Name: 在胎儿肺细胞的机械传导的实验系统研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 了解胎儿肺细胞机械传导的实验方法，通过体外系统分离小鼠肺泡II型上皮细胞和成纤维细胞，应用机械刺激研究细胞分化机制，为肺发育和损伤研究提供重要技术支持。

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由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 HD052670 支持。

1. 用细胞外基质蛋白包被培养板
<ol>
	<li>在无菌条件下，每块培养板将 120 μg 层粘连蛋白与 12 ml 冷的无菌 1X PBS 混合。</li>
	<li>取 Bioflex 未处理培养板，向每个孔中加入 2 ml 上述溶液（层粘连蛋白终浓度为 2 μg/cm2）。或者，也可使用其他细胞外基质蛋白，如 I 型胶原蛋白 [10 μg/cm2]、纤连蛋白 [5 μg/cm2]、玻璃粘连蛋白 [0.5 μg/cm2] 或 弹性蛋白 [10 μg/cm2]。包被方法与层粘连蛋白包被所述方法类似。确保溶液完全覆盖各孔底部。</li>
	<li>用塑料膜包裹培养板，置于 4°C 平面上过夜，以使层粘连蛋白吸附至孔底。在此条件下，培养板至少可保存一周，同时仍保持良好的细胞外基质功能。</li>
	<li>次日，在无菌条件下，用 1X PBS 洗涤各孔 3 次。</li>
	<li>向每个孔中加入 1 ml 含 1% BSA 的 1X PBS 溶液，37°C 孵育 1 小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。</li>
	<li>用 1X PBS 洗涤培养板 3 次，以去除未吸附的蛋白质。</li>
	<li>将培养板置于 37°C 的 DMEM 中，直至完成步骤 2.14 的细胞分离。</li>
</ol>
2. 胎鼠肺II型上皮细胞的分离
分离前一日，将带有不同孔径尼龙筛网的筛杯进行高压灭菌，并准备就绪。
<ol>
	<li>在妊娠 E17-19 天时获取定时妊娠小鼠/大鼠的胎肺组织，将组织转移至含有 DMEM 培养基的 50 ml 锥形管中，并置于冰上。</li>
	<li>在 50 ml 锥形管中配制消化缓冲液（总体积 10 ml），此体积适用于约 20 只小鼠/大鼠胎肺组织： 
	8.5 ml DMEM 
	0.5 ml 500 mM pH 7.4 HEPES 
	5 mg 胶原酶 1（Collagenase 1） 
	5 mg 胶原酶 1A（Collagenase 1A） 
	1 ml 鸡血清（heat inactivated）</li>
	<li>充分混匀直至所有组分完全溶解，并在无菌操作台中使用 0.2 微米注射器滤器过滤。将含有消化缓冲液的锥形管置于 37°C 水浴中预热。</li>
	<li>移除步骤 2.1 中锥形管内的 DMEM 培养基，将组织转移至无菌培养皿中。</li>
	<li>使用无菌剪刀或剃刀片充分剪碎肺组织，使其成为小于 1 mm 的组织块，然后将组织转移至含有步骤 2.3 中预热消化缓冲液的锥形管中。</li>
	<li>通过反复吹打进行组织消化： 
	使用 10 ml 移液器吹打 100 次 
	使用 5 ml 移液器吹打 100 次 
	使用巴斯德移液器吹打 100 次</li>
	<li>将匀浆液在室温下以 1,300 rpm 离心 5 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，并将含有细胞的沉淀重悬于 15 ml DMEM 加 20% 胎牛血清（FBS）中。</li>
	<li>取出带有 100、30 和 15 微米尼龙筛网的筛杯，并将其放置于无菌的 150 ml 烧杯上。</li>
	<li>将步骤 2.8 得到的细胞匀浆液依次通过 100、30 和 15 微米筛网的筛杯进行过滤。</li>
	<li>用含 10% FBS 的 DMEM 多次冲洗 30 和 15 微米筛网，收集未通过筛网的成团细胞，以促进非上皮细胞的去除。</li>
	<li>弃去 15 微米筛网的滤过液，该部分主要含有成纤维细胞。</li>
	<li>将步骤 2.11 中获得的细胞接种于 75 cm2 培养瓶中，于 37°C 孵育 30 分钟（每瓶约加入 10 ml 细胞悬液），以进一步纯化 II 型肺泡上皮细胞。</li>
