人类胶质母细胞瘤肿瘤细胞的分离和扩大使用的神经球含量

这个视频协议演示的隔离和扩大干细胞的神经球的实验文化方法如手术切除人脑胶质瘤mutliforme（GBM）的肿瘤组织使用。

该协议的目标是使用 neurospheres 资产分离和扩增人胶质母细胞瘤多形肿瘤细胞。这是通过首先切碎收获的肿瘤组织，然后进行化裂机械解离，最后将所得细胞铺板以在神经球培养物中生长来实现的。在本视频中，我们将展示如何使用神经球培养方法从人胶质母细胞瘤肿瘤组织中分离和扩增干细胞样细胞。

该方法也可用于培养来自其他脑肿瘤以及实体瘤（如乳腺癌、前列腺癌、肝脏和肺癌）的细胞。好了，让我们开始吧。接受手术切除的 GBM 肿瘤组织后，去除培养基。

使用无菌 PBS 洗涤肿瘤两到三次，以去除血液和碎屑等污染物。洗涤后，将切除的肿瘤放入无菌培养皿中。首先，将肿瘤切成更小的部分，然后将一部分肿瘤组织转移到单独的培养皿中，使用 10 号手术刀将组织切成小块。

这将增加可用于酶解离的表面积。切碎可能需要一到三分钟，具体取决于肿瘤的大小。现在向碎纸组织中加入 3 到 5 ml 预热胰蛋白酶，并将其转移到 15 ml 无菌猎鹰管中。

将 15 mL 试管置于 37 度水浴中 10 至 15 分钟。每 5 分钟摇晃一次试管。为确保更好的组织消化，添加等体积的胰蛋白酶抑制剂以终止反应。

活化中的胰蛋白酶通过上下吹打数次来保证。将悬浮液以 800 RRP M 或 110 G 离心 5 分钟。去除上清液，然后将托盘重悬于 1 ml neuros 干细胞基础培养基中，将尖端靠在试管底部。

上下移液 3 到 7 次以打碎团块，直到在移液时获得乳白色悬浮液，这可能会导致细胞死亡。将 40 微米过滤器放在 50 ml 试管上。现在向细胞悬液中加入 10 至 15 ml 基础培养基并混合，轻轻地使细胞悬液通过 40 微米过滤器，以去除未结合团块中的碎片。

PT 细胞并吸走上浆。将细胞重悬于 1 至 2 ml 完全培养基中。然后轻轻上下移液以使悬浮液均质化。

将 10 μL 细胞悬液与 90 μL Trian blue 混合。将悬浮液充分混合，并将 10 微升转移到血液中。细胞仪。执行细胞计数，如下所示。

需要没有团块的单细胞悬液才能获得准确的细胞计数。不包括 trian blue 阳性细胞。计数时将细胞接种在 T 80 培养瓶中。

将 20 ml 完全神经干细胞培养基添加到 50 ml 试管中。加入适量的细胞悬液，使密度达到每毫升 200， 000 个细胞。现在添加 EGF 以达到每毫升 20 纳克的最终浓度。

添加浓度为 1 微升/毫升的 0.2% 肝素。最后，添加 BFGF 以达到 10 ng/ml 的最终浓度。将细胞混合在补充有生长因子的完全培养基中。

然后将悬浮液转移到 T 80 标签上。然后将培养瓶转移到 37 摄氏度和 5% CO2 的培养箱中 7 到 10 天。培养 8 天后，球体完全长大，可以通行。

收集烧瓶中的内容物并转移到 50 ml 双离心机中。细胞以 800 RPM 的速度放置 5 分钟。用真空吸走 supernat，然后将托盘重悬于 1 ml 预热胰蛋白酶中。

将细胞在 37 摄氏度的水浴中孵育 2 分钟。加入等量的胰蛋白酶抑制剂并充分混合以确保激活。然后沉淀细胞。

去除上级，将细胞重悬于 1 ml 完全培养基中，轻轻上下移液以使细胞悬液匀浆。如前所述进行细胞计数，将细胞接种在 T 80 培养瓶中，在 50 ml 试管中加入 20 ml 完全培养基。加入适量的细胞悬液，以达到每毫升 50， 000 个细胞的密度。

现在添加生长因子，包括 E-G-F-B-F-G-F 和前面描述的浓度的肝素。轻轻混合所得细胞悬液，然后将悬浮液转移到 T 80 中，并置于培养箱中 7 至 10 天。下面是主要 GBM 区域性的示例。

在这个阶段四天后，您可以看到细胞正在增殖并开始形成球体。在这个阶段，您不应该观察到大的球形细胞簇。这可能是由于组织准备不当造成的。

培养 7 到 10 天后，当球体的平均直径达到 150 到 200 微米时，就会形成大小不一的球体，它们可以被通过。这是 8 天后传代 GBM 培养的一个例子。同样，你可以看到不同大小的球体，健康的球体，在其外围表现出微尖峰。

制备单细胞悬浮液在任何球体培养中都是一个非常重要的问题。否则，即使在接种细胞后的第二天，您也可能观察到细胞聚集体。这些聚集体被假设为球体，但应该注意的是，穿孔细胞至少需要一周时间才能形成真正的球体。

原发性肿瘤球培养中的碎片数量取决于许多因素，例如组织来源和组织去除的精度以及组织处理技术。我们希望您觉得这个视频有用，并祝您的实验好运。