RNA-seq的凝血酶处理和控制人肺微血管内皮细胞的转录组分析

该程序的总体目标是提出一个完整而详细的过程，以应用 RNA-Seq（一种强大的下一代 DNA 测序技术）来分析转录组。这是通过首先从人肺微血管内皮细胞中分离总 RNA 来实现的，无论是否经过凝血酶处理，并检查 RNA 质量。第二步是从这些 RNA 样本中构建 DNA 文库。

使用 cbot 仪器简化簇生成，并在 HighSeq 1000 上执行 DNA 测序任务。接下来进行数据分析以最终鉴定和显示差异表达的基因转录本。最后一步是通过 RT TP CR 验证 RN aeq 结果。与用于转录组分析的 DNA 微阵列等现有方法相比，IC 的主要优势在于 IC 可以分析完整的转录组，提供数字类型的数据，并且不依赖于细胞中基因表达的任何已知基因组化。

虽然 MRA 水平的测量是确定细胞机械转录如何受外部信号影响或细胞在健康状况和疾病状态之间有何差异的有用工具。在该协议中，我们将演示 trobin 处理和对照人肺微血管 Indo syn 细胞中转录组的 IC 分析。该协议基于我们最近发表的研究，在该研究中，我们在流行的下一代 DNA 测序平台 High SEQ 1000 上使用 RNA-Seq 成功地对用凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞进行了首次完整的转录组分析。

使用 VS seven R-T-P-C-R 系统，Denova 博士将演示人肺、微血管内皮细胞的凝血酶处理和总细胞 RNA 分离。

Dimitri Gregor 博士将演示数据分析以开始这种协议培养。人肺微血管内皮细胞在 EGM 两种培养基中达到 90% 至 100% 汇合，两种培养基含 5% FBS 生长因子和抗生素。在凝血酶处理前 30 分钟将培养基更换为饥饿培养基。

30 分钟后，用 0.05 单位/毫升的凝血酶处理细胞，或作为对照不处理。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 6 小时。经过 6 小时的护理后。

根据制造商的说明，使用 Nirvana 试剂盒从处理过的细胞和对照细胞中分离总 RNA。根据 Experian 自动电泳站上的标准方案，使用 Experian 标准链真核 RNA 芯片评估 RNA 的质量。最后，使用用于文库构建的标准光谱光度法定量 RNA。

每个样品使用 1 μg 高质量总 RNA 作为起始材料来构建文库。遵循制造商的标准协议。在该方案中，执行两轮含有 Mr.mRNA 的 poly 选择。

为了去除我们的 RNA 以尽量减少我们的 RNA 测序，请使用 Experian DNA one K 芯片评估文库的质量。根据 Experian 自动电泳站上的标准方案。使用定量实时聚合酶链反应定量文库。

缩写为 Q-R-T-P-C-R，如书面方案中所述。在本视频中，根据 cyber green MM 协议运行 Q-R-T-P-C-R，并计算每个文库的原始储备液浓度。将文库原液稀释至 10 纳摩尔，并在 20 摄氏度下储存。

当准备聚集流通池时，在水浴中解冻 cbot 试剂板。CBOT 是一种用于简化集群生成过程的工具。清洗 cbot 仪器后，首先将 13 微升 1 XTE 和 6 微升 10 纳摩尔混合，使文库变性。

文库，然后在每个试管的侧面，加入 1 微升一种正常氢氧化钠，涡旋试管，使其在室温下孵育 5 分钟。然后将变性的文库放在冰上。接下来，通过混合 996 微升缓冲液和 4.0 微升变性文库，用预冷的杂交缓冲液稀释变性文库，最终浓度为 12 皮摩尔。