	<li>收集上清液，并在室温下以 1,300 rpm 离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>小心吸除上清液，并将含有细胞的沉淀重悬于无血清 DMEM 中。重悬体积根据处理的组织量而定。通常情况下，我们将相当于一只胎鼠来源的细胞接种至每孔（2 ml），以使次日细胞融合度达到 60–70%。</li>
	<li>将细胞悬液接种至预先用层粘连蛋白（laminin）或纤连蛋白（fibronectin）包被的 Bioflex 六孔板中。</li>
</ol>
3. 胎鼠肺成纤维细胞的分离
<ol>
	<li>按照上述第2.11步之前所述的相同步骤进行II型细胞的分离。</li>
	<li>取15微米滤网的滤过液（无需预先洗涤；体积约为10–15 ml），将其接种至75 cm2培养瓶中，在37°C孵育30–60分钟，使成纤维细胞贴壁。</li>
	<li>吸除上清液，更换为无血清DMEM，继续孵育过夜。</li>
	<li>次日，使用含0.4 mM EDTA的0.25%（wt/vol）胰蛋白酶消化收集细胞，并将其接种至预先用纤维连接蛋白包被的Bioflex培养板上。</li>
</ol>
4. 为肺细胞提供机械刺激的实验系统
<ol>
	<li>将细胞（约50%汇合度）接种于Bioflex培养板中，每孔加入2 ml无血清DMEM，置于培养箱中孵育至少6小时，使细胞贴壁并充分伸展，之后方可进行实验。通常情况下，本实验室在施加机械应变前会将细胞继续培养约24小时。若实验需要特定数量的细胞，在分离后，II型细胞将在无血清DMEM中于75 cm²培养瓶中维持培养2 培养瓶，次日用胰蛋白酶消化细胞，计数后接种。</li>
	<li>次日，更换为新鲜的无血清DMEM（2 ml/孔），并将BioFlex板安装至Flexcell FX-5000应力加载系统。实验开始前，细胞单层汇合度不应超过80%。</li>
	<li>对膜施加等双轴应变。应变方案根据机械力的模拟条件而变化 体内 （参见讨论部分）。</li>
	<li>在平行培养的未拉伸膜上生长的细胞用作对照。</li>
	<li>实验结束后，可对单层细胞进行处理，以通过实时荧光定量PCR分析基因表达变化（例如表面活性蛋白C），或通过蛋白质印迹法检测蛋白丰度等。此外，单层细胞也可固定后用于免疫细胞化学实验。对于该技术，固定后需将硅胶膜从培养板中取出，并使用10-20 μl 以水作为封片剂，在透化及抗体孵育前使用。上清液也可用于检测生长因子、细胞因子等成分的存在。</li>
</ol>
5. 代表性结果
图1和图2 展示了使用本文所述方法分离的E18胎鼠II型细胞的代表性相差显微照片。
图3 表明，使用表面活性蛋白C作为标志物，机械应变可诱导胎儿II型上皮细胞分化。
<img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig1.jpg" alt="显示组织培养分析中集落形成的细胞增殖显微镜图像。" data-altupdatedat="1787630408000"> 
图1. 分离后立即拍摄的代表性相差显微照片，显示胎儿Ⅱ型细胞的成团外观。
<img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig2.jpg" alt="显微镜下的细胞生长、显微图像、细胞培养、生物学研究、细胞分析。" data-altupdatedat="1787630408000"> 
图2. 按照本文所述方法分离E18胎鼠II型上皮细胞，并接种于包被有层粘连蛋白的BioFlex培养板上。照片拍摄于次日，细胞经多聚甲醛固定后观察非拉伸状态下的形态。通过显微镜下观察上皮细胞形态及表面活性蛋白C（SP-C）免疫染色分析，确定细胞纯度为90 ± 5%。
<img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig3.jpg" alt="蛋白质表达分析，SP-C mRNA 表达，柱状图，显微镜图像，对照组与拉伸组。" data-altupdatedat="1787630408000"> 
图 3. 胎儿Ⅱ型上皮细胞在 40 次/分钟的频率下暴露于 5% 的周期性应变，持续 16 小时。A) 表面活性蛋白 C（SP-C）mRNA 表达的 Northern 印迹结果显示，在不同细胞外基质（ECM）基底上，应变可诱导Ⅱ型细胞分化。+/- 符号分别表示是否暴露于应变。数据以均值 ± 标准误表示，n=3；* P&lt;0.05。B) 荧光免疫细胞化学图像显示暴露于机械应变（实验组）或未暴露（对照组）的胎儿Ⅱ型细胞中 SP-C 蛋白水平（绿色）。细胞核用 DAPI 复染（蓝色）。标尺，10 μm。C) 来自三项实验的 Western 印迹结果表明，机械拉伸可增加 SP-C 蛋白水平。n=3；* P&lt;0.05。

