Name: 人类胶质母细胞瘤肿瘤细胞的分离和扩大使用的神经球含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学习使用神经球培养法从人胶质母细胞瘤组织中分离和扩增肿瘤干细胞样细胞的方法。本方案涵盖组织处理、酶解消化及细胞培养等关键步骤，为脑肿瘤生物学研究提供可靠的技术支持。

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本研究由佛罗里达脑肿瘤研究中心及小普雷斯顿·A·威尔斯脑肿瘤治疗中心资助。

1. 原发性胶质母细胞瘤组织的采集
<ol>
	<li>从确诊患有胶质母细胞瘤多形性（GBM）并接受手术的患者体内获取GBM肿瘤组织。</li>
	<li>必须事先与神经外科团队协调安排。神经外科医生将切除的GBM肿瘤组织置于适当大小的管中，管内含有添加了10-15%抗生素（青霉素/链霉素）的神经干细胞（NSC）基础培养基。实验室需向手术室提供低温培养基。 alternatively，也可使用含高浓度抗生素的低温HEPES缓冲最低必需培养基（HEM）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）。</li>
	<li>切除的肿瘤组织需冰上运送至实验室，并置于生物安全柜中。</li>
</ol>
2. 将原发性肿瘤解离为单细胞悬液
<ol>
	<li>从 Falcon 管中移除过量的原始培养基/PBS，并用 5–10 ml PBS/NSC 基础培养基将样本洗涤 2–3 次，以去除血液和碎片。吸除 PBS/培养基后，将 GBM 肿瘤组织置于培养皿中。</li>
	<li>将组织切成小块，并使用 10 号手术刀片进一步切碎成微小碎片，以增加胰蛋白酶消化过程的表面积。切碎时间根据肿瘤大小而定，通常需要 1–3 分钟。</li>
	<li>将切碎的组织在 3–5 ml 预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中于 37°C 水浴中消化 10–15 分钟。使用电子移液器将微小的肿瘤组织碎片和胰蛋白酶转移至 15 ml Falcon 管中。</li>
	<li>孵育结束后，加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶的酶解反应。</li>
	<li>通过多次上下吹打悬液确保胰蛋白酶完全失活，随后在 800 rpm（110g）条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将组织碎片重悬于 1 ml 无菌 NSC 基础培养基中。通过轻柔地上下吹打（3–7 次）使团块解离，直至获得均匀乳白色的单细胞悬液。吹打次数取决于切碎组织中颗粒的大小。应避免长时间或剧烈的机械解离，以免导致细胞死亡并降低成球能力。</li>
	<li>为去除未解离的组织块和碎片，向管中加入 10–15 ml 基础培养基，并将细胞悬液经 40 微米细胞滤网过滤至 50 ml 管中。</li>
	<li>将过滤后的悬液在 800 rpm（110g）条件下离心 5 分钟，随后弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀的细胞重悬于 1–2 ml 完全 NSC 培养基中，用于细胞计数。</li>
</ol>
3. 细胞计数与接种
<ol>
	<li>取10 μL细胞悬液加入含有90 μL 0.04%台盼蓝的1 mL离心管中。 
	注意：也可使用其他适当的细胞稀释比例。</li>
	<li>吹打混匀悬液，取10 μL细胞与台盼蓝混合液转移至血细胞计数板，用于细胞密度计数。</li>
	<li>将细胞接种于完全神经干细胞培养基中（神经干细胞基础培养基与神经干细胞增殖添加剂按9:1比例混合），并添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF以及1 μL/mL 0.2%肝素（终浓度2 μg/mL），培养基体积根据组织培养容器规格选择：T25、T80和T175培养瓶分别使用5 mL、20 mL和40 mL。可根据需要在培养基中添加抗生素（终浓度1:100），以降低污染风险。</li>
	<li>将培养瓶置于37°C、5% CO2的培养箱中培养。</li>
</ol>
4. 胶质母细胞瘤来源类球体的传代与扩增：
<ol>
	<li>当神经球直径达到平均 150–200 μm 时，培养物即可进行传代。将每个培养瓶中的内容物转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以 800 rpm（110 g）离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于 1 ml 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中。</li>
	<li>为实现最佳消化效果，将细胞悬液于 37°C 水浴中孵育 2–3 分钟。为终止胰蛋白酶活性，向细胞悬液中加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂，并轻轻吹打混匀。</li>
	<li>将细胞悬液以 800 rpm（110 g）离心 5 分钟，弃去上清液，再将细胞重悬于 1 ml NSC 培养基中。</li>
	<li>按前述方法进行细胞计数。</li>
	<li>将细胞以 5×104 个细胞/ml 的浓度接种于含生长因子的完全 NSC 培养基中，并根据前述部分所述接种至适当大小的组织培养容器中。</li>
	<li>在 37°C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中孵育 7–10 天后，可形成次级神经球。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
将从胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤组织中分离的单细胞接种后，肿瘤干细胞样细胞在3-4天内增殖并形成由少量细胞组成的小细胞簇（见视频和图1）。随着这些细胞簇的生长，其形态逐渐趋于球形，至7-8天时可形成直径平均为150-200微米、相位对比下明亮清晰的典型球状结构（见视频和图2）。在更高倍镜下观察，健康的球状结构通常在其周边可见微绒毛样突起。培养开始后1-2天内即出现较大的类球状细胞簇，通常是由于培养初期存在未充分解离的细胞团块所致，不应误判为真正的肿瘤球。原代肿瘤球培养中碎片的多少取决于组织来源本身以及是否包含周围脑组织。采用适当的组织处理技术，包括酶消化与机械解离，并在足量培养基中对样本进行充分过滤，可有效减少培养体系中的碎片。
<img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="显微镜图像中的细胞分裂过程，显示细胞有丝分裂的各个阶段。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 接种后第4天的原代胶质母细胞瘤球体培养。肿瘤干细胞样细胞在3-4天内增殖并形成小的细胞簇。原始放大倍数：20×。
<img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="类球体形成、显微镜图像、细胞培养技术、体外三维模型、癌症研究" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 接种后第8天的胶质母细胞瘤（GBM）类球体培养物（第一代）。原始放大倍数：20×。

