Name: 秀丽隐杆线虫树突棘成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学习秀丽隐杆线虫树突棘活体成像技术，用于神经科学研究。该方法结合激光共聚焦显微镜和钙成像技术，可分析GABA能神经元中树突棘形态与钙信号动态变化。

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成像和Imaris分析在范德堡大学细胞成像共享资源中心（CIRS）完成，该中心由美国国立卫生研究院（NIH）资助（CA68485、DK20593、DK58404、DK59637和EY08126）。LSM 880显微镜由基金1S10OD201630支持。尼康转盘共聚焦成像在尼康卓越中心完成。我们感谢CISR主任Jenny Schafer和Bryan Millis提供的培训与富有见地的讨论，以及Burnette实验室成员Dylan Burnette、Aidan Fenix和Nilay Taneja提供的建议。本研究得到了美国国立卫生研究院对DMM的资助（R01NS081259和R01NS106951）以及美国心脏协会对ACC的资助（18PRE33960581）的支持。

1. DD 树突棘结构的确定
<ol>
	<li>创建转基因蠕虫以标记DD神经元树突棘
	<ol>
		<li>使用 flp-13 启动子构建用于标记物表达的载体（例如，胞质 mCherry、MYR::mRuby、LifeAct::GFP、GFP::utrophin）（图1）。完整的质粒列表见于 补充文件 1.</li>
		<li>使用既定方法构建标记DD神经元树突棘的转基因品系8,9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备封片剂
	<ol>
		<li>制作 &#65279;石蜡包埋介质1:1混合物10 （参见 材料表).</li>
		<li>将培养基加热至 60 &#176;C至完全溶解，然后分装至1.5 mL带盖微量离心管中，并将加热块温度维持在60–70 &#176;C. 
		注意：密封剂在加热块中可保存4周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备麻醉剂。
	<ol>
		<li>用蒸馏水配制储备液21% 三卡因和 1 M 左旋咪唑的 O 溶液（参见 材料表）。于 -20 保存 &#176;C.</li>
		<li>配制含有0.05%三卡因和15 mM左旋咪唑的麻醉工作液，具体步骤如1.3.3–1.3.5所述11.</li>
		<li>混合 75 &#181;1% 三卡因储存液的 L 和 22.5 &#181;1 M 左旋咪唑的 L</li>
		<li>加入M9缓冲液至终体积为1.5 mL。</li>
		<li>分装 10 &#181;0.05% 三卡因、15 mM 左旋咪唑溶于 0.5 mL 微型离心管中，于 -20 ℃ 保存 &#176;C. 
		注意：麻醉混合液对温度敏感，每次实验解冻工作溶液后，不应再次冷冻。参见 补充文件 2 M9 缓冲液的配制方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取高分辨率图像
	<ol>
		<li>准备10%琼脂糖，并在60℃水浴中保温 &#176;C. 
		注：参见 WormBook 中 Monica Driscoll 的报告12.</li>
		<li>将15-20只年轻成虫置于10%琼脂糖垫上，并加入3 &#181;麻醉剂L（见步骤3）。</li>
		<li>加盖盖玻片（线虫在5分钟内被固定）。</li>
		<li>用融化的粘合密封剂混合物密封盖玻片的边缘（参见 材料表).</li>
		<li>获取图像
		<ol>
			<li>超分辨率成像获取
			<ol>
