在胎儿肺细胞的机械传导的实验系统研究

机械力发挥关键作用，在肺发育和肺损伤。在这里，我们描述了一个隔离啮齿动物胎儿肺Ⅱ型上皮细胞和成纤维细胞，并揭露他们使用的机械刺激的方法

该程序的目的是描述一种研究胎儿肺细胞机械转导的实验系统。这是通过用细胞外基质蛋白编码培养板来实现的。然后分离胎鼠肺 2 型上皮细胞，然后分离胎鼠成纤维细胞。

最后一步描述了为肺细胞提供机械刺激的体外系统。最终，通过实时 PCR、western blot 和荧光免疫化学图像，可以获得显示 2 型细胞分化增加的结果。这些方法可以帮助回答机械转导领域的关键问题，例如胎儿肺发育和肺损伤。

演示该程序的是我实验室的技术人员 Julian gu 当我们在无菌条件下在层流罩中工作时，每板制备 120 微克层粘连蛋白和 12 毫升冷无菌 1 XPBS。其他细胞外基质蛋白可用于包被。有关详细信息，请查阅书面方案，然后取未经处理的 BioFlex 板，向每个孔中加入 2 毫升层压板溶液，最终浓度为每平方厘米 2 微克。

确保孔完全被溶液覆盖。用保鲜膜完全覆盖板，并在 4 摄氏度的环境中放在平坦的表面上过夜，以使层压板吸收到孔底部。包被板可以在这些条件下储存至少一周，同时在第二天保持良好的 ECM 功能。

在无菌条件下，用一个 XPBS 清洗孔 3 次。然后向每个 XPBS 中加入 1 毫升 1% BSA。在 37 摄氏度下孵育 1 小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。

然后，用一个 XPBS 洗涤孔 3 次。要去除未吸收的蛋白质，请向板的每个孔中加入 1 毫升 DMEM。然后将板储存在 37 摄氏度，直到分离出胎儿啮齿动物肺型两个上皮细胞并准备接种。

在开始细胞分离程序的前一天，用 130 和 15 微米尼龙网组装筛杯，并通过高压灭菌对其进行消毒。在培养当天也对相同数量的 150 毫升玻璃峰进行高压灭菌。在妊娠 E 17 至 19 从定时怀孕的小鼠获得胎肺。

将组织转移到含有 DMEA 培养基的 50 毫升离心管中，并将其置于冰上。根据书面方案中的配方，在 50 毫升离心管中制备新鲜的消化缓冲液。在层流罩过滤器中工作时，通过 0.2 微米针式过滤器进行消毒。

10 毫升的这种缓冲液足以用于从大约 20 个小鼠胎儿获得的肺组织。将含有消化缓冲液的锥形管放入 37 摄氏度的水浴中。从含有胎儿肺组织的锥形管中取出镣，并使用无菌剪刀或剃须刀片将组织转移到无菌培养皿中，将组织切成小于 1 毫米的碎片。

然后将组织转移到含有预热消化缓冲液的锥形管中。接下来，通过使用孔径减小的移液器上下移液胎儿肺细胞悬液 100 次，机械地帮助消化组织。消化过程完成后，在室温下以 1， 300 RPM 的速度离心匀浆 5 分钟。

然后小心地通过抽吸去除仰卧位，并将含有细胞的沉淀重悬于 15 毫升 DMEM 加 20% FBS 中。接下来，取回带有 130 和 15 微米尼龙网的筛杯，并将它们放在无菌 150 毫升烧杯的顶部。将细胞匀浆移液到 100 微米的网上。

收集滤液并将其移液到 30 微米的网上。用新鲜的 DMEM 和 10% FBS 洗涤 30 微米的网片数次。大多数 2 型细胞聚集在一起，不穿过网格。

这些洗涤去除可能附着在团块上的非上皮细胞。将 30 微米筛孔中的滤液涂抹到 15 微米筛杯中。再次像以前一样洗涤几次。

此步骤募集可能已通过 30 微米网的 2 型细胞。从 30 和 15 微米网片中收集聚集的未过滤细胞，以进一步富集 2 型细胞。如果要培养胎啮齿动物肺成纤维细胞，请保留 15 微米网孔中的滤液。