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li>
<li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li>
<li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

为了从正常的成年和胎儿脑组织1, 2, 3, 4中分离神经干细胞和祖细胞，以及从肺癌5、前列腺癌6、乳腺癌7和脑癌8, 9等肿瘤组织中分离肿瘤干细胞样细胞，神经球实验（neurosphere assay）已被广泛用作首选方法。利用这一简单且可重复的实验方法，可以从切除的肿瘤组织中获得数量无限的细胞，这些细胞表现出与体细胞干细胞相似的特性：体外多向分化潜能、植入后形成新肿瘤的能力以及自我更新能力。这些细胞可用于研究癌症细胞的基本生物学特性，包括细胞间相互作用，以及分化、迁移、侵袭和细胞死亡等过程。此外，分离得到的肿瘤干细胞样细胞为研究肿瘤的形成、进展和复发机制提供了极为宝贵的工具，也有助于揭示其背后的驱动性细胞机制，最终可能为治疗策略的开发提供新的思路。

<table><tbody><tr><td>NeuroCult NSC 基础培养基（人源）</td><td>培养基</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05750</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult NSC 增殖添加剂（人源）</td><td>培养基添加剂</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05753</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>*MEM</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41500-018</td><td>HEM 组分</td></tr><tr><td>*HEPES</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>HEM 组分</td></tr><tr><td>*蒸馏水</td><td>试剂 </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>**DNase I</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td>104159</td><td></td></tr><tr><td>**大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>10 号手术刀片</td><td>手术工具</td><td>BD Biosciences</td><td>371610</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>培养器皿</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>小型镊子</td><td>手术工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网</td><td>筛具</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>培养器皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>T80 培养瓶</td><td>培养器皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td>178905</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>培养器皿</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>培养器皿</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>生长因子</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2028-EG</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>生长因子</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3139-FB</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>生长因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td>用 PBS 重悬</td></tr><tr><td colspan="5">* 配制 HEM：取 1 包 10 L 的 1× MEM 粉末与 160 ml 1 M HEPES 混合，用蒸馏水定容至 8.75 L，调节最终 pH 至 7.4，并于 4&amp;#x00B0;C 保存。</td></tr><tr><td colspan="5">** 配制胰蛋白酶抑制剂溶液：首先配制 10 ml DNase I 溶液（将 100 mg DNase 溶解于 100 ml HEM 中），然后向 DNase 溶液中加入 0.14 g 胰蛋白酶抑制剂，最后用 HEM 定容至 1 L。将终产物分装后保存于 -20&amp;#x00B0;C 冰箱中。</td></tr></tbody></table>