				<li>使用配备63x/1.40 Plan-Apochromat油镜的激光扫描共聚焦显微镜进行超分辨率显微成像，以实现较小的像素尺寸（例如， &#60; 50 nm）。使用制造商软件推荐的步长采集Z轴堆栈图像（参见 材料表).</li>
				<li>采集一系列光学切片，覆盖DD腹侧突起的完整体积（例如，以0.19 μm为步进，采集15–20个切片）。 &#181;微米步长或2-3&#181;微米厚）。使用制造商的软件提交Z轴层扫图像进行图像处理，并分析评分高于7的图像图1B, 图2 和 图3).</li>
			</ol>
			</li>
			<li>奈奎斯特采样
			<ol>
				<li>使用激光扫描共聚焦显微镜，根据所用物镜（例如，40倍/1.4数值孔径平场复消色差油镜）的光波长和数值孔径，选择最佳像素尺寸。 
				注意：更小的像素尺寸将揭示 DD 树突棘的精细结构。</li>
				<li>使用自动算法提交图像栈进行三维去卷积（参见 材料表) (图3).</li>
			</ol>
			</li>
			<li>使用尽可能小的Z轴步进（例如，由压电载物台决定），因为在Z轴上过采样可在三维去卷积后获得更清晰的图像13.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>使用&#160;合适的图像处理软件（参见 材料表) 生成Z轴层扫图像的最大强度投影14.</li>
		<li>手动计数 DD 树突上的突起。 
		注意：突起是从主干垂直伸出的结构图1B，箭头所示。</li>
		<li>确定被评分的DD树突长度，以计算每10单位长度上的树突棘密度 &#181;m 的 DD 树突（图1C).</li>
		<li>将树突棘分类为细长/蘑菇状、丝状、短粗状或分支状（图2A). 
		注意：细长型/蘑菇型树突棘具有狭窄的基部（颈部）和较宽的顶端（头部）。丝状树突棘无明显缩窄的基部（无颈部），宽度基本一致。短粗型树突棘具有宽阔的基部和顶端。分枝型树突棘是指具有多个顶端的突起。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 评估突触前胆碱能信号对DD树突棘的激活作用
<ol>
	<li>使用常规技术（如显微注射）创建转基因蠕虫8,9
	<ol>
		<li>使用 flp-13 启动子以驱动 Ca++ 传感器GCaMP6s在DD神经元中以及 unc-4 启动子以在突触前VA神经元中驱动表达红移通道视紫红质Chrimson（图4A）。参见质粒列表 补充文件 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备全反式视黄醛（ATR）和对照平板。 
	注意：ATR 是 Chrimson 作为光遗传学激活离子通道发挥作用所必需的辅因子。
	<ol>
		<li>在100%乙醇中配制100 mM ATR储存液，-20 ℃保存 &#176;C，每份1 mL分装。</li>
		<li>在层流罩中，加入300 &#181;L 过夜 OP50 菌液和 0.25 &#181;每60 mm NGM（线虫生长培养基）营养琼脂平板中加入L型ATR，并用无菌玻璃棒涂布均匀。</li>
		<li>作为对照，加入 300 &#181;L OP50 细菌和 0.25 &#181;L 无水乙醇（100%）加入另一组 NGM 平板中。</li>
		<li>将平板置于通风橱中，室温下静置24小时（避免环境光照射），以促进细菌生长。 
		注意：平板可在初始 24 小时孵育后使用，或于 4 ℃保存 &#176;5 天内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验设置
	<ol>
		<li>将五只NC3569 L4期幼虫置于接种OP50并添加ATR或未添加ATR的对照平板上，于黑暗条件下23℃培养&#176;C.</li>
