗体水平。在此示例中，通过使用逐渐降低浓度的FSL制备细胞，确定该患者的抗原滴度为1:32。类似于抗原滴度的测定，可确定用于检测抗体的最佳抗原浓度，并制备细胞，使其仅在抗体水平超过特定滴度时才呈现阳性结果。

产生阳性结果所需的FSL抗原水平取决于所检测抗体的质量和浓度。通常对于碳水化合物抗原，浓度为每毫升100微克的FSL溶液将产生强阳性反应。经修饰后带有特定水平a抗原的人O型红细胞被称为标准化红细胞。

将红细胞用于准确且可重复地定量人血清中的抗体。在此示例中，红细胞由供体自身的红细胞制备，检测的O型血清中抗体水平为1至32。图中第六管显示，将A型和B型血型抗原同时插入单个O型红细胞样本中，用于制备弱A、弱B红细胞。

这些细胞可用于VO质量控制。将特制的A周细胞和B周细胞分别与抗A和抗B试剂进行检测，可得到预期的弱反应，如本图所示，反应发生在试管的中下部区域。若操作得当，该简单技术可在两小时内完成。