<ol><li>Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+forces+on+lung-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression.</a> Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+promotes+alveolar+epithelial+type+II+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation.</a> J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+stretch+inhibits+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+in+fetal+rat+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).</li>
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<li>Harding, R., Liggins, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thoracic+dimensions+induced+by+breathing+movements+in+fetal+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Fertil.+Dev%22%5BJournal%5D)">Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep.</a> Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文描述了一种分离胎儿II型上皮细胞和成纤维细胞的方法，并利用Flexcell应变仪对这些细胞施加机械刺激。我们已采用该技术评估上皮细胞的分化过程1,2，并研究由牵张激活的受体及信号通路3-9。此外，该方法也可用于探究由机械损伤诱导的细胞反应10,11。该操作基于用胶原酶消化肺组织，并利用II型细胞在消化后易于聚集的特性。实施该技术的关键步骤包括：充分剪碎组织以促进肺组织的消化，以及使用30和15微米筛网对未过滤的细胞进行彻底洗涤，以利于去除非上皮细胞，从而获得更高纯度的II型细胞。
我们的实验室使用包被了胶原蛋白或层粘连蛋白的膜来模拟基底膜的细胞外基质成分。然而，当细胞受到20%的拉伸时，细胞可能在拉伸过程中从基底上脱落，因此应考虑将纤连蛋白作为替代基底。
另一个重要的考虑因素是，在拉伸前应避免细胞单层达到100%汇合度，因为这可能促进细胞与细胞之间的接触，而非细胞与基质之间的接触，从而导致细胞可能无法“感知”到实验方案所设定的伸长百分比。
<p cl...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>鸡血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>筛网杯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-25</td><td></td></tr><tr><td>100微米尼龙网</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-100-D</td><td></td></tr><tr><td>30微米滤网</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-30-D</td><td></td></tr><tr><td>15微米滤网</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX15</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白-1</td><td>Collagen Biomed</td><td>PC0701</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>玻璃粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-0132</td><td></td></tr><tr><td>弹性蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6402</td><td></td></tr><tr><td>Bioflex培养板</td><td>Flexcell International</td><td>BF-3001U</td><td>未包被</td></tr><tr><td>Flexcell应力加载装置</td><td>Flexcell International</td><td>FX-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

研究胎儿肺细胞力传导机制的实验系统

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

机械力的产生 在子宫内 通过类似呼吸的重复性运动和液体扩张对正常肺发育至关重要。肺发育的一个关键环节是肺泡II型上皮细胞的分化，这类细胞是肺表面活性物质的主要来源。这些细胞还参与肺泡腔内的液体稳态、宿主防御以及损伤修复。此外，出生后机械通气期间，远端肺实质细胞可能直接暴露于过度拉伸的环境中。然而，肺细胞感知机械刺激以影响肺发育并促进肺损伤的精确分子与细胞机制尚未完全阐明。本文提供一种简单且高纯度的方法，用于从啮齿类动物胎儿肺组织中分离II型细胞和成纤维细胞。随后，我们描述了一种 体外 系统，Flexcell 应变仪，用于对胎儿细胞施加机械刺激，模拟胎儿肺发育或肺损伤过程中的机械力。该实验系统为研究暴露于牵张力下的胎儿肺细胞的分子与细胞机制提供了优良工具。利用该方法，本实验室已鉴定出多个参与胎儿肺发育及肺损伤中力传导过程的受体和信号蛋白。