将变性的稀释库放在上面。然后倒置 cbot 板的每一排试管，确保所有试剂都已解冻。旋转板后，从氢氧化钠管行上取下铝箔密封件，然后加载到 cbot 等分试样上。

将 120 μL 稀释的变性文库放入标记为 1 到 8 的试管中。向每个试管中加入 1.2 微升稀释的变性 PHI X 对照文库作为对照加标。涡旋并旋转试管后，以正确的方向将它们加载到 cbot 上，1 号试管向右。

将流通池和歧管加载到 cbot 上。完成流检查并开始集群运行。运行完成后，检查所有泳道的试剂输送情况。

记下任何异常情况。立即开始测序运行，或将流动槽储存在提供的 4 °C 试管中。开始排序。

通过合成试剂解冻测序。将试剂装入试剂托盘上的适当位置，确保不要接触其他试剂。接触切割混合物后，使用非测序流通池灌注试剂线两次，用 70% 乙醇和 Kim 湿巾彻底清洁测序流通池，然后用 70% 乙醇和透镜纸彻底清洁测序流通池。

检查流通池是否有任何条纹，必要时重新清洁。将流通池加载到测序仪上并进行流路检查，以确保歧管和流通池之间的密封紧密。开始测序运行。

评估运行期间可用的质量指标 监控整个运行期间的强度。完成 101 个循环后。执行周转化学以完成第二次读取。

第一个父配对和试剂，第二个 read inintegration 缓冲液。然后加载试剂，继续测序，运行评估。其次，随着运行过程读取强度 Q3 和其他质量指标。

要开始数据分析，请使用最新版本的木薯将碱基检出文件转换为 FAST Q 文件。将快速 Q 群集计数设置为零，以确保创建单个快速 Q 文件。对于每个样品，解压缩快速 Q 文件以进行下游分析。

使用最新版本的顶帽进行配对和比对，它使用超高通量短读长和 SAM 工具将 RNA-Seq 读数与哺乳动物大小的基因组进行比对，该工具以 SAM 格式实现了用于后处理比对的各种实用程序。参考人类转录组可以从 I 基因组下载，在运行大帽中，使用了所有默认参数设置，包括使用袖扣软件包的程序 cuff diff 部分作为片段去链的库类型选项。将凝血酶处理的细胞与对照细胞进行比较。

根据人类参考转录组筛选出凝血酶处理细胞中差异表达的基因转录本。然后使用电子表格以表格形式可视化结果。在这种情况下，使用了所有默认参数设置，并过滤掉了 FPKM 小于 0.05 且 p 大于 0.05 的基因转录本，以检测没有参考的新亚型跑步袖扣。

转录组使用 cuff compare 将样本转录文件与参考基因组进行比较。使用组合的凝血酶转录物文件作为一次分析的参考基因组，使用组合的对照转录文件作为第二次分析的参考基因组，用袖带差异测试差异表达，再次使用电子表格以表格格式可视化结果。和以前一样，过滤掉那些 FPKM 小于 0.05 和 p 大于 0.05 的基因转录本。

在此步骤之后，研究人员可以选择将新报告的转录本列表上传到 uc SC 基因组浏览器网站，以通过人工检查来验证其有效性。差异表达基因的列表也可以提交给 Ingenuity Pathway Analysis，以表征受凝血酶治疗影响的基因和通路。在此步骤中，研究人员可以选择使用 cummerbund 一个 R 包，旨在帮助和简化分析袖扣 RN aeq 输出的任务，以帮助管理、可视化和整合袖带差异分析产生的所有数据。

然后首先通过 Q-R-T-P-C-R 验证 RN aeq 结果，从对照和凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞中分离总 RNA，RNA 质量评估和 RNA 定量，如视频前面所示。然后按照制造商的说明，使用上标三第一链合成系统 rt 从每个样品的 1 微克总 RNA 中生成互补的 DNA。最后，使用本视频随附的书面方案中列出的按需设计的核苷酸 TAC MAN 检测在 VI a 7 实时 PCR 系统上进行 Q-R-T-P-C-R 分析，并按照此处所述进行定量测量。

