Name: FSL，构造一个简单方法修改细胞/病毒粒子表面的生物标志物的范围:在不影响他们的生存能力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 了解如何使用FSL构建物对活细胞和病毒粒子进行无害且快速的表面标记。该方法通过简单接触实现稳定整合，不影响细胞活力，适用于流式细胞术和显微镜观察等多种实验分析。

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作者感谢 Sigma-Aldrich 的 Dan Bess 参与本视频的制作。同时感谢 Don Branch、Evgenii Cherny、Scott Chesla、Elizabeth Hadac、Amanda Harrison、Damien Heathcote、Annika Hult、Chuan-Ching Lan、Susannah McIntosh、Sarvani Komarraju、Elena Korchagina、Caroline Oliver、Martin Olsson、Stephen Parker、Igor Rodinov、Alexander Tuzikov 和 Eleanor Williams 在 FSL 构建体的设计、合成以及生物学活性测定方面所提供的结果与贡献。

以下方案描述了将 FSL 结构（图 1）插入生物膜的一般操作流程。为简便起见，本方案仅以浓度为 100% 的细胞（kodecyte）为例进行说明。然而，“细胞”一词可与病毒颗粒（kodevirion）、生物体或细胞结构互换使用，且其在稀释液中的浓度并不关键，只要在测试、对照和实验之间始终保持一致即可。对于红细胞，其压积体积通常为 80%，而对于病毒颗粒、胚胎及其他细胞，该值通常低于 1%。该方法具有很强的稳健性，无论采用何种变体操作均可实现膜的修饰，但需进一步优化和标准化，以满足特定应用所需的修饰程度。
1. FSL 结构的制备
<ol>
	<li>配制FSL构建体储备液时，首先向产品小瓶中的干燥FSL产品（见表1）加入1.0 mL稀释液（或按照产品说明书指定体积）进行重悬。短暂超声处理（30秒），即可得到浓度为1 mg/mL的溶液。该溶液可分装至100 μL无菌容器中，于2–8°C保存最多一周，或冷冻保存最多3个月。</li>
	<li>在使用前，为制备用于插入的FSL构建体工作液，需对储备液进行短暂超声处理（30秒），以均一化可能形成的胶束。随后将FSL构建体用缓冲液（建议不含脂质或高度疏水性物质）稀释至所需浓度，或根据需要稀释成不同浓度梯度。</li>
</ol>
注意事项：
<ol>
	<li>FSL 构建体通常可在含脂质的培养基中插入细胞，但其工作浓度通常需要比在 PBS 或其他无脂质培养基中高出约 50 倍。</li>
	<li>工作浓度的稀释范围取决于具体应用、检测方法的灵敏度、FSL 构建体的类型以及所需的修饰程度。通常情况下，糖类 FSL 构建体的稀释浓度范围为每毫升稀释液含 10–500 μg FSL，而荧光基团和生物素等其他 FSL 构建体则为 1–100 μg/mL。</li>
	<li>若配制含有多种 FSL 构建体的插入用稀释液，可将各构建体以其常规工作浓度共同加入同一稀释液中。若某一构建体的浓度远高于另一构建体，则可能需要适当调整（提高）浓度较低的构建体的浓度。或者，也可依次加入构建体，建议先加入浓度较高的构建体，再加入浓度较低的构建体。</li>
	<li>FSL 构建体浓度超过 1000 μg/mL 时，可能会向细胞膜引入大量脂质，从而改变细胞形态，或使其更易发生裂解。</li>
	<li>FSL 构建体工作溶液应储存于 2–8°C，并在数天内使用完毕。</li>
	<li>FSL 构建体可用水稀释，但稳定性会降低，必须在数小时内使用完毕。若产品说明书注明水为重悬稀释液，则瓶中内容物亦将含有盐类（具体成分见产品说明书）。</li>
</ol>
2. 将FSL构建体插入膜中
<ol>
	<li>首先通过离心，使用 PBS 或无脂细胞培养基作为洗涤液，将细胞洗涤以去除未结合的脂质，为 FSL 修饰做准备。</li>
	<li>将细胞沉淀或重悬于 100 μL 稀释液中。</li>
	<li>同时制备对照组，理想情况下应包括未经修饰的细胞（用 PBS 而非 FSL 溶液孵育）和/或用一种无害但相关的 FSL 构建体修饰的细胞。</li>
	<li>向细胞中加入 100 μL 适当稀释的 FSL 溶液（含有 1 种或多种 FSL 构建体），在 37°C 下孵育 1–2 小时。若在 25°C 下孵育 6 小时或在 4°C 下过夜（18 小时）也可获得类似结果；若使用高密度细胞悬液，建议每隔几小时混匀一次。</li>
	<li>用 PBS 或培养基洗涤两次（可选），以去除未结合的 FSL 构建体，并制备适当的细胞悬液。</li>
</ol>
注意事项：
<ol>
	<li>用于悬浮细胞的稀释液可以是细胞培养基、PBS、细胞保存液等，但最好不含脂类（如胎牛血清）或去垢剂（如吐温）。</li>
	<li>可使用不同体积（非100 μL）、不同比例（非1:1 细胞/FSL溶液）或不同的孵育时间和温度条件，但为获得可重复的结果，必须保持相同的比例、浓度和体积。</li>
</ol>
3. 操作与可视化
<ol>