机械力在肺发育和肺损伤中起着关键作用。本文介绍一种分离啮齿类动物胎儿肺Ⅱ型上皮细胞和成纤维细胞并利用机械刺激对其进行处理的方法 体外 系统。

在子宫内，由重复的类似呼吸运动和液体扩张产生的机械力对正常肺发育至关重要。一个关键的……

本实验的目的是描述一种用于研究胎儿肺细胞机械转导的实验体系。该体系通过使用细胞外基质蛋白包被培养板来实现。随后分离胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞，再分离胎鼠肺成纤维细胞。最后一步描述了一种体外系统，用于对肺细胞施加机械刺激。最终可通过实时PCR、蛋白质印迹和荧光免疫化学图像获得结果，显示II型细胞分化增加。这些方法有助于回答机械转导领域中的关键科学问题，例如胎儿肺发育和肺损伤。演示该实验步骤的是我实验室的技术员Julian gu。在超净工作台内无菌操作，每块培养板使用12毫升冰冷的无菌1×PBS配制120微克层粘连蛋白。也可使用其他细胞外基质蛋白进行包被。具体细节请参阅书面实验方案，然后取一块BioFlex未处理培养板，向每个孔中加入2毫升层粘连蛋白溶液，使其终浓度为每平方厘米2微克。确保溶液完全覆盖各孔。用塑料封膜将板子完全覆盖，置于4°C环境中过夜，以使包被物吸附到各孔底部。包被后的板子在此条件下至少可保存一周，且次日仍能保持良好的细胞外基质功能。在无菌条件下，用1×PBS洗涤各孔三次。然后每孔加入1 mL含1% BSA的1×PBS。37°C孵育1小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。随后，用一倍体积的磷酸盐缓冲液（XPBS）洗涤各孔三次。为去除未吸附的蛋白质，向每孔中加入一毫升 DMEM 培养基。然后将培养板置于 37 摄氏度环境中，直至胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离完成并准备接种。在开始细胞分离操作的前一天，使用130微米和15微米的尼龙筛网组装筛网杯，并通过高压灭菌进行消毒。在培养当天，同样对等数量的150毫升玻璃尖端进行高压灭菌。从妊娠第17至19天的定时交配孕鼠中获取胎肺组织。将组织转移至含有DMEA培养基的50毫升离心管中，并置于冰上。根据书面实验方案中的配方，在另一50毫升离心管中配制新鲜的消化缓冲液。在超净工作台内操作时，使用0.2微米针头滤器对缓冲液进行过滤除菌。此缓冲液10毫升足以用于约20只小鼠胚胎获得的肺组织。将含有消化缓冲液的锥形管置于37摄氏度水浴中。用无菌剪刀或刀片将胚胎肺组织从锥形管中取出，并转移至无菌培养皿中，将组织切碎成小于1毫米大小的碎片。然后将组织转移至含有预热消化缓冲液的锥形管中。接下来，使用孔径依次减小的移液器，将胎儿肺细胞悬液上下吹打各100次，以机械辅助方式促进组织消化。消化过程完成后，在室温下以1,300 RPM离心5分钟。然后小心地通过吸除上清液，并将含有细胞的沉淀重悬于15毫升含20%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中。接着取出带有130微米和15微米尼龙筛网的筛杯，放置在无菌的150毫升烧杯上方。用移液器将细胞匀浆液加入100微米筛网中。收集滤液，并用移液管将其转移至30微米筛网上。用新鲜的DMEM（含10% FBS）多次冲洗30微米筛网。大多数II型细胞会聚集成团，无法通过筛网。这些洗涤步骤可去除可能附着在团块上的非上皮细胞。将30微米滤网的滤液转移至15微米滤网筛杯中，再次如前所述洗涤数次。此步骤可富集可能通过30微米滤网的II型细胞。收集来自30微米和15微米滤网的未过滤成团细胞，用于进一步富集II型细胞。