		<li>三天后，使用体视解剖显微镜确认阴门发育，挑选ATR组和对照组平板中处于L4期的子代个体，用于成像，具体步骤如2.4.1–2.4.3所述。</li>
		<li>在显微镜载玻片上，放置 2 &#181;0.05 L &#181;m 多聚珠（2.5% 固体 w/v）（参见 材料表).</li>
		<li>使用铂金丝（&#34;线虫挑取工具&#34;) 向溶液中加入一小滴万能胶，轻轻涡旋以形成丝状物 &#34;链&#34; 的胶。然后加入3 &#181;M9 缓冲液 L（图4B).</li>
		<li>将约十只L4期幼虫放入溶液中，并盖上盖玻片。 
		注意：盖玻片加盖后，胶质纤维会随机接触线虫并使其固定。陷入大胶滴中的线虫会出现脱水现象，不应进行成像。</li>
		<li>按照步骤 1.4.4 中所述密封盖玻片边缘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录诱发电信号++ 树突棘中的瞬时变化
	<ol>
		<li>使用配备高灵敏度CCD相机、100倍TIRF油镜物镜以及488 nm和561 nm激光线的转盘共聚焦显微镜（参见 材料表).</li>
		<li>调节显微镜载物台，使DD树突棘位于焦平面上。</li>
		<li>设置延时成像程序，使每帧均用488 nm激光照射样品（用于检测GCaMP6s荧光），并以固定时间间隔使用561 nm激光（用于Chrimson激发）。 
		注意：例如，使用488 nm光线采集GCaMP6s信号的连续图像（200 ms），每第5帧结合一次561 nm光线的200 ms脉冲图4C-在此配置下，每次561 nm脉冲前后约1秒间隔检测GCaMP水平（200 ms的488 nm激光用于在VA激活前检测GCaMP，200 ms的561 nm脉冲用于激活VA，以及约600 ms用于切换激光线路和发射滤光片）。通过该设置，VA神经元每2.5秒被激活一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>树突棘的结构与功能分析 在体 Ca++ 成像
	<ol>
		<li>使用二维去卷积和图像配准来校正采集过程中因线虫运动引起的微小偏差（参见 材料表).</li>
		<li>将DD树突棘定义为感兴趣区域（ROI） 图4C- D).</li>
		<li>复制该 ROI 并移至线虫体内的邻近区域，以采集背景信号（即噪声）。</li>
		<li>使用适当的软件（参见 材料表) 以输出 GCaMP6s&#160;将每个时间点的强度值导出至 Excel。从树突棘 ROI 的荧光中减去背景荧光。</li>
		<li>通过从每次激发后的各时间点荧光值中减去561 nm激发前一帧的GCaMP6s荧光值（F0），确定荧光变化量&#916;F），然后除以 F0 以确定 &#916;F/F0（图4E).</li>
		<li>绘制归一化轨迹（参见 材料表).</li>
		<li>对每次561 nm光脉冲前后GCaMP6s荧光的每项测量值进行配对统计检验。 
		注意：该方法能有效排除GCaMP6s荧光的随机波动，否则会降低在561 nm激发前后对所有测量值的平均GCaMP6s信号进行比较时的统计效能。图4F).</li>
		<li>对于呈正态或高斯分布的测量数据，对两组（ATR 处理前）采用配对的参数型方差分析（ANOVA）检验，并对多次比较进行校正 与. 加入ATR后，不加ATR前 与对于非正态分布的数据，可采用非参数方差分析，并进行多重检验的事后校正。 
		注意：在缺乏ATR的培养板上培养的线虫（&#34;无 ATR&#34;) 是必要的对照，不应显示由 561 nm 激活的 Ca++ 瞬变，因为Chrimson的功能需要ATR。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