否则，丢弃此滤液。进一步。通过添加培养基纯化 2 型上皮细胞群，并将 30 和 15 微米网杯中的未过滤细胞在 75 平方厘米的组织培养瓶中孵育 30 分钟，孵育后像以前一样离心超级名称，对细胞进行去沉淀，然后将沉淀重悬于两毫升无血清 DMEM pro 胎儿中，将一毫升细胞悬液移液到层压涂层的每个孔中此时，BioFlex 六孔板，在显微镜下观察时细胞呈团块状，将板在设置为 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的组织培养箱中孵育。最佳孵育时间为 24 小时，至少需要 6 小时的孵育。

在开始机械应变实验之前，从 15 微米网片中取出滤液，并在 37 摄氏度下转移到 75 平方厘米的组织培养瓶中 30 至 60 分钟，以使成纤维细胞粘附、吸出并丢弃浆料。然后用无血清 DMEM 替换培养瓶中的体积并孵育过夜。第二天，用 0.25% 胰蛋白酶在 0.4 毫摩尔 EDTA 中收获细胞，并将它们接种在纤连蛋白包被的 BioFlex 板上，在设置为 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的组织培养箱中孵育，理想情况下在开始机械应变实验之前孵育 24 小时。

如果实验需要特定数量的细胞，则至少需要 6 小时的孵育。分离后，将 2 型细胞维持在无血清 DMEM 75 平方厘米烧瓶中，第二天将细胞进行胰蛋白酶计数，然后在实验开始前放置单层应不大于 80% 汇合。在机械刺激实验当天，用每孔 2 毫升新鲜的无血清 DMEM 替换细胞培养基，然后将板安装在 Flex Cell FX 5， 000 菌株装置中。

接下来，将 EQU 双轴应变施加到膜上。应变方案根据体内机械力的模拟而变化。如书面方案中所述，细胞在非 ST 拉伸膜上生长。

平行培养的 Stable 用作实验的对照。在实验结束时，可以处理单层细胞，以通过实时 PCR 分析基因表达的变化或通过 western blot 分析蛋白质丰度的变化。此外，对于该技术，可以固定单层用于免疫化学实验。

固定后，从板中切下 ASTIC 膜，并使用 10 至 20 微升水作为封片剂封片在载玻片上，然后渗透并与抗体孵育。实验中的超级 datin 也可用于研究是否存在释放的物质，例如生长因子或细胞因子。该图像显示了 parmal 固定的 E 18 胎儿型两个上皮细胞，它们按照本方案被分离并接种在用层粘连蛋白编码的 BioFlex 板上。

牢房被固定并拍摄了照片。接种后第二天，非 ST 拉伸细胞。通过上皮细胞形态的显微镜分析和表面活性剂蛋白 C 的免疫染色，确定细胞纯度为 90 正负 5.下图显示了来自胎儿 2 型上皮细胞的数据，这些细胞以每分钟 40 个循环暴露于 5% 循环菌株 16 小时。

表面活性剂蛋白 C mRNA 表达的这种 Northern 印迹表明，菌株使用不同的 ECM 底物诱导 2 型细胞分化。加号减号分别表示暴露于应变或未暴露于应变。表达数据在直方图中表示为平均值正负 SEM，N 等于 3，星号表示 P 值小于 0.05。

这些荧光免疫化学图像显示表面活性剂蛋白 C 蛋白水平为绿色。在胎儿型中，左侧未暴露于机械应力和右侧细胞核未暴露于机械应力的两个细胞用 dapi 复染，其呈蓝色。该直方图量化了三个实验的蛋白质印迹结果，表明机械拉伸会增加表面活性剂蛋白 C 蛋白的水平。

在本实验中，N 等于 3，星号表示 P 值小于 0.05。看完这个视频，你应该对如何加速胎儿肺细胞并让它们受到机械拉伸有一个很好的了解。