验尸报告组织心肌细胞核分离

该程序的总体目标是从死后组织中分离心肌细胞核。这是通过首先使用探针匀浆器和玻璃下垂器对组织进行匀浆，然后进行几个过滤步骤来实现的。第二步是通过密度沉降离心将细胞核部分与其他细胞组分分离。

接下来，心肌细胞核用针对 PCM one 的抗体进行免疫标记。最后一步是通过荧光激活细胞分选分离标记的心肌细胞核。最终，就在进一步的下游作之前，通过重新分析分选的核组分来确认心肌细胞核的纯度。

该技术的主要优点是可以以高通量方式从新鲜或冷冻档案组织中同样很好地分析心肌细胞核。基于DNA的心肌细胞研究尤其具有挑战性，原因有几个。首先，心肌细胞仅占心脏细胞的 20% 到 30% 左右。

此外，它们在很大程度上是有核的。此外，心肌细胞在很大程度上是多倍体。这里描述的这种方法确实克服了所有这些障碍。

在开始该过程之前。用 10 毫升 1% BSA 加 PBS 包被溶液包被超速离心管。旋转试管 30 分钟后，取出涂层溶液并让其自然干燥。

通过使用手术刀从快速冷冻的小鼠心脏中解剖左心室来开始心脏核分离程序将解剖的标本修剪成小段，然后将组织块转移到装有 15 毫升裂解缓冲液的 50 毫升锥形管中。接下来，用探针匀浆器以 24， 000 RPM 的速度匀浆 10 秒，然后用等体积的裂解缓冲液稀释匀浆，最高可达 30 毫升。从大间隙杵中抽动 8 次，将匀浆转移到玻璃羽绒均质器中，以释放细胞核。

然后通过粗细胞核。首先通过 100 μm 细胞过滤器分离，然后通过 70 μm 细胞过滤器分离到新的 50 mL 锥形管中。现在，将粗细胞核分离物在 700 倍 G 和 4 摄氏度下旋转 10 分钟。

倒置试管以小心去除上清液，然后用纸巾擦拭试管内部。小心不要打扰细胞核沉淀。上下移液数次以重悬粗核。

在 5 mL 蔗糖缓冲液中分离，然后在细胞核悬浮液中再添加 25 mL 蔗糖缓冲液。接下来，将 10 毫升新鲜制备的蔗糖缓冲液添加到先前制备的包被超速离心管中。然后小心地将缓冲液与重悬的细胞核沉淀溶液覆盖在一起。

在自由摆动的转子中平衡试管后，将转子放入高速离心机中，并在 13， 000 倍 g 和 4 摄氏度下旋转细胞核样品 60 分钟。离心完成后，小心地从转子上取下试管，然后再次倒置。要丢弃上清液，请像以前一样用纸巾擦去管内剩余的碎屑，然后将细胞核沉淀重悬于一毫升细胞核储存缓冲液中。

在开始免疫染色程序之前，将 20 μL 等分试样的细胞核样品转移到传真管中。向等分试样中加入 980 微升细胞核储存缓冲液，并标记试管阴性对照。现在，将抗 PCM 一抗体添加到细胞核样品和阴性对照管中，稀释度为 1 至 500。

然后将两个试管在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天。用细胞核储存缓冲液洗涤试管并丢弃上清液回收后，将细胞核沉淀悬浮在另一毫升细胞核储存缓冲液中。

然后，将抗狂犬病荧光二抗以 1 比 100 的稀释度添加到细胞样品中，并在 4 摄氏度下孵育 1 小时。用细胞核储存缓冲液洗涤试管后，将沉淀悬浮在一毫升细胞核储存缓冲液中，用于流式细胞学分选和分析，包被细胞核后，用 BSA 和 PBS 收集管，如视频开头所示，首先通过单独的 30 微米细胞过滤器过滤样品和阴性对照。在上样前，加入 A DNA 染料。

添加 1 比 500 的稀释液以鉴定细胞核群。将阴性对照加载到流式细胞仪上。使用前向和侧向散射参数放置第一个步态来定义心脏核，类似于此处显示的 DOT 图。

然后使用前向散射和前向散射脉冲宽度参数在原子核单重态周围创建第二个门，类似于此处显示的 DOT 图。现在加载免疫标记的样品并放置第三个门，用于区分 PCM 一个阳性心肌细胞核和 PCM 一个阴性非心肌细胞核。使用核 DNA 染色剂分析 DNA 含量并进行细胞周期分析，类似于此直方图所示的分析。

根据 PCM 一阳性对细胞核进行分选后，将分选的细胞核置于冰上，并重新分析每个分选样品的等分试样以确定分选纯度。最后，将收集管中分选的细胞核在 1500 倍 G 和 4 摄氏度下旋转 15 分钟。丢弃后，上清液回收将细胞核沉淀悬浮在与所需下游应用兼容的缓冲液中。

在第一个图中，用核染料和抗 PCM one、murn 心脏转录因子 N KX 2.5 和肌球蛋白重链或 MHC 的抗体对成年小鼠心脏进行染色。这里显示了上图中叠加层的特写。请注意 PCM 一个标记的白色细胞核如何表达红色的转录因子 NK X 2.5，并被绿色的心肌细胞细胞质包围。

这些数据共同证明了 PCM one 染色识别心肌细胞核的准确性。插图突出显示了心肌细胞核中 PCM one 的外延核染色模式，如以下三个图中描述的实验中的箭头进一步所示，心脏核分离物用 DNA 染色剂 DRAC 5 和针对 PCM one 的抗体染色。在这里，前两个图的叠加，箭头再次突出了 PCM one 在离体心肌细胞核中的外表核染色模式。

该点图表明，通过该方法分离的细胞核中约有 30% 是心肌细胞核，如其 PCM one 标记所示。最后，正如这些直方图所示，小鼠心肌细胞核主要是二倍体，如两个 N 峰所示，只有一小部分是四倍体，如较小的四个 N 峰所示。这种技术的优点之一是它可以很容易地适应其他物种。

至于人类。