我们声明不存在利益冲突。

选择 Airyscan 探测器来获取 DD 树突棘的快照，因为它比传统的共聚焦显微镜具有更高的信噪比和更好的分辨率19,20。AiryScan 成像还允许使用常规荧光蛋白（例如 GFP、mCherry 等），这些蛋白目前在 C. elegans 研究中已广泛可得。尽管其他超分辨率方法（例如 STORM、STED、PALM）可以获得更高分辨率的图像，但这些方法需要光激活或光可切换荧光蛋白21。作为 Airyscan 的替代方案，推荐使用传统共聚焦显微镜。例如，采用奈奎斯特采样成像（图 3）时，使用 40x/1.3 物镜可实现 123.9 nm 的像素尺寸，足以区分树突棘的不同形态类型（图 2）。
为确定树突棘密度，建议使用细胞质荧光蛋白（如 mCherry 或 GFP）、标记肌动蛋白细胞骨架的 LifeAct，或肉豆蔻酰化荧光蛋白（例如 MYR::mRuby）来标记质膜（图 1B）。相比之下，F-肌动蛋白结合蛋白 Utrophin 会降低树突棘密度（图 1C），表明 Utrophin 过表达对树突棘形态发生具有抑制作用。
当前的成像方法有助于识别调控脊柱形态的遗传变异1,16. DD 树突棘形态（即细长/蘑菇状、丝状、短小、分枝状，参见 图2可以从腹神经索侧位图像的单个二维投影中评估），因为大多数DD树突棘具有特征性的腹向朝向。在进行此类比较时，必须对每种条件使用相同的荧光标记，因为树突棘形态类型的表观特征似乎受标记方法的影响（例如，MYR::mRuby）。 与. LifeAct::GFP)。此外，观察到树突棘的形态具有动态性，可能随外部信号刺激而发生形态改变2,16因此，在相似的发育阶段和相似的条件下比较不同基因型之间的树突棘形态也至关重要。
C. elegans 腹神经索的方向对于准确的图像采集至关重要。应在同一Z平面上可见动物两侧相对的腹侧和背侧神经索，这表明线虫处于侧卧位置（图1B）。应避免采集正在移动的线虫，或其腹侧神经索附近与其他线虫或气泡接触的线虫的图像，因为这些情况会影响棘突结构的成像质量。
对于 体内 钙成像，每次采集前需立即制备新鲜载玻片。最好使线虫仅与少量胶水纤维接触进行成像 与. &#34;液滴&#34; 胶水容易使线虫脱水并降低图像质量（图4B）。在所示实验中 图4，561 nm 激光的脉冲激活整个视野。为提高时间和空间分辨率以检测局部 Ca++ 例如，在单个DD树突棘内记录瞬时信号时，可使用为561 nm激光线设置的振镜微型扫描系统来刺激更小的兴趣区域17.