	<li>FSL 修饰过程完成后，kodecyte 可在无脂培养基中于 4–8°C 下保存，或直接使用。</li>
	<li>kodecyte 和 kodevirion 通常与未修饰的细胞/病毒行为一致，可在常规检测系统（显微镜、血清学、流式细胞术等）下进行操作和观察。通常无需特殊处理，只需避免使用可能将脂质结构从膜上洗脱的溶剂、去污剂或脂类。</li>
</ol>
注意事项：
<ol>
	<li>构建体在无脂培养基中储存时，可在无活性细胞（如红细胞）的膜上保持稳定，持续整个细胞生命周期。在具有活跃细胞膜的细胞中，构建体会以依赖于细胞膜活性的速率被内化并代谢。 </li>
	<li>死细胞通常含有较高水平的FSL构建体；可利用这一特性将非活细胞与活细胞分离开来。 </li>
	<li>如果kodecyte被储存（或使用） 体内在含有脂质的培养基或环境（如血清/血浆）中，该构建体会在数小时至数天内从膜上缓慢释放，具体时间取决于温度以及脂质的浓度和组成。 </li>
</ol>
4. 代表性结果：
<ol>
	<li>以下代表性结果取决于所使用的构建体（表1）、其插入浓度以及检测系统相对的灵敏度和特异性。通常情况下，所有FSL构建体在1小时后均可插入细胞，但每种具体情况的最佳条件需另行确定。</li>
	<li>FSL构建体可用于标记多种活细胞的外表面3-9,11,14。图2所示示例中使用了不同发育阶段的胚胎（因其为脆弱细胞），但其他细胞（图3）或包膜病毒颗粒（图4）也可进行标记。FSL-荧光素可实现对表面的直接标记（图2-4），而FSL-生物素及其他FSL构建体可能需要使用二级检测系统（通常为亲和素/抗体/凝集素）以显示其存在（图5）。</li>
	<li>可将人或动物特异性的血型标志物连接至细胞，包括红细胞4-9（图6）。由于kodecyte上FSL构建体的含量可控且可重复4-6，因此可制备用于抗体定量的kodecyte（表2和图6）。细胞的实际来源并不重要，可以是任何物种，甚至可与抗体来源相同，从而确保唯一不相容的抗原仅由FSL引入7,8（图6）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="FSL-A(tri) kodecyte 在单克隆抗-A 稀释系列中的检测结果，表格格式，数据分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 2"> 
表 2. 三种不同 FSL-A(tri) 红细胞 kodecyte 与单克隆抗-A 稀释液反应的代表性血清学结果。将 50 μM 的 FSL-A(tri) 溶液与等体积的 O 型红细胞孵育后，可产生强 A 抗原阳性的细胞，该阳性反应可被 1:512 稀释度的单克隆抗-A 检测到。而 5 倍和 10 倍稀释的 FSL-A(tri) 溶液所产生的 kodecyte 表达的 A 血型抗原水平较低。
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="化学结构图；脂质间隔基在植物生物学中的功能关系。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="FSL 构建体示意图"> 
图1. FSL 构建体示意图。FSL 构建体形似花朵，由三个主要部分组成：功能头部（F），在本例中可为多种不同的生物活性基团；间隔基（S），用于将功能头部与膜保持一定距离，增强水分散性，并避免与血清发生反应；二酰基脂质部分则使整个构建体能够自发地插入各种表面。 （I）FSL-GB3，其功能头部为血型抗原 Gb3（或 Pk）三糖表位 Galα4Galβ4Glcβ。 （II）FSL-A(tri)，其功能头部为血型A抗原三糖表位 GalNAcα3(Fucα2)Galβ。 （III）FSL-荧光素。 （IV）FSL-生物素，其功能头部为单个生物素（biotin）F基团。 结构I至III中的功能基团连接至活化的二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）戊二酸衍生物，而结构IV中的间隔基则基于羧甲基甘氨酸-戊二酸。
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="受精卵细胞分裂阶段荧光显微镜图像；细胞有丝分裂，发育生物学。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="FSL-荧光素标记的小鼠胚胎"> 
图2. FSL-荧光素标记的小鼠胚胎。所有图像均为活体胚胎，其在透明带（ZP）完整时即被标记（即FSL探针穿过透明带对内部胚胎进行标记）。图像I-IV为在FSL-荧光素标记后，通过酸性泰罗德液去除透明带所释放的无透明带胚胎。无论胚胎在标记时透明带是否完整，其染色结果均相同。胚胎直接在无血清细胞培养基中，于37°C孵育2小时完成FSL-荧光素标记，随后洗涤并在荧光显微镜下观察。（I）无透明带的二细胞期小鼠胚胎，同时显示典型的强极体染色。（II-III）无透明带的四细胞期和八细胞期小鼠胚胎，均可见部分细胞因偏离显微镜焦平面而呈现模糊染色。（IV）无透明带的十六细胞期小鼠胚胎。（V）透明带完整的囊胚期小鼠胚胎（d4-d5），胚胎本身和透明带均被标记。