利用神经球实验分离与扩增人脑胶质母细胞瘤多形性肿瘤细胞

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

已在乳腺、肺、结肠、前列腺和脑等肿瘤中分离出具有干细胞特性的细胞。在所有这些肿瘤中，尤其是多形性胶质母细胞瘤（GBM）中，一个关键问题在于识别并分离出肿瘤起始细胞群体，以研究其在肿瘤形成、进展和复发中的作用。了解肿瘤起始细胞群体将为寻找这些肿瘤的有效治疗策略提供线索。神经球培养法（NSA）由于其操作简便且可重复性强，已被广泛用作分离和扩增多种此类肿瘤细胞的首选方法。本实验方案展示了利用神经球培养法从手术切除的人源GBM肿瘤组织中分离并扩增干细胞样细胞的技术流程。该操作包括首先对肿瘤组织进行化学消化和机械解离，获得单细胞悬液，随后将其接种于NSA培养体系中。培养7-10天后，可观察到直径为150-200 μm的初级神经球，此时即可进行后续传代与扩增。

本视频方案演示了利用神经球培养法从手术切除的人源多形性胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤组织中分离并扩增类干细胞的操作流程。

类干细胞已在乳腺、肺、结肠、前列腺和脑等肿瘤中被分离出来。在所有这些肿瘤中，尤其是……

本实验方案的目标是利用神经球培养法分离并扩增人多形性胶质母细胞瘤肿瘤细胞。首先将获取的肿瘤组织进行切碎，随后进行机械解离，最后将所得细胞接种于神经球培养体系中进行培养。在本视频中，我们将展示如何利用神经球培养法从人胶质母细胞瘤肿瘤组织中分离并扩增具有干细胞特性的细胞。该方法也可用于培养其他脑肿瘤以及乳腺、前列腺、肝脏和肺等实体瘤的细胞。好的，我们开始吧。手术获取切除的胶质母细胞瘤（GBM）组织后，去除培养基。使用无菌 PBS 清洗肿瘤两到三次，以去除血液和碎片等污染物。清洗后，将切除的肿瘤放入无菌培养皿中。首先将肿瘤切成较小的组织块，然后取一部分肿瘤组织转移至另一个培养皿中，使用10号手术刀将组织切碎成微小碎片。这将增加可用于酶解离的表面积。切碎过程可能需要一到三分钟，具体时间取决于肿瘤的大小。现在向切碎的组织中加入三到五毫升预热的胰蛋白酶，并将其转移至一个15毫升无菌Falcon管中。将15 mL离心管置于37°C水浴中10至15分钟。每5分钟摇动一次试管。为确保更好的组织消化效果，加入等体积的胰蛋白酶抑制剂以终止反应。通过上下吹打数次确保胰蛋白酶充分激活。将悬液在800 RRP M或110 G条件下离心5分钟。弃去上清液，然后将沉淀物重悬于1 ml神经干细胞基础培养基中，移液枪头紧贴离心管底部进行操作。上下吹打3到7次以分散团块，直至形成乳白色悬液，过度吹打可能导致细胞死亡。将一个40微米滤膜置于50 ml离心管上。向细胞悬液中加入10至15 ml基础培养基，轻轻混匀，然后将细胞悬液经40微米滤膜过滤，以去除碎片和未解离的团块。将细胞离心并吸除上清液。用一到两毫升完全培养基重悬细胞，然后轻轻吹打混匀，使细胞悬浮液均匀。将10微升细胞悬液与90微升台盼蓝混合。充分混匀悬液后，取10微升加入血细胞计数板中。按此处所示进行细胞计数。需要制备单细胞悬液，确保无细胞团块，以获得准确的细胞计数。计数时不应包含台盼蓝染色阳性的细胞。将细胞接种至T80培养瓶时进行计数。向50 ml离心管中加入20 ml完全神经干细胞培养基。加入适量细胞悬液，使细胞密度达到每毫升200,000个细胞。然后加入EGF，使其终浓度为每毫升20纳克。