28 秒与 18 秒的比率传统上用作 RNA 降解的指标为了更准确地量化降解，体验系统计算 RNA 质量指标或 RQI 值。RQI 算法将 RNA 样品的电泳图与来自一系列标准化降解 RNA 样品的数据进行比较，并自动返回一个介于 10 和 1 之间的数字。RNA 样品的 RQI 应至少为 7，最好大于 8。

这些 Experian 结果表明，RQI 为 8.4 的高质量 RNA 样品。这些文库应具有大约 250 至 300 个碱基对的宽带，如此图的 Experian 高质量文库结果所示。图中显示了标准曲线样品和一个未知样品的 Q-R-T-P-C-R 结果。

应在整个运行过程中不断观察测序运行的进度和质量。该图显示了第一个周期成像步骤中适当的簇密度。这是跑步的第一个迹象。

质量集群应该是明亮和专注的。显示了第一个周期完成后生成的第一个基本报表的示例。此时评估估计的簇密度强度水平和聚焦质量非常重要。

此处显示了第四周期之后的下一个质量检查点。这显示了每个通道的绝对集群密度。循环 13 后，簇密度不应高于每平方毫米 850 K。

计算 Phasing 和 Pre Phasing 统计数据。典型数字介于 0.1 和 0.25 之间。在第 24 周期之后，当计算几个质量指标时，可以进行主要质量评估。

高于 Q3 的读数百分比是衡量对基数置信度的指标。调用 Q 值为 3 的读取意味着碱基调用出错的可能性为 1000 分之一。Q 分数会随着运行的进行而降低，但开始时应超过 95% 的读数达到或超过 Q3。传递 filter 或 pf 的群集是从中获取实际序列数据的群集。

理想情况下，这应该高于 85%集群 pf 基于许多因素，包括定相、定相前强度，并且 Q3.It 不会随着运行的进行而改变。比对百分比是实时比对 FI x 基因组的读数的量度。由于样品库中加标了大约 1% FI x 文库，因此对齐百分比应介于 0.5 和 1 之间。

该统计数据表明，文库内容由簇很好地表示，并且此处列出的簇生成偏倚是对照和凝血酶处理的人肺微血管内皮细胞中的表达基因和亚型。值得注意的是，检测到大约 26， 000 种新型亚型，这说明了 RN aeq 的强度。它可以识别未知的 RNA。

或者，剪接转录本和替代启动子使用，这些使用无法通过微阵列技术检测到。RNA-Seq 还可以测量不准确、定量或未被微阵列检测到的低丰度转录本，以使用替代方法验证 RNA-Seq 结果。进行 A-Q-R-T-P-C-R 实验，检测 RNA-Seq 数据中的 3 个不同基因，TR 1 个上调 7.96 倍自身。

在 Q-R-T-P-C-R 数据中，1 个下调 1.16 倍，感谢 2 个下调 1.70 倍，这些相应的数字分别为正 7.25 倍减去 1.15 倍和负 2.07 倍。RNA-Seq 和 Q-R-T-P-C-R 检测的这三个基因的结果非常一致，这证实了 RNA-Seq 的结果。该方案在高级细胞中曲博宾处理的人肺微血管的一个时间点特定于 IC，但它可以很容易地适应多时间点研究或用不同刺激或抑制剂处理的其他细胞组织中的研究，或比较细胞或组织中转录组的健康状态和疾病状态。

虽然它是特定于 high SQ 1000 的，但该方案适用于任何 HighSeq 家族或基因组分析仪。两种仪器，对簇生成步骤和测序试剂进行了微小修改。其他下一代 DNA 测序平台，例如 solid 系列。

GS 系统以及一些新兴的新型系统也被用于 RNA-Seq 的目的。尽管它们的文库构建和测序程序可能略有不同，但该方案中提出的 RNA 处理技巧、数据分析部分和 R-T-P-C-R 验证可能对他们的 RNA-Seq 应用具有参考价值。