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="斑马鱼荧光显微镜观察；组织中GFP表达；实验图像系列" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="FSL-荧光素与斑马鱼"> 
图3. FSL-荧光素与斑马鱼14.（I）将FSL-荧光素直接注射至血液循环中，对52小时受精后（hpf）的斑马鱼幼鱼进行微血管造影。斑马鱼的血管系统被染色。（II）利用FSL-荧光素制备异源性斑马鱼肾组织细胞（ZK kodecytes） 离体 然后微注射到52 hpf受体斑马鱼的循环系统中。 体内 注射后2小时，通过延时荧光显微成像观察ZK kodecyte在血管系统中的分布。图中显示单帧视频图像，可见大而移动缓慢或静止的细胞（橙色箭头指示）以及快速移动的细胞（因运动导致图像模糊——绿色箭头指示）。标记技术可实现对细胞的实时追踪 体内 对ZK kodecytes的行为与生物分布进行观察。（III）通过将斑马鱼胚胎浸入含FSL-荧光素的培养基中长达5天，实现FSL-荧光素的口服摄取。洗脱过程通过将胚胎转移至不含FSL结构的培养基中完成（至少需要6小时，也可持续数天）。（IIIa）经FSL-荧光素处理的斑马鱼在明场显微镜下的图像，对应于相邻的荧光图像（IIIb）。荧光信号主要定位于肠道。在未经处理的对照组胚胎中未观察到染色（IVa和IVb）。
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="病毒颗粒和细胞荧光的流式细胞术图谱，比较VSV、共价标记病毒颗粒及感染效应。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="FSL-荧光素标记病毒颗粒"> 
图4. FSL-荧光素标记病毒颗粒10 VSV 和 H1N1。（I）水疱性口炎病毒（VSV）在37°C下直接用10 μg/mL FSL-荧光素标记2小时，随后用4%多聚甲醛固定并进行流式细胞术检测。FSL标记后的VSV kodevirion无需进一步纯化。（II）用FSL-荧光素标记的人源A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) kodevirion感染猪睾丸细胞后的流式细胞术分析。未感染细胞显示为黑线，而H1N1 kodevirion与ST细胞融合后产生荧光细胞（红线）。
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="荧光显微镜下的细胞分裂阶段，有丝分裂各期示意图，生物学实验。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="FSL-biotin 标记的细胞"> 
图 5. 使用 FSL-biotin 标记细胞，随后通过标记的亲和素进行可视化7,8。所有细胞首先在 37°C 下用 FSL-biotin 标记 1 小时，洗涤后与荧光染料标记的亲和素反应，再次洗涤并湿封片用于荧光显微镜观察。（I）小鼠胚胎囊胚的共聚焦显微图像整合图。（II）上一幅图像中胚胎的中央共聚焦切片。（III）活体运动的人类精子——由于其运动导致图像模糊。（IV）固定后（插入后用 4% 多聚甲醛固定）的人类精子。（V）人类红细胞。（VI）固定后（插入前用 4% 多聚甲醛固定）的人类子宫内膜癌 RL95 细胞。（VII）未固定的 RL95 人类子宫内膜癌细胞系。（VIII）在静脉输注 kodecytes 后 2 小时采集的血样中观察到的生物素标记的红细胞（kodecytes），其中（VIIIa）为明场显微镜下观察的视野，而（VIIIb）为同一视野在荧光显微镜下的图像，可识别出视野中存在的两个 kodecytes。通过计算 kodecytes 与未标记细胞的比例，可作为其存活率的指标。（IX）通过与亲和素包被的微珠结合而可视化的人类子宫内膜活体生物素 kodecytes。
<img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="血液抗原-抗体反应测试结果、血清稀释及小瓶中FSL-Lea的测定" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="FSL-碳水化合物用于添加血型标志物以进行血清学分析"> 
图6. FSL-碳水化合物用于添加血型标志物以进行血清学分析。(I) 使用固定浓度的FSL-Galili（500 μg/mL）制备人红细胞Galili kodecyte，并用其检测不同稀释度的人血清。人类红细胞天然不表达异种抗原Galili抗原。此类kodecyte可用于定量血清中的抗体水平。本示例中，供体的抗Galili抗体滴度被确定为1:32。(II) 通过使用递减浓度的FSL（“抗原滴定”）制备kodecyte，可确定检测抗体的最佳抗原浓度（本例中为Lea）。kodecyte可被设计为仅在抗体水平超过特定滴度时才呈现阳性结果。产生阳性反应所需的FSL抗原浓度取决于待检测抗体的质量和浓度。对于碳水化合物抗原，通常使用100 μg/mL的FSL溶液即可获得强阳性反应。(III) 将O型人红细胞修饰为具有特定水平的A抗原（标准化A型kodecyte），用于准确且可重复地定量人血清中的抗A抗体。本示例中，所测O型血清的抗A抗体滴度为1:32，且kodecyte由供体自身的红细胞制备而成。(IV) 将A和B血型抗原同时插入同一份O型红细胞样本中，以制备AweakBweak kodecyte。此类kodecyte可用于ABO血型系统的质量控制。本结果展示了特异性配制的AweakBweak kodecyte与抗A和抗B试剂反应的分析，呈现出预期的弱阳性反应。

