利用神经球实验分离与扩增人脑胶质母细胞瘤多形性肿瘤细胞

本实验方案的目标是利用神经球培养法分离并扩增人多形性胶质母细胞瘤肿瘤细胞。首先将获取的肿瘤组织进行切碎，随后进行机械解离，最后将所得细胞接种于神经球培养体系中进行培养。在本视频中，我们将展示如何利用神经球培养法从人胶质母细胞瘤肿瘤组织中分离并扩增具有干细胞特性的细胞。

该方法也可用于培养其他脑肿瘤以及乳腺、前列腺、肝脏和肺等实体瘤的细胞。好的，我们开始吧。手术获取切除的胶质母细胞瘤（GBM）组织后，去除培养基。

使用无菌 PBS 清洗肿瘤两到三次，以去除血液和碎片等污染物。清洗后，将切除的肿瘤放入无菌培养皿中。首先将肿瘤切成较小的组织块，然后取一部分肿瘤组织转移至另一个培养皿中，使用10号手术刀将组织切碎成微小碎片。

这将增加可用于酶解离的表面积。切碎过程可能需要一到三分钟，具体时间取决于肿瘤的大小。现在向切碎的组织中加入三到五毫升预热的胰蛋白酶，并将其转移至一个15毫升无菌Falcon管中。

将15 mL离心管置于37°C水浴中10至15分钟。每5分钟摇动一次试管。为确保更好的组织消化效果，加入等体积的胰蛋白酶抑制剂以终止反应。

通过上下吹打数次确保胰蛋白酶充分激活。将悬液在800 RRP M或110 G条件下离心5分钟。弃去上清液，然后将沉淀物重悬于1 ml神经干细胞基础培养基中，移液枪头紧贴离心管底部进行操作。

上下吹打3到7次以分散团块，直至形成乳白色悬液，过度吹打可能导致细胞死亡。将一个40微米滤膜置于50 ml离心管上。向细胞悬液中加入10至15 ml基础培养基，轻轻混匀，然后将细胞悬液经40微米滤膜过滤，以去除碎片和未解离的团块。

将细胞离心并吸除上清液。用一到两毫升完全培养基重悬细胞，然后轻轻吹打混匀，使细胞悬浮液均匀。

将10微升细胞悬液与90微升台盼蓝混合。充分混匀悬液后，取10微升加入血细胞计数板中。按此处所示进行细胞计数。

需要制备单细胞悬液，确保无细胞团块，以获得准确的细胞计数。计数时不应包含台盼蓝染色阳性的细胞。将细胞接种至T80培养瓶时进行计数。

向50 ml离心管中加入20 ml完全神经干细胞培养基。加入适量细胞悬液，使细胞密度达到每毫升200,000个细胞。然后加入EGF，使其终浓度为每毫升20纳克。

每毫升加入浓度为1 µL的0.2%肝素。最后加入bFGF，使其终浓度达到10 ng/mL。将细胞混入添加了生长因子的完全培养基中。

然后将悬液转移至T 80培养瓶中，并将培养瓶置于37摄氏度、5%CO2的培养箱中培养7至10天。培养8天后，细胞球已完全生长，可进行传代。

收集烧瓶中的内容物，转移至两个50 ml离心管中。在800 RPM条件下离心5分钟。抽去上清液，然后将沉淀物重悬于1 ml预热的胰蛋白酶溶液中。

将细胞置于37摄氏度水浴中孵育2分钟。加入等量的胰蛋白酶抑制剂，充分混匀以确保终止反应。然后离心收集细胞沉淀。

移除上清液，并将细胞重悬于 1 ml 完全培养基中，轻轻吹打混匀以获得均匀的细胞悬液。按照前述方法进行细胞计数，然后将细胞接种至 T80 培养瓶中，每 50 ml 离心管中加入 20 ml 完全培养基。加入适量的细胞悬液，使细胞密度达到每毫升 50,000 个细胞。

现在加入生长因子，包括 E-G-F、B-F-G-F 和肝素，浓度按前述方法进行。轻轻混匀所得的细胞悬液，然后将悬液转移至 T80 培养瓶中，放入培养箱培养 7 至 10 天。以下是一个原代 GBM 培养的示例。

在此阶段培养四天后，可以看到细胞正在增殖并开始形成球状结构。此阶段不应观察到大的细胞球形聚集体，若出现则可能是由于组织制备不当所致。

培养 7 到 10 天后，会形成大小不一的细胞球。当细胞球的平均直径达到 150 至 200 微米时，即可进行传代。此图显示的是培养 8 天后的 GBM 传代培养示例。同样可以看到大小不一的细胞球，健康的细胞球在其周边表现出微小突起。

制备单细胞悬液在任何类球体培养中都是非常重要的环节。否则，即使在接种细胞后的第二天，仍可能观察到细胞聚集体。这些聚集体可能被误认为是类球体，但需要注意的是，细胞形成真正的类球体至少需要一周时间。

原发性肿瘤球体培养物中的碎片量因多种因素而异，例如组织来源、组织切除的精确程度以及组织处理技术。希望本视频对您有所帮助，并祝您的实验顺利成功。