在使用定量免疫肿瘤的异质性蛋白表达的映射

在这里，我们描述了一种方法来量化分子异质性肿瘤的材料组织部分采用定量免疫荧光图像分析，和一个异质性的统计措施。该方法用于临床生物标志物的开发和分析。

以下实验的总体目标是准确量化人类癌症整个组织切片中的生物标志物表达，以便为蛋白质表达的异质性程度分配一个数值。这是通过首先使用全玻片荧光扫描仪扫描免疫荧光标记的癌组织切片来实现的。接下来选择肿瘤内感兴趣的区域进行评估。

然后使用 aqua 分析自动图像分析系统定量浸润性肿瘤区域内目标蛋白质的表达。最终，这种方法可用于绘制癌症组织中的生物标志物表达，而癌症组织中的生物标志物表达在整个组织切片中通常非常异质。与传统方法（例如使用颜色和公制可视化试剂的免疫组织化学）相比，使用这些技术的主要优势是免疫荧光更定量且更敏感。

将这些分析方法与整个切片相结合，免疫荧光扫描能够对不同组织生物标志物表达的细微变化进行精细映射。Histo RX 实验室的直接运营总监 Mark Gustafson 首次展示了这些程序。切片机、癌组织活检切片和标本免疫荧光染色以表达感兴趣的生物标志物后，将最多五张染色切片的载玻片加载到载玻片扫描仪的载玻片盒中。

然后使用 scan scope 控制台中的界面。对于每张玻片，选择一个区域以包含玻片上的所有组织，而不管样品的染色模式或其他可观察的方面如何。接下来，使用扫描范围控制台，首先在组织的肿瘤区域内选择一个组织区域进行评估，以提供最佳表示。

现在使用扫描示波器控制台自动曝光功能，确定每个通道的曝光时间以及图像焦点，使用扫描示波器控制台图像上的蓝色菱形选择远离组织的额外区域，但仍在盖玻片下方的载玻片区域内，以定义将获取平场校正图像的背景区域。对于每个滤镜，将焦点添加到由黄色方块表示的组织区域，以优化图像捕捉。如果图像似乎具有高背景或其他图像伪影，则应移动图像区域并获取新图像。

然后扫描组织，然后将获取的数字载玻片图像自动上传到 Aperio 光谱数据库中。双击光谱程序的缩略图，从光谱数据库的数字载玻片列表中选择要分析的载玻片。然后使用随附的 h 和 d 注释图像，在荧光图像上注释感兴趣的区域。

可以在单个样品上选择用单个圆圈描绘的多个感兴趣区域。带注释的图像会自动保存到频谱数据库中。现在，当分析窗口出现时，从屏幕顶部的菜单栏中选择 Analyze，然后从下拉菜单中选择 histo RX aqua analysis。

准备好开始后，按下分析按钮，Windows 任务栏中将出现一个最小化的控制台窗口，显示将图像从 Spectrum 数据库传输到本地计算机的进度。传输数据后，将启动 aqua 分析，使用无监督的 aqua 评分算法生成 aqua 分数，该算法基于样本第一阈值的数据聚类，即背景图像信号上方的泛细胞角蛋白图像信号。这将允许使用像素来定义肿瘤掩码，然后可用于后续计算。

使用高表达全细胞角蛋白像素还可以定义肿瘤细胞的细胞质或非核区域。如图所示，肿瘤掩模内 DPI 通道中具有高信号的像素本质上被识别为核像素。如果在审核时发现由于样本或成像伪影而不适合评分的字段，则这些字段将从评分中脱敏，并且还将产生失败的最终结果。

aqua 评分的结果表示为与整个组织切片样本中感兴趣区域中的每个 512 x 512 像素平铺相关的分数表，可以保存并用于后续统计分析。这些 hemat toin 和 eoin 染色的显微照片展示了同一卵巢癌的不同区域如何表现出不同的形态。图 B 右上角的高倍视图突出显示了肿瘤上部具有细胞质透明化和固体生长模式的细胞。

然而，在图 C 的右下角放大的组织下部具有更均匀的嗜酸性粒细胞细胞质和状生长模式。在这里，化疗前后卵巢癌组织切片中 ER 表达的异质性热图分别显示在上图和下图中。请注意，从上图中具有高表达和低表达区域的截面的可变 ER 表达到下图中以红色表示的高 ER 表达的均匀分布的变化。

这种变化的数字表示在左侧用 Simpsons 指数的减少表示。在该图中，卵巢癌组织切片中 HER two 的异质性热图在治疗前后再次显示，分别在上下面板中看到。再次注意，从上图中具有高表达和低表达区域的截面上的变量 HER two 表达到下图中高 HER 2 表达的均匀分布的变化。

辛普森指数再次下降。在尝试此程序时，重要的是要记住，计算分析生成的数据质量取决于染色的质量，这必须具有很高的技术标准。