<ol><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Strable, E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+viruses+and+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of viruses and virus-like particles.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 327, 1-21 (2009).</li>
<li>Henry, S., Bovin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+synthetic+peptidolipids%2C+glycolipids+and+other+lipid-linked+structures+to+create+designer+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">The development of synthetic peptidolipids, glycolipids and other lipid-linked structures to create designer red cells.</a> Transfusion. 48, Suppl 2S. 194A-194A (2008).</li>
<li>Frame, T., Carroll, T., Korchagina, E., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+glycolipid+modification+of+red+blood+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Synthetic glycolipid modification of red blood cell membranes.</a> Transfusion. 47, 876-882 (2007).</li>
<li>Hult, A. K., Frame, T., Henry, S., Olsson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+evaluation+of+red+blood+cells+transformed+with+variable+amounts+of+synthetic+A+and+B+glycolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry evaluation of red blood cells transformed with variable amounts of synthetic A and B glycolipids.</a> Vox Sang. 95, Suppl 1. 180-180 (2008).</li>
<li>Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+red+blood+cells+for+laboratory+quality+control+use%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Modification of red blood cells for laboratory quality control use.</a> Curr. Opin. Hematol. 16, 467-472 (2009).</li>
<li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+neutralization+of+anti-A+and+successful+transfusion+of+A+antigen+incompatible+red+cells+in+an+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">In vivo neutralization of anti-A and successful transfusion of A antigen incompatible red cells in an animal model.</a> Transfusion. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+transfusion+reactions+and+predicting+in+vivo+cell+survival+with+kodecytes%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Modeling transfusion reactions and predicting in vivo cell survival with kodecytes.