树突棘是接收邻近神经元输入以进行突触传递的特化细胞结构。神经递质受体的激活可升高树突棘内的细胞内钙水平，并激活下游信号通路&#160;特征性神经元突起1由于树突棘在神经传递中的基础性作用及其在神经发育疾病中的异常调控1因此，发现调控树突棘形态发生及其功能的因子在神经科学领域备受关注。
最近，基于与哺乳动物树突棘共享的关键特征，已在 C. elegans 神经系统中鉴定出树突棘2。这一发现至关重要，因为它开启了利用 C. elegans 的优势来研究树突棘生物学的可能性。背侧 D 类（DD）运动神经元上的树突棘接收来自腹侧神经索中胆碱能神经元（VA 和 VB）的输入（图 1A）2,3,4。本文介绍了成像方法，用于在完整且易于进行活体成像和遗传分析的神经系统中，研究 DD 树突棘的结构及其 in vivo 功能。为监测树突棘的形态，可使用（1）细胞质荧光蛋白，其可填充树突及其棘突；（2）膜结合荧光蛋白，其可标记树突棘和树突的边界；或（3）在树突棘中富集的肌动蛋白标记物 LifeAct5 或 Utrophin6，从而揭示其形态。为监测 DD 树突棘的功能，采用 GCaMP&#160; 荧光检测由突触前胆碱能神经元中红移视蛋白 Chrimson 激活所诱发的 Ca++ 瞬变7。这两种策略有望促进在野生型和突变型动物中对 DD 树突棘的研究。

<table><tbody><tr><td>全反式视黄醛（ATR）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2500-100MG</td><td>Chrimson介导的神经元兴奋所必需的辅因子</td></tr><tr><td>diH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>MilliQ</td><td></td><td>用于配制M9缓冲液</td></tr><tr><td>100%乙醇</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td>用于稀释ATR并制备神经元兴奋实验的对照平板</td></tr><tr><td>3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（三卡因）</td><td></td><td></td><td>用于固定动物以成像树突棘</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>（Schindelin J 等，2012）</td><td>开源图像处理软件</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>7758-11-4</td><td>用于配制M9缓冲液</td></tr><tr><td>盐酸左旋咪唑</td><td>Sigma</td><td>16595-80-5</td><td>用于固定动物以成像树突棘</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>M63-500</td><td>用于配制M9缓冲液</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12542B</td><td>用于固定动物以进行显微成像</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>用于配制M9缓冲液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S671-3</td><td>用于配制M9缓冲液</td></tr><tr><td>NIS Elements 版本 05.21</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于分析图像和视频（例如，去卷积、图像对齐）</td></tr><tr><td>Polybeads 羧基化 0.05 µm 微球</td><td>Polysciences, Inc</td><td>15913-10</td><td>用于固定动物以成像Ca++瞬变</td></tr><tr><td>Prism</td><td></td><td></td><td>用于统计分析及绘制归一化Ca++瞬变图</td></tr><tr><td>SeaKen ME琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50014</td><td>用于制备琼脂糖垫以固定动物进行成像</td></tr><tr><td>强力胶</td><td>The gorilla company</td><td></td><td>用于固定动物以成像Ca++瞬变</td></tr><tr><td>Superfrost 显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>22-034-980</td><td>用于固定动物以进行显微成像</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Covidien</td><td>8884430300</td><td>用于密封共聚焦快照样本</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Fisherbrand</td><td>23-021-399</td><td>Paraplast组织包埋介质</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;超分辨率成像显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM880</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AiryScan探测器</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apochromat（油）63x/1.40 NA，WD = 0.19 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>激光线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载物台控制器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;奈奎斯特图像采集显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1R 共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor（油）40x/1.3 NA，WD 0.24 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm，16 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>561 nm，17 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于监测树突棘中诱发Ca++瞬变的显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor DU-897 EMCCD相机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>转盘头CSU-X1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo TIRF（油）100x/1.49 NA，WD 0.12 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm，65 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>561 nm，86 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>525 nm（±18 nm）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>605 nm（±35 nm）</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在 caenorhabditis elegans 中成像树突棘

