在 Caenorhabditis elegans 中成像树突棘

本方案描述了在秀丽隐杆线虫（C. elegans）神经元中可视化树突棘形态和钙瞬变的方法。我们的方法将有助于通过遗传学手段发现调控树突棘形态发生及功能的因素。本方案重点展示了GABA能神经元中的树突棘。

这些方法也可用于研究秀丽隐杆线虫其他类型神经元的树突棘。本方案描述了固定活体秀丽隐杆线虫的方法。在图像采集过程中，防止动物移动以及选择合适的激光配置以激发和记录神经元活动尤为重要。

为了获得高分辨率图像，向10%琼脂糖垫上加入3 µL麻醉溶液，并转移15至20条年轻成虫线虫。随后盖上盖玻片以固定线虫，并用熔化的粘合密封剂混合物封固盖玻片边缘。进行超分辨率成像时，使用配备超分辨率显微镜的激光扫描共聚焦显微镜。

使用制造商软件推荐的步长获取Z轴层扫图像。采集一系列光学切片，覆盖背侧D或DD腹侧突起的完整体积。将Z轴层扫图像提交至制造商软件进行图像处理，并分析评分高于七分的图像。

对于奈奎斯特采样，使用激光扫描共聚焦显微镜，并根据光的波长和物镜的数值孔径选择最佳像素尺寸。然后使用自动算法对图像序列进行三维去卷积处理。进行图像分析时，采用合适的图像处理软件对Z轴序列图像生成最大强度投影。

然后手动计数 DD 树突上的突起。接着测定已评分的 DD 树突长度，以计算每 10 微米 DD 树突上的棘密度。随后将棘分类为细长形或蘑菇形、丝状、短粗形或分支形。

使用显微注射等常规技术，构建在DD神经元中表达钙离子传感器GCaMP、在突触前VA神经元中表达红移通道视紫红质Chrimson的转基因线虫。接着，在层流通风罩内，向每个60毫米的线虫生长培养基营养琼脂平板中加入300微升过夜培养的OP50细菌菌液和0.25微升全反式视黄醛（ATR），制备全反式视黄醛（ATR）平板。然后用无菌玻璃涂布棒均匀涂布菌液。

对于对照组平板，加入 300 微升 OP50 菌液和 0.25 微升乙醇。为促进细菌生长，将平板置于室温下避光培养 24 小时。实验设置时，将五只 L4 期幼虫放置于接种了 OP50 的 ATR 平板或对照组平板上，并将平板在 23 摄氏度避光条件下培养。

三天后，使用体视解剖显微镜确认外阴发育情况，并从ATR平板和对照平板上挑选L4期子代用于成像。接着，在载玻片上放置2微升0.05微米的聚苯乙烯微球。然后将约10条L4幼虫放入该溶液中。

使用铂金丝将少量一滴氰基丙烯酸酯胶加入溶液中。轻轻搅动溶液以形成丝状的胶状物。然后加入 3 µL M9 缓冲液。

然后加盖盖玻片，并按照先前演示的方法密封其边缘。为记录树突棘中的诱发性钙瞬变，使用转盘共聚焦显微镜，并调节显微镜载物台，使DD树突棘位于焦平面上。接着设置延时成像程序，在每一帧中使用488纳米激光线照射样品以检测GCaMP荧光，并以周期性间隔使用561纳米激光线进行Chrimson激发。

进行活体钙成像时，使用二维去卷积和图像配准来校正采集过程中因线虫运动引起的微小偏差。随后将DD树突棘定义为感兴趣区域（ROI）。复制该ROI并移至线虫体内邻近区域，以采集背景信号。

然后使用适当的软件将每个时间点的 GFP 强度导出至 Excel，并从树突棘 ROI 的荧光中减去背景荧光。通过从每次激发后的时间点（或 ΔF）减去 561 纳米激发前一帧或零时刻的 GFP 荧光，确定荧光的变化。然后除以 F 零，计算 ΔF/F 零。最后绘制归一化的荧光变化曲线。

首先，使用 Shapiro-Wilk 检验确定数据是否呈正态分布。对于非正态分布的数据，采用非参数方差分析，并对多重检验进行事后校正。或者，对于呈正态或高斯分布的测量数据，对每次 561 纳米脉冲前后 GCaMP 荧光的每项测量值进行配对的参数化方差分析检验。

并对两个组内的多重比较进行校正。使用三种独立标记物——胞质mCherry、MYR:mRuby和LifeAct:GFP——对DD树突棘进行标记，在野生型年轻成虫中，平均每10微米DD树突的DD树突棘密度为3.4个。GFP:Utrophin标记物未被纳入本分析，因其所得树突棘密度显著偏低，这可能与utrophin与驱动树突棘形态发生的肌动蛋白细胞骨架之间的相互作用有关。

活细胞成像方法证实，与丝状、短 stubby 状和分支状等其他树突棘形态相比，成年个体中以细长蘑菇状形态为主的 DD 树突棘占主导地位。通过在表达 GCaMP 的 DD 神经元和表达 Chrimson 的突触前 VA 神经元的转基因线虫中检测突触前胆碱能信号，评估了 DD 树突棘的激活情况。在光遗传学激活突触前 VA 神经元中的 Chrimson 后，立即在 DD 树突棘中检测到 GCaMP 信号的瞬时爆发。

在无 ATR 的情况下进行的对照实验确认，GCaMP 信号的检测依赖于 Chrimson 的光遗传学激活，而该激活严格依赖于 ATR。为了清晰观察 DD 树突棘，最佳成像方式是让动物侧卧，使突出的树突棘与光路呈直角。通过该方法，科研人员还可结合药理学干预手段，以解析驱动 DD 树突棘钙瞬变的潜在机制。