</a> Transfusion. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Heathcote, D., Carroll, T., Wang, J. J., Flower, R., Rodionov, I., Tuzikov, A., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antibody+screening+cells%2C+MUT%2BMur+kodecytes%2C+created+by+attaching+peptides+onto+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Novel antibody screening cells, MUT+Mur kodecytes, created by attaching peptides onto erythrocytes.</a> Transfusion. 50, 635-641 (2010).</li>
<li>Hadac, E. M., Federspiel, M. J., Chernyy, E., Tuzikovb, A., Korchagina, E., Bovin, N. V., Russell, S. J., Henry, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+and+radiolabeled+Function-Spacer-Lipid+constructs+allow+for+simple+in+vitro+and+in+vivo+bioimaging+of+enveloped+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescein and radiolabeled Function-Spacer-Lipid constructs allow for simple in vitro and in vivo bioimaging of enveloped virions.</a> J Virol Meth. 10, Forthcoming (2011).</li>
<li>Blake, D., Lan, A., Love, D., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore-kodecytes+-+fluorescent+function-spacer-lipid+%28FSL%29+modified+cells+for+in+vitro+and+in+vivo+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J.%22%5BJournal%5D)">Fluorophore-kodecytes - fluorescent function-spacer-lipid (FSL) modified cells for in vitro and in vivo analyses.</a> FEBS J.. 277, Suppl 1. 199-199 (2010).</li>
<li>Harrison, A. L., Olsson, M. L., Brad Jones, R., Ramkumar, S., Sakac, D., Binnington, B., Henry, S., Lingwood, C. A., Branch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+globotriaosylceramide+analogue+inhibits+HIV-1+infection+in+vitro+by+two+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A synthetic globotriaosylceramide analogue inhibits HIV-1 infection in vitro by two mechanisms.</a> Glycobiology. 27, 515-524 (2010).</li>
<li>Barr, K., Diegel, O., Parker, S., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function-Spacer-Lipid+%28FSL%29+constructs+enable+inkjet+printing+of+blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Function-Spacer-Lipid (FSL) constructs enable inkjet printing of blood group antigens.</a> FEBS J. 277, Suppl 1. 235-235 (2010).</li>
