肿瘤中蛋白质表达异质性的定量免疫荧光图谱绘制

以下实验的总体目标是准确量化人类癌症组织全切片中生物标志物的表达水平，从而为蛋白质表达异质性的程度赋予一个数值。该目标首先通过使用全切片荧光扫描仪对经免疫荧光标记的癌症组织切片进行扫描来实现，随后选择肿瘤内感兴趣区域进行评估。

然后使用AQUA分析自动图像分析系统对侵袭性肿瘤区域中目标蛋白的表达进行定量。最终，该方法可用于绘制癌症组织中生物标志物的表达图谱，而这些组织在切片中通常具有高度异质性。与传统的免疫组织化学方法（如使用显色和比色可视化试剂）相比，免疫荧光技术的主要优势在于其更高的定量能力与灵敏度。

将这些分析方法与全切片免疫荧光扫描相结合，能够精细地绘制出生物标志物在组织中表达的细微差异。首次演示这些操作步骤的是 Histo RX 实验室运营总监 Mark Gustafson。在使用切片机对癌组织活检样本进行切片，并对目标生物标志物进行免疫荧光染色后，将最多五张染色切片载玻片装入扫描仪的载片盒中。

然后使用扫描仪控制台中的界面。对于每张切片，选择一个区域以包含切片上的所有组织，无需考虑染色模式或样本的其他可观察特征。接下来，使用扫描仪控制台，首先选择一个待评估的组织区域， ideally 位于组织的肿瘤区域内，以提供最佳的代表性。

现在使用扫描仪控制台的自动曝光功能，确定每个通道的曝光时间以及图像焦点。在扫描仪控制台图像上，使用蓝色菱形选择远离组织但仍位于盖玻片下玻片范围内的区域，以定义用于获取平场校正图像的背景区域。对于每个滤光片，在代表组织区域的黄色方块位置添加焦点，以优化图像采集。如果图像显示背景过高或存在其他图像伪影，应移动图像区域并重新采集新图像。

随后对组织进行扫描，并将获取的数字切片图像自动上传至 Aperio Spectrum 数据库。在 Spectrum 数据库的数字切片列表中，双击缩略图以在 Spectrum 程序中选择待分析的切片。然后，参照配套的 H 和 D 注释图像，在荧光图像上标注出感兴趣区域。

可在单个样品上选择多个由独立圆圈划定的兴趣区域。标注的图像将自动保存到光谱数据库中。当分析窗口出现时，现在从屏幕顶部的菜单栏中选择“分析”，然后从下拉菜单中选择 histo RX aqua 分析。

准备就绪后，按下分析按钮，Windows 任务栏中将出现一个最小化的控制台窗口，显示图像从 Spectrum 数据库传输到本地计算机的进度。数据传输完成后，aqua 分析将自动启动，利用基于数据聚类的无监督 aqua 评分算法生成 aqua 评分，该算法首先设定阈值，即泛细胞角蛋白图像信号高于背景图像信号。此过程可利用像素定义肿瘤掩膜，进而用于后续计算。

利用高表达的广谱细胞角蛋白像素来定义肿瘤细胞的胞质或非核区域。如图所示，DPI 通道中位于肿瘤掩膜内且信号较强的像素被识别为核内结构。如果在复查时发现某些视野由于样本或成像伪影而不适合进行评分，则这些视野将被排除在评分之外，并最终判定为不合格。

水评分的结果以表格形式呈现，表格中包含与整个组织切片样本中感兴趣区域内每个512×512像素瓦片相对应的评分，这些数据可被保存并用于后续的统计分析。这些苏木精-伊红染色的显微照片展示了同一卵巢癌样本不同区域可表现出形态学上的差异。图B右上方的高倍镜视野突出显示了肿瘤上部区域具有胞质透明和实性生长模式的细胞。

然而，图C右下部分放大的组织区域显示出更为均质的嗜酸性细胞质和乳头状生长模式。上方和下方图示分别展示了卵巢癌组织切片在化疗处理前和处理后ER表达的异质性热图。请注意，上方图中ER表达在切片不同区域呈现高低不一的分布，而下方图中则显示为高ER表达的均匀分布，以红色表示。

这种变化的数值表示在左侧通过辛普森指数的下降来标示。本图再次展示了卵巢癌组织切片中 HER2 在治疗前（上图）和治疗后（下图）的异质性热图。请注意，上图中 HER2 表达在切片不同区域呈现高低不一的可变表达模式，而下图中则转变为高表达 HER2 的均匀分布。

再次观察到辛普森指数下降。在进行此操作时，需要牢记，计算分析所产生的数据质量完全依赖于染色的质量，因此染色必须达到较高的技术水平。