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

树突棘是受活动调节的突触神经支配特化位点，也是学习和记忆的结构基础。最近研究发现，在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）运动神经环路中，DD类GABA能神经元的树突棘是来自突触前胆碱能神经元的输入位点。这一突触环路现可作为一种强大的新型活体（in vivo）模型，用于研究树突棘的形态发生与功能，并可利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）遗传操作简便和易于进行活细胞成像的优势。
本方案描述了评估DD树突棘结构与功能的实验策略。该方法采用超分辨率成像技术，以观察富含肌动蛋白的树突棘的复杂形态。为评估DD树突棘的功能，利用光敏视蛋白Chrimson激活突触前胆碱能神经元，同时通过钙指示剂GCaMP报告突触后DD树突棘中诱发的钙瞬变。这些方法共同构成了强大的技术手段，可用于鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）中调控树突棘的遗传因子，这些因子也可能指导大脑中树突棘的形态发生与功能。

使用三种独立标记物（细胞质 mCherry、LifeAct::GFP、MYR::mRuby）进行测量，得出平均每微米 DD 树突棘密度为 3.4 ± 1.03 个 10 µm 野生型年轻成虫中DD树突的图1B，C）。在此分析中，排除了使用GFP::Utrophin标记物获得的显著较低的树突棘密度数据（2.4 ± 0.74， 图1由于Utrophin与肌动蛋白细胞骨架的相互作用6 可能驱动树突棘形态发生的机制15. 光学显微镜下测得的树突棘密度与4.2个树突棘/μm的数值相当10 µm 来自DD1神经元电子显微照片中12个树突棘重建所获得的树突2活细胞成像方法证实，成年个体中 DD 树突棘以细长/蘑菇状形态为主 与 其他脊柱形态（例如，丝状伪足形、短桩形、分支形）(图2B），这在成熟的哺乳动物神经系统中的树突棘中也很典型16.
采用光遗传学策略来探究通过高分辨率光学显微镜检测到的假定树突棘（图1 和 图2）是否对突触前位点释放的神经递质产生反应，这是哺乳动物神经元树突棘的一个典型特征。使用绿光（561 nm）激活突触前胆碱能神经元中的通道视紫红质变体 Chrimson，同时使用蓝光（488 nm）检测突触后 DD 树突棘中细胞质 GCaMP 探针所发出的 Ca++ 依赖性荧光。该实验在光遗传学激活突触前 VA 神经元中的 Chrimson 后，立即在 DD 树突棘中检测到 GCaMP 信号的瞬时爆发（图3）。该实验的成功依赖于 Chrimson 在所有突触前 VA 神经元中稳定表达。在此情况下，使用了 Punc-4::Chrimson 标记的染色体整合子17，以确保 VA 神经元中表达的一致性。该实验也可使用染色体外阵列进行。可通过例如将 Chrimson 转基因与 SL2 反式剪接引导序列连接，并以下游核定位的 GFP 作为共表达标记，独立验证特定 VA 神经元中的 Chrimson 表达2。至关重要的是，需在无 ATR 的条件下进行对照实验，以确认所测得的 GCaMP 信号依赖于 ATR 依赖性的 Chrimson 光遗传学激活（图4D）。最后，由于诱发的 Ca++ 信号是瞬时的，必须采用一种成像方案，能够在 561 nm 激发与 488 nm 激光采集 GCaMP 信号之间实现快速切换（&lt;1 秒）（图4）。
<img alt="线虫示意图，荧光显微镜，蛋白质定位，脊密度小提琴图，比较分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：DD 树突棘的标记。 (A（上）腹神经索中的六个背侧 D（DD1-DD6）神经元 C. elegans（底部）在成虫中，腹向的DD神经元棘突（箭头）与腹侧A（VA）和腹侧B（VB）运动神经元（品红色）的突触前末梢形成接触，而DD神经元的横行轴突延伸至背侧神经索，向体壁肌肉提供GABA能输出（箭头）18. 该图已根据参考文献修改2. (B) 标记了胞质 mCherry、肉豆蔻酰化 mRuby（MYR::mRuby）、LifeAct::GFP 和 GFP::Utrophin 的幼年成虫 DD 突触棘的荧光显微图像（Airyscan）。灰色箭头指示突触棘。比例尺 = 2 µm. (C密度（树突棘/10 µm标记有细胞质 mCherry（3.77 ± 0.9）、MYR::mRuby（3.09 ± 0.8）、LifeAct::GFP（3.44 ± 1.1）或 GFP::Utrophin（2.41 ± 0.8）的 DD 神经元树突棘密度。所有样本均呈正态分布。单因素方差分析显示，细胞质 mCherry、MYR::mRuby 和 LifeAct::GFP 的树突棘密度之间无显著差异（NS），而 GFP::Utrophin 的树突棘密度降低 与细胞质标记的mCherry（p = 0.0016）和LifeAct::GFP（p = 0.0082）。红色虚线表示通过三维电镜重建评估的DD神经元的树突棘密度（4.2个树突棘/10 µm）。该图已根据参考文献修改2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="树突棘形态分类示意图及频率图；LifeAct::GFP 与 MYR::mRuby 组别。