<li>Lan, C. -C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Modeling+inflammatory+bowel+disease+%5B%5D%22">Modeling inflammatory bowel disease [dissertation]</a>. , University of Auckland. Auckland. (1988).</li>
</ol>

Deborah A. Blank 和 Stephen M. Henry 是 KODE Biotech Limited 的员工及股东，该公司为 KODE 技术的专利持有者。Dan Bess 是 Sigma-Aldrich 的员工，该公司赞助了本视频文章的制作。

使用FSL结构修饰细胞和病毒颗粒是一种非常简单且稳健的技术3-11。为了描述和区分经FSL结构修饰的细胞与未修饰细胞，分别将其称为kodecyte和kodevirion6-10，但前提是必须能够证明所引入的功能基团存在于其膜上。当使用不同浓度的FSL结构制备kodecyte时，可根据制备时所用FSL结构溶液的浓度来命名，例如15 μg/mL A kodecyte；若使用了多种FSL结构，则可采用组合命名方式，例如A+biotin kodecyte7,8。当需要比较不同类型的细胞时，建议在描述中包含细胞类型，例如red cell biotin kodecyte或endometrial biotin kodecyte7,8。
尽管插入过程具有很强的稳健性，在4–37°C的广泛温度范围内，数分钟至数小时内均可发生插入（尽管速率不同），但为了获得可重复的插入效果，必须严格控制接触时间、温度、FSL浓度（包括稀释液配方），以及在较小程度上的细胞浓度。迄今为止，所有FSL构建体均可通过相同的技术用于修饰细胞4-11，但预计某些条件可能更有利于实验流程和/或待修饰细胞/病毒颗粒的最佳操作要求。实现预期效果所需的确切FSL浓度需由使用者自行确定4。经FSL构建体修饰后的细胞/病毒颗粒通常可在生物学或分析系统中以与未修饰细胞/病毒颗粒相同的方式使用4-11。由于FSL构建体会在接触脂质溶液时缓慢从修饰表面解离7,8，或被活细胞消耗11，因此在评估随时间变化的信号或活性水平时必须考虑这些因素。插入完成后，Kodecyte可在固定剂不含脂质解离溶剂且功能基团与固定剂相容的前提下进行固定（例如使用戊二醛/福尔马林）。此外，也可对已固定的细胞进行FSL构建体修饰。
除了修饰细胞和病毒颗粒表面外，FSL 构建体还可直接注入实验动物的循环系统，从而实现循环细胞的体内修饰7，并抑制病毒12、毒素12和抗体7。FSL 构建体还曾用于修饰脂质体，并可打印到纸张表面13，在表面固定后可用于诊断检测。
利用种类日益丰富的FSL构建体对活细胞进行简便修饰的能力，将为细胞表面生物学的研究提供一种有用的研发工具。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;西格玛名称&lt;/strong&gt;</td><td>公司</td><td>&lt;strong&gt;西格玛产品编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;构建体（KODE Biotech 名称）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>FSL-A(tri)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9307%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">F9307&lt;/a&gt;</td><td>FSL-A(GALNa3[Fa2]GALb)-SA1-L1</td></tr><tr><td>FSL-B(tri)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9557%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">F9557&lt;/a&gt;</td><td>FSL-B(GALa3[Fa2]GALb)-SA1-L1</td></tr><tr><td>FSL-GB3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9807%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">F9807&lt;/a&gt;</td><td>FSL-GB3(GALa4GALb4GLCb)-SA1-L1</td></tr><tr><td>FSL-Lea(tri)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9682%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">F9682&lt;/a&gt;</td><td>FSL-LEA(GALb3[Fa4]GLCNb)-SA1-L1</td></tr><tr><td>FSL-biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9182%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">F9182&lt;/a&gt;</td><td>FSL-CONJ(1Biotin)-SC2-L1</td></tr><tr><td>FSL-Galili</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F9432%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12351">F9432&lt;/a&gt;</td><td>FSL-GALILI(GALa3GALb4GLCNb)-SA1-L1</td></tr><tr><td>FSL-Fluorescein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F1058%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12352">F1058&lt;/a&gt;</td><td>FSL-FLRO4(fluorescein)-SA2-L1</td></tr><tr><td colspan="4">表 1。</td></tr></tbody></table>

fsl构建体：一种在不影响细胞/病毒体活力的前提下，通过多种生物标记物修饰其表面的简易方法

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

修饰/可视化生物表面的能力，随后在多种条件下研究经修饰的细胞/病毒颗粒 体外 和 体内 环境对于深入了解特定分子或整个实体的功能至关重要。生物表面修饰的研究通常局限于对生物体进行基因工程改造，或在细胞表面共价连接化学基团。1,2然而，这些传统技术会使细胞暴露于化学反应物中，或需要进行大量操作才能达到预期效果，因而过程繁琐，并且还可能无意中影响经修饰细胞的活力或功能。因此，亟需一种简单且无害的细胞表面修饰方法。
最近，一种名为KODE技术的新技术推出了一系列包含三个组分的新型结构：功能头基（F）、间隔基（S）和脂质尾基（L），这类结构被称为功能-间隔-脂质（Function-Spacer-Lipid，FSL）结构3。所选的间隔基（S）可使该结构在水中具有良好的分散性，同时能够自发且稳定地嵌入细胞膜中。
目前，FSL 构建体的功能基团（F）已涵盖多种糖类，包括与血型相关的决定簇、唾液酸、透明质酸多糖、荧光染料、生物素、放射性标记物以及多种肽段3-12。FSL 构建体已被用于修饰胚胎、精子、斑马鱼、上皮/子宫内膜细胞、红细胞和病毒颗粒，以构建质控系统和诊断检测面板，用于调控细胞黏附/相互作用/分离/固定，并实现细胞/病毒颗粒的体外（in vitro）和体内（in vivo）成像3-12。
修饰细胞/病毒颗粒的过程具有通用性且极为简单。最常用的方法是将细胞（置于无脂培养基中）与FSL构建物溶液在37°C下孵育1至2小时4-10。孵育期间，FSL构建物会自发插入细胞膜中，修饰过程即告完成。洗涤步骤为可选。经FSL构建物修饰的细胞称为kodecytes6-9，而修饰后的病毒颗粒则称为kodevirions10。
FSL 结构物作为直接输注剂以及 kodecyte/kodevirion 已在实验动物模型中得到应用7,8,10。所有 kodecyte/kodevirion 似乎均能保持其正常的活力和功能，同时获得 F 基团的新功能7,8,10,11。
FSL 结构在生物相容性介质中具有良好的分散性，可自发整合到细胞膜中，且表现出较低的毒性，因此成为研究细胞和病毒颗粒的宝贵研究工具。

功能-间隔基-脂质（FSL）构建体可在不丧失活力的情况下修饰活细胞和病毒颗粒的表面特性。该方法仅需将FSL构建体溶液与细胞/病毒颗粒接触，即可实现自发且稳定的表面整合。

FSL构建体：一种在不影响细胞/病毒体活力的前提下，通过多种生物标记物修饰其表面的简易方法

对生物表面进行修饰/可视化，并在多种体外和体内环境中研究经修饰的细胞/病毒颗粒，是必不可少的……

本实验的总体目标是利用生物活性构建物对活细胞或S的表面进行无害且快速的标记。首先制备功能化间隔物、脂质或FSL构建物溶液，然后将等体积的构建物溶液与细胞或VIRs溶液混合。第三步是将混合物在 37 摄氏度下孵育 60 分钟。最后一步是洗涤经修饰的细胞或 cytes 或修饰的 VIRs 或 VIRs，并像常规一样用于实验。最终，可通过所有常规实验分析技术（包括流式细胞术、显微镜检查和凝集反应）对表面修饰的活细胞或 S 进行可视化观察。与共价标记等现有方法相比，该技术的主要优势在于其快速、稳健、灵活，且不会影响修饰细胞或Varian的活力。首先，为制备FSL构建体的储备液，向产品瓶中加入1毫升稀释剂，以重悬干燥的FSL产品，制成1毫克/毫升的储备溶液。将小瓶超声处理30秒，将储备液分装至每份100微升的无菌容器中，并于2至8摄氏度保存，最多可保存一周。为准备用于插入的FSL构建体工作液，在使用前再次将溶液超声处理30秒，以混匀可能存在的聚集体，然后将FSL构建体和缓冲液稀释至所需浓度。将工作液在2至8摄氏度保存，最多可保存一周。