如果需要培养胎鼠肺成纤维细胞，则保留15微米滤网的滤过液。否则，弃去此滤液。进一步通过向30微米和15微米筛网杯中的未过滤细胞添加培养基，并将其置于75平方厘米的组织培养瓶中，在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟，以纯化II型上皮细胞群体。孵育结束后，同前法离心上清液，弃去上清，将细胞沉淀重悬于2毫升无血清DMEM培养基中，用移液器将1毫升细胞悬液加入经层粘连蛋白包被的BioFlex六孔板的每个孔中。此时在显微镜下观察，细胞呈团块状。将培养板置于设定为37摄氏度和5%二氧化碳的组织培养箱中孵育。最佳孵育时间为24小时，最少孵育时间需6小时。开始机械应变实验之前，取15微米滤网的滤液，转移至75平方厘米的组织培养瓶中，在37摄氏度下孵育30至60分钟，使成纤维细胞贴壁，随后吸除并弃去上清液。然后用无血清DMEM替换培养瓶中的液体，过夜孵育。次日，使用含0.4毫摩尔EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，并将细胞接种于纤维连接蛋白包被的BioFlex培养板上，在设定为37摄氏度和5%二氧化碳的组织培养孵箱中孵育，建议孵育24小时后再开始机械应变实验。如果实验需要特定数量的细胞，则至少需要六小时的孵育时间。2型细胞在分离后置于无血清DMEM的75平方厘米培养瓶中培养，次日进行胰蛋白酶消化、计数，然后接种。实验开始前，单层细胞融合度不应超过80%。在进行机械刺激实验当天，每孔更换为2 mL新鲜的无血清DMEM培养基，然后将培养板安装至Flexcell FX-5000™应变单元中。接下来，对膜施加 EQU 双轴应变。应变方案根据体内机械力的模拟情况而有所不同。如书面方案中所述，在非-ST拉伸的膜上培养的细胞。平行培养的细胞用作实验的对照。实验结束时，可对单层细胞进行处理，通过实时 PCR 分析基因表达的变化，或通过蛋白质印迹法分析蛋白质丰度的变化。此外，单层细胞也可固定用于该技术的免疫化学实验。固定后，将细胞膜从培养板上切下，用 10 至 20 微升水作为封片剂，将膜置于载玻片上，随后进行透化处理并用抗体孵育。实验中获得的上清液也可用于检测释放的物质，如生长因子或细胞因子。该图像显示的是经戊二醛固定的 E18 胎儿Ⅱ型上皮细胞，这些细胞按照本方案分离，并接种于涂有层粘连蛋白的 BioFlex 培养板上。细胞经过固定后拍摄了照片。非ST拉伸细胞接种后的第二天进行实验。通过显微镜下观察上皮细胞形态及表面活性蛋白C的免疫染色分析，确定细胞纯度为90±5%。以下图示数据来自胎儿肺泡Ⅱ型上皮细胞，这些细胞在40次/分钟的频率下暴露于5%的周期性应变，持续16小时。该表面活性蛋白C mRNA表达的Northern印迹显示，在不同细胞外基质底物条件下，牵张应变可诱导II型细胞分化。加号和减号分别表示施加应变和未施加应变。表达数据以柱状图形式呈现，误差线表示均值±标准误（SEM），n=3，星号表示P值小于0.05。这些荧光免疫化学图像显示了表面活性蛋白C蛋白的水平，呈绿色。左侧为未受到机械应变的胎儿Ⅱ型细胞，右侧为受到机械应变的胎儿Ⅱ型细胞，细胞核经DAPI复染后呈蓝色。该直方图对三次实验的Western印迹结果进行了定量分析，表明机械拉伸可增加表面活性蛋白C蛋白的水平。在此实验中，N 等于 3，星号表示 P 值小于 0.05。观看本视频后，您应充分了解如何加速胎儿肺细胞并使其暴露于机械拉伸。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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