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：DD区树突棘成像。（A）（上）树突棘形态示意图。（下）各类树突棘的Airyscan图像（比例尺 = 500 nm），以LifeAct::GFP（绿色）标记，并通过连续电子显微图像对高压冷冻成年样本进行3D重建（蓝色）。（B）使用LifeAct::GFP标记的树突棘按类型分布频率：细长/蘑菇型（55.5 ± 14.5%）、丝状伪足型（10.3 ± 8.70%）、短 stubby 型（18.8 ± 10.7%）、分支型（15.42 ± 6.01%）；使用MYR::mRuby标记的树突棘按类型分布频率：细长/蘑菇型（52.2 ± 16.5%）、丝状伪足型（5.68 ± 7.0%）、短 stubby 型（33.1 ± 14.8%）、分支型（9.02 ± 9.6%）。非配对t检验结果显示，使用MYR::mRuby标记的丝状伪足型（p = 0.0339）、短 stubby 型（p = 0.0009）和分支型（p = 0.011）树突棘与LifeAct::GFP标记组相比存在显著差异。本图改编自参考文献2。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="Airyscan 与 Nyquist 显微镜对比；展示成像分辨率、像素大小、荧光信号。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：获取 DD 树突棘高分辨率图像的策略。 （A-B）（上图）使用细胞质标记物（mCherry）标记的 DD1 树突的荧光图像，分别通过（A）Airyscan 探测器和（B）Nyquist 采样获得。（下图）使用图像分析软件（filament tracer 的 auto-path 功能）描绘出 DD 树突（红色），并通过半自动树突棘检测模块图示化显示 DD 树突棘（蓝色）。箭头指向在 C 和 D 中放大显示的分支型树突棘。箭头标记相邻的细长/蘑菇状树突棘，在 C 和 D 中放大显示。比例尺 = 2 µm。（C-D）（上图）分支型树突棘（箭头）和（下图）两个相邻的细长/蘑菇状树突棘（箭头标记）的放大示例，分别通过（C）Airyscan 探测器或（D）Nyquist 采样获得。比例尺 = 500 nm。数据转载自2。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光遗传学实验；示意图，荧光成像结果，感觉神经元反应分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62676/62676fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图 4评估 DD 树突棘的功能。 (A) DD运动神经元表达Ca++ 指示剂 GCaMP6s（绿色），而 VA 运动神经元表达通道视紫红质变体 Chrimson（品红色）7. (B) 固定线虫用于 Ca 成像的示意图++ 测量。（1）取一块干净的显微镜载玻片，（2）放置 2 µL 的 0.05 µm 聚苯乙烯微珠，（3）使用铂金丝（“蠕虫挑取针”）加入一小滴瞬干胶，（4）在溶液中旋转形成丝状胶质细丝。（5）加入 3µL 加入M9缓冲液。(6) 将约十条L4期幼虫放入溶液中，(7) 盖上盖玻片，并用凡士林/石蜡密封边缘。C-D) VA神经元的激活与Ca++ DD1 棘突中的瞬时反应。以 Chrimson 周期性光激活（2.5 秒间隔）诱导 GCaMP6s 荧光（以 0.5 秒间隔成像），引发 Ca²⁺ 瞬时升高++ 瞬变与（C) +ATR（n = 12），但在（D对照组（-ATR，n = 12）。图中各面板为561 nm光照脉冲（垂直粉线）前后随时间（秒）变化的截图。比例尺 = 2 µm从每个树突棘尖端的感兴趣区域（ROI）获取 GCaMP6s 信号。E+ATR 条件下 10 秒记录期间的 GCaMP6s 荧光强度（绿色） 与 - ATR（对照组，灰色）（n = 12 个视频）。垂直的粉红色条表示 561 nm 照明（例如，Chrimson 激活）。每只动物均接受 4 次 561 nm 光刺激。在每次 561 nm 光脉冲前后均采集测量数据。F) 561 nm 光脉冲前后 GCaMP6s 荧光强度的变化图。每次 561 nm 光脉冲后 1 秒测量一次 GCaMP6s 荧光强度。由于样本不符合正态分布，采用配对非参数 Friedman 检验对多次比较的 GCaMP6s 荧光强度进行校正 与. 在添加 ATR（+ATR，绿色）（*** p = 0.0004，n = 48 次测量）或不添加 ATR（-ATR，灰色）（NS，无显著性，p = 0.0962，n = 48 次测量）的条件下培养的线虫，经 561 nm 光刺激后的结果。该图已根据参考文献修改2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/62676fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充文件 1：本研究中使用的质粒列表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：M9 缓冲液的成分与配制方法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62676/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