在无脂培养基或PBS中重悬后，离心细胞以去除未结合的脂质，用于FSL修饰。随后将细胞重悬于100微升稀释液中，并在相同条件下洗涤对照组细胞，获得100微升未修饰的细胞。根据需要加入100微升适当稀释的FSL溶液。同时，使用无关的FSL溶液和/或PBS制备阴性对照。然后在37°C孵育一小时，孵育后对所有细胞亚群进行后续处理。用无脂培养基或 PBS 将所有细胞洗涤两次，以去除任何游离的 FSL 结构，并在无脂培养基中制备适当的悬浮液。一旦 FSL 修饰过程完成，这些细胞可以在 4 至 8 摄氏度下像花朵一样保存。FSL 结构包含三个主要组分：功能头部（F），其可以是多种生物功能基团。设计间隔基团RS，用于使功能头部远离膜结构，以提高水分散性，并确保其不与人血清及DAL脂质或L发生反应，从而使该构建体能够自发地整合到表面四。以下五张图像展示了典型的FSL基团。活体小鼠胚胎在无血清细胞培养基中，通过37摄氏度孵育两小时的方法，直接用FSL荧光素标记，随后洗涤并进行荧光显微镜观察。在第一张图像中，可以看到一个未使用ZOP PALITA的二细胞镜像胚胎。胚胎中部的强染色代表典型的极体染色。在接下来的两张图像中，展示了未使用ZOP PALITA的四细胞和八细胞镜像胚胎，其中位于显微镜焦平面之外的细胞呈现出模糊的染色现象。在此最后一张图像中，显示了一个 zop palita 自由 16 细胞镜像胚胎的图像，接下来的一系列图像展示了完整镜像囊胚期胚胎，这些胚胎为受精后四到五天的 FSL 荧光素标记的活体镜像胚胎，同时标记了胚胎和 zop LUCITA。图中还展示了斑马鱼的 FSL 荧光素标记。第一张图像是受精后 52 小时斑马鱼幼鱼的微血管造影图像，其中已将 FSL 荧光素直接注入循环系统。此处可观察到斑马鱼血管系统的染色情况。FSL 荧光素、异质性斑马鱼肾组织细胞或 ZK 细胞在体外生成后，显微注射至受精后 52 小时的斑马鱼受体体内。注射后两小时，通过荧光下延时显微成像对 ZK 细胞进行活体观察。图中显示的是单帧视频图像，其中移动缓慢或静止的大细胞以橙色箭头标示，而因快速移动呈现模糊状的细胞以绿色箭头标示。本图像展示了通过将斑马鱼胚胎浸入含 FSL 荧光素的培养基中最多五天，经口服摄取该结构实现 FSL 荧光素标记的结果。左侧经 FSL 荧光素处理的斑马鱼明场显微图像对应于右侧相邻的荧光图像。荧光信号主要定位于肠道区域。在此展示的未经处理的对照胚胎中未观察到染色。此处将水疱性口炎病毒（VSV）在37摄氏度下用10微克/毫升的FSL荧光素直接标记两小时，随后用4%多聚甲醛固定，再通过流式扫描分析，显示无需对VSV病毒颗粒进行纯化。FSL标记后必须进行此操作。该直方图显示了感染了经FSL荧光素标记的人流感病毒A/波多黎各/8/1934（H1N1）的猪睾丸细胞。未感染且不发荧光的细胞由黑线表示，而H1N1冠状病毒与猪细胞融合后产生荧光，由红线表示。在接下来的一系列图像中，细胞首先在37摄氏度下用FSL生物素标记1小时，随后洗涤，并与荧光素四标记的亲和素反应，再次洗涤后进行湿封片，用于荧光显微镜观察。第一张图像显示的是小鼠胚泡的共聚焦显微镜合成图像，而本图展示的是上一幅图像中胚胎的中央共聚焦切片。此处为活动的人类精子。由于精子的运动，图像出现模糊。在此图中，可观察到插入后经4%多聚甲醛固定的、形态更清晰的人类精子代表性图像。使用FSL生物素标记的人类红细胞经4%多聚甲醛固定后，在插入前后的FSL标记不受影响，如下方两幅图所示。在此处，可见经4%多聚甲醛固定的RL 95人子宫内膜癌细胞；而在另一幅图像中，RL 95人子宫内膜癌细胞未经固定。两幅图像中，无论是否固定，标记效果几乎无差异。静脉输注细胞后两小时采集的血样中观察到的FSL生物素标记红细胞如左图所示，右图为同一视野下通过光学显微镜观察的细胞图像，而通过荧光显微镜观察时，两个标记细胞呈绿色，可被识别。通过计算标记细胞与未标记细胞的比例，可作为细胞存活率的指标。最后一张FSL生物素标记细胞图像显示的是通过与阻断珠结合而实现可视化的活体人子宫内膜生物素标记细胞。这最后一组图像展示了FSL构建体与血型标志物的相互作用。第一张图像显示了用500微克/毫升浓度的FSLG包被的人类红细胞GLI细胞，与不同稀释度的人类血清进行反应的结果。人类红细胞本身不会与Xena抗原GALI抗原发生天然反应。因此，可利用细胞来定量血清中的抗体水平。在此示例中，通过使用逐渐降低浓度的FSL制备细胞，确定该患者的抗原滴度为1:32。类似于抗原滴度的测定，可确定用于检测抗体的最佳抗原浓度，并制备细胞，使其仅在抗体水平超过特定滴度时才呈现阳性结果。产生阳性结果所需的FSL抗原水平取决于所检测抗体的质量和浓度。通常对于碳水化合物抗原，浓度为每毫升100微克的FSL溶液将产生强阳性反应。经修饰后带有特定水平a抗原的人O型红细胞被称为标准化红细胞。将红细胞用于准确且可重复地定量人血清中的抗体。在此示例中，红细胞由供体自身的红细胞制备，检测的O型血清中抗体水平为1至32。图中第六管显示，将A型和B型血型抗原同时插入单个O型红细胞样本中，用于制备弱A、弱B红细胞。这些细胞可用于VO质量控制。将特制的A周细胞和B周细胞分别与抗A和抗B试剂进行检测，可得到预期的弱反应，如本图所示，反应发生在试管的中下部区域。若操作得当，该简单技术可在两小时内完成。

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