每毫升加入浓度为1 µL的0.2%肝素。最后加入bFGF，使其终浓度达到10 ng/mL。将细胞混入添加了生长因子的完全培养基中。然后将悬液转移至T 80培养瓶中，并将培养瓶置于37摄氏度、5%CO2的培养箱中培养7至10天。培养8天后，细胞球已完全生长，可进行传代。收集烧瓶中的内容物，转移至两个50 ml离心管中。在800 RPM条件下离心5分钟。抽去上清液，然后将沉淀物重悬于1 ml预热的胰蛋白酶溶液中。将细胞置于37摄氏度水浴中孵育2分钟。加入等量的胰蛋白酶抑制剂，充分混匀以确保终止反应。然后离心收集细胞沉淀。移除上清液，并将细胞重悬于 1 ml 完全培养基中，轻轻吹打混匀以获得均匀的细胞悬液。按照前述方法进行细胞计数，然后将细胞接种至 T80 培养瓶中，每 50 ml 离心管中加入 20 ml 完全培养基。加入适量的细胞悬液，使细胞密度达到每毫升 50,000 个细胞。现在加入生长因子，包括 E-G-F、B-F-G-F 和肝素，浓度按前述方法进行。轻轻混匀所得的细胞悬液，然后将悬液转移至 T80 培养瓶中，放入培养箱培养 7 至 10 天。以下是一个原代 GBM 培养的示例。在此阶段培养四天后，可以看到细胞正在增殖并开始形成球状结构。此阶段不应观察到大的细胞球形聚集体，若出现则可能是由于组织制备不当所致。培养 7 到 10 天后，会形成大小不一的细胞球。当细胞球的平均直径达到 150 至 200 微米时，即可进行传代。此图显示的是培养 8 天后的 GBM 传代培养示例。同样可以看到大小不一的细胞球，健康的细胞球在其周边表现出微小突起。制备单细胞悬液在任何类球体培养中都是非常重要的环节。否则，即使在接种细胞后的第二天，仍可能观察到细胞聚集体。这些聚集体可能被误认为是类球体，但需要注意的是，细胞形成真正的类球体至少需要一周时间。原发性肿瘤球体培养物中的碎片量因多种因素而异，例如组织来源、组织切除的精确程度以及组织处理技术。希望本视频对您有所帮助，并祝您的实验顺利成功。

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在背根神经节轴突-少突胶质细胞共培养体系中实时监测人胶质瘤细胞迁移

本文详细描述了一种从出生后小鼠主要神经发生微环境来源的神经干细胞建立神经球培养物的实验方案。神经球可用于鉴定脑组织中的神经干细胞，从而估算前体细胞的数量。此外，这些三维结构可在诱导分化条件下接种，分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，进而用于细胞命运的研究。...

从出生后（P1–3）小鼠神经发生微环境中分离与扩增神经球

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

本文介绍了一种易于使用的胶质母细胞瘤侵袭实验方法。该实验适用于胶质母细胞瘤干细胞样细胞。同时介绍了一种用于便捷定量分析侵袭、迁移和增殖的Fiji宏工具。...

一种用于胶质母细胞瘤的三维球状模型

我们介绍一种利用新诊断和复发性肿瘤患者来源的磁性胶质瘤球体构建的三维胶质母细胞瘤迁移模型。该平台可实现对患者特异性迁移动态的可视化，并可用于评估治疗效果。在迁移完成后，该检测方法还可进行多重分析，以评估蛋白质的定位和表达模式。...

可重复的缺氧条件下磁性纳米颗粒介导类球体定位的三维胶质母细胞瘤迁移实验

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