树突棘是神经系统的重要细胞特征。本文描述了用于评估线虫（C. elegans）中树突棘结构与功能的活体成像方法。&#160;这些方法有助于开展针对决定树突棘形态或功能基因的突变体筛选。

在 Caenorhabditis elegans 中成像树突棘

树突棘是受活动调节的突触神经支配特化位点，作为学习与记忆的结构基础。近年来，树突棘……

本方案描述了在秀丽隐杆线虫（C. elegans）神经元中可视化树突棘形态和钙瞬变的方法。我们的方法将有助于通过遗传学手段发现调控树突棘形态发生及功能的因素。本方案重点展示了GABA能神经元中的树突棘。这些方法也可用于研究秀丽隐杆线虫其他类型神经元的树突棘。本方案描述了固定活体秀丽隐杆线虫的方法。在图像采集过程中，防止动物移动以及选择合适的激光配置以激发和记录神经元活动尤为重要。为了获得高分辨率图像，向10%琼脂糖垫上加入3 µL麻醉溶液，并转移15至20条年轻成虫线虫。随后盖上盖玻片以固定线虫，并用熔化的粘合密封剂混合物封固盖玻片边缘。进行超分辨率成像时，使用配备超分辨率显微镜的激光扫描共聚焦显微镜。使用制造商软件推荐的步长获取Z轴层扫图像。采集一系列光学切片，覆盖背侧D或DD腹侧突起的完整体积。将Z轴层扫图像提交至制造商软件进行图像处理，并分析评分高于七分的图像。对于奈奎斯特采样，使用激光扫描共聚焦显微镜，并根据光的波长和物镜的数值孔径选择最佳像素尺寸。然后使用自动算法对图像序列进行三维去卷积处理。进行图像分析时，采用合适的图像处理软件对Z轴序列图像生成最大强度投影。然后手动计数 DD 树突上的突起。接着测定已评分的 DD 树突长度，以计算每 10 微米 DD 树突上的棘密度。随后将棘分类为细长形或蘑菇形、丝状、短粗形或分支形。使用显微注射等常规技术，构建在DD神经元中表达钙离子传感器GCaMP、在突触前VA神经元中表达红移通道视紫红质Chrimson的转基因线虫。接着，在层流通风罩内，向每个60毫米的线虫生长培养基营养琼脂平板中加入300微升过夜培养的OP50细菌菌液和0.25微升全反式视黄醛（ATR），制备全反式视黄醛（ATR）平板。然后用无菌玻璃涂布棒均匀涂布菌液。对于对照组平板，加入 300 微升 OP50 菌液和 0.25 微升乙醇。为促进细菌生长，将平板置于室温下避光培养 24 小时。实验设置时，将五只 L4 期幼虫放置于接种了 OP50 的 ATR 平板或对照组平板上，并将平板在 23 摄氏度避光条件下培养。三天后，使用体视解剖显微镜确认外阴发育情况，并从ATR平板和对照平板上挑选L4期子代用于成像。接着，在载玻片上放置2微升0.05微米的聚苯乙烯微球。然后将约10条L4幼虫放入该溶液中。使用铂金丝将少量一滴氰基丙烯酸酯胶加入溶液中。轻轻搅动溶液以形成丝状的胶状物。然后加入 3 µL M9 缓冲液。然后加盖盖玻片，并按照先前演示的方法密封其边缘。为记录树突棘中的诱发性钙瞬变，使用转盘共聚焦显微镜，并调节显微镜载物台，使DD树突棘位于焦平面上。接着设置延时成像程序，在每一帧中使用488纳米激光线照射样品以检测GCaMP荧光，并以周期性间隔使用561纳米激光线进行Chrimson激发。进行活体钙成像时，使用二维去卷积和图像配准来校正采集过程中因线虫运动引起的微小偏差。随后将DD树突棘定义为感兴趣区域（ROI）。复制该ROI并移至线虫体内邻近区域，以采集背景信号。然后使用适当的软件将每个时间点的 GFP 强度导出至 Excel，并从树突棘 ROI 的荧光中减去背景荧光。通过从每次激发后的时间点（或 ΔF）减去 561 纳米激发前一帧或零时刻的 GFP 荧光，确定荧光的变化。然后除以 F 零，计算 ΔF/F 零。最后绘制归一化的荧光变化曲线。首先，使用 Shapiro-Wilk 检验确定数据是否呈正态分布。对于非正态分布的数据，采用非参数方差分析，并对多重检验进行事后校正。或者，对于呈正态或高斯分布的测量数据，对每次 561 纳米脉冲前后 GCaMP 荧光的每项测量值进行配对的参数化方差分析检验。并对两个组内的多重比较进行校正。使用三种独立标记物——胞质mCherry、MYR:mRuby和LifeAct:GFP——对DD树突棘进行标记，在野生型年轻成虫中，平均每10微米DD树突的DD树突棘密度为3.4个。GFP:Utrophin标记物未被纳入本分析，因其所得树突棘密度显著偏低，这可能与utrophin与驱动树突棘形态发生的肌动蛋白细胞骨架之间的相互作用有关。活细胞成像方法证实，与丝状、短 stubby 状和分支状等其他树突棘形态相比，成年个体中以细长蘑菇状形态为主的 DD 树突棘占主导地位。通过在表达 GCaMP 的 DD 神经元和表达 Chrimson 的突触前 VA 神经元的转基因线虫中检测突触前胆碱能信号，评估了 DD 树突棘的激活情况。在光遗传学激活突触前 VA 神经元中的 Chrimson 后，立即在 DD 树突棘中检测到 GCaMP 信号的瞬时爆发。在无 ATR 的情况下进行的对照实验确认，GCaMP 信号的检测依赖于 Chrimson 的光遗传学激活，而该激活严格依赖于 ATR。为了清晰观察 DD 树突棘，最佳成像方式是让动物侧卧，使突出的树突棘与光路呈直角。通过该方法，科研人员还可结合药理学干预手段，以解析驱动 DD 树突棘钙瞬变的潜在机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

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在 Caenorhabditis elegans 中成像树突棘

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