Name: 在芽殖酵母连续高分辨率显微观察复制性衰老 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 了解利用微流控芯片技术对芽殖酵母进行连续高分辨率显微观察的方法，以研究复制性衰老过程中的细胞形态、蛋白质表达及定位变化。该技术为细胞生物学研究提供了高效手段。

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感谢 Laura Schippers 撰写了细胞加载方案的初稿，以及 Marcus de Goffau 和 Guille Zampar 对线粒体形态的评分。

1. 硅片模具的制备与加工
微流控芯片由通过软光刻技术制备的硅片模具制成。这些硅片可重复使用多次以制备微流控芯片。建议由专门从事微流控技术的团队来制备相应的硅片模具6。
晶圆采用两步光刻工艺制成，使用两层不同的负性光刻胶SU-87。底层用于形成细胞捕获区域（SU-8 2002；高度3-4 μm），而通道则由顶层制成（SU-8 2010；高度10 μm）。晶圆制备过程的示意图可参见Huang et al8。微流控芯片的设计图可向作者索取，同时可获取有关如何获得相应晶圆的建议。
<ol>
	<li>获得晶圆后，用解剖刀将 Tough-Tag 切成约 0.5 mm × 3 mm 的细条，小心地将其放置在晶圆上，位置略高于进样通道与微垫阵列之间的通道结构（图 2A）。这将在每块芯片中形成一个较大的附加通道，该通道不仅在细胞加载过程中使用，对于微流控装置的稳定运行也至关重要。</li>
	<li>用双层铝箔覆盖玻璃培养皿，并将晶圆放入培养皿中。铝箔可防止 PDMS 渗入晶圆与玻璃培养皿之间。若 PDMS 渗入晶圆与玻璃培养皿之间，晶圆将永久固定在培养皿中。尽管晶圆仍可使用，但若培养皿破裂则无法更换，且后续还需将 PDMS 切除。</li>
</ol>
2. 微流控芯片的制备
<ol>
	<li>将一个空的塑料杯放在天平上并归零。向塑料杯中倒入 40 g PDMS 基液（用于直径为 12 cm 的玻璃培养皿）。用一次性移液管按 1:10 的质量比加入 PDMS 固化剂。 即 约 4 ml。</li>
	<li>将PDMS与固化剂充分混合数分钟。可使用之前移取固化剂的 disposable plastic pipette 进行混合。在将混合物倒入硅片之前，确保混合均匀至关重要。混合不充分会导致部分PDMS无法聚合。</li>
	<li>将PDMS倒入玻璃培养皿中的晶圆表面。</li>
	<li>将PDMS与固化剂混合会导致PDMS混合物中产生气泡。这些气泡需在PDMS聚合前予以去除。可在将PDMS浇注于硅片表面后，将培养皿置于连接真空泵的干燥器中进行脱气处理。在此条件下，约需30分钟可完全去除混合物中的所有气泡。</li>
	<li>将带有晶圆的培养皿置于加热板上，在 120 °C 下加热 1 小时，随后在 65 °C 下继续加热 1 小时，使 PDMS 固化。</li>
	<li>将铝箔连同晶圆和聚合后的PDMS从玻璃培养皿中取出。从晶圆背面剥离铝箔及残留的薄层聚合PDMS。随后可通过小心抬起的方式，将晶圆表面的PDMS层与晶圆分离。</li>
	<li>将PDMS层倒置（通道面朝上）放置在实验台上，用解剖刀小心地沿PDMS上印制的单个芯片图案进行切割。切割时尽量在通道边缘周围保留约3 mm的PDMS，以利于后续芯片与盖玻片的牢固粘合。</li>
	<li>在进样口、出样口和侧通道的两端用打孔器在PDMS上打孔（图2A）通过将20号鲁尔针头笔直地完全刺穿PDMS来实现。</li>
</ol>
打孔时，确保 PDMS 芯片仍倒置在实验台上。这可以防止 PDMS 粘附到通道内部，从而避免通道堵塞。
<ol start="9">
	<li>每次打孔后，在再次拔出鲁尔接头前，用镊子将鲁尔接头中残留的PDMS柱体取出。否则，PDMS柱体可能残留在原位，堵塞刚刚打好的孔。</li>
	<li>通过将透明胶带贴在芯片表面并立即撕下，清除表面的灰尘颗粒和残留PDMS。以同样方式清洁将与芯片粘合的盖玻片。</li>
	<li>将清洁后的芯片和盖玻片放置于台式紫外臭氧清洗仪的紫外灯下方。需要键合的表面必须朝向光源。</li>
	<li>将PDMS和盖玻片暴露于紫外光下6–8分钟，随后立即将芯片放置在盖玻片上，使经处理的表面相互贴合。</li>
	<li>轻轻敲击芯片四周，以促进PDMS与盖玻片的粘附，并排除任何气泡。切勿敲击通道结构的上方，以免导致微垫也粘附到盖玻片上。</li>
	<li>将新制备的微流控装置置于100 °C的加热板上加热60分钟。尝试轻轻掀起PDMS芯片边缘，测试盖玻片与PDMS芯片之间的键合强度。若PDMS块无法从玻璃表面掀起，则表明键合成功，芯片可投入使用。</li>
</ol>
3. 准备芯片以加载细胞
微流控装置失效可能导致培养基泄漏到显微镜中。为避免这种情况，建议使用金属支架和/或用指甲油或环氧胶密封芯片侧面PDMS与玻璃接触的区域。这样可以在PDMS芯片与盖玻片键合不够牢固时防止培养基泄漏。同样，也可在管路连接插入部位采取类似措施，以防止培养基泄漏。作为额外的安全预防措施，可使用自制的水传感器，在发生泄漏时自动关闭注射泵。专为该微流控芯片设计的金属支架图纸可向作者索取。
<ol>
	<li>将微流控芯片放入金属支架中，在芯片玻璃与支架金属部件之间放置硅胶，以形成防水密封。轻轻拧紧螺母，避免损坏玻璃。</li>
	<li>连接细管（约 将5-15厘米长的管子连接至芯片的侧通道和出口通道。使用镊子可更方便地将管子插入打孔处。</li>
	<li>用培养基填充一支50 ml鲁尔锁型注射器，排出注射器中的空气，然后依次连接针筒滤器、20号鲁尔接头、一段短而粗的管子约 2 厘米长）和一根细管。确保细管足够长，能够连接注射泵与显微镜载物台之间的距离。</li>
	<li>将注射器放入注射泵中，快进泵直至细管完全充满培养基。</li>
	<li>将连接注射器的细管插入芯片的进样通道，使培养基以 10 μl/min 的流速流经芯片（图2B）。收集流经芯片后的培养基（例如。 在培养皿中）。由于 Tough-Tag 制成的较大侧通道与出口通道之间的阻力差异，培养基将通过侧通道流出。</li>
	<li>将芯片放置在显微镜载物台上，并将显微镜焦点对准焊盘。</li>
</ol>
使用油浸物镜优于使用水浸物镜，因为油在实验过程中不会干燥。
根据显微镜的不同，在实验最初的几个小时内可能会出现难以维持焦距的问题。因此，建议将芯片置于显微镜载物台上静置一到两个小时，待其稳定后再加载细胞并开始实验。
4. 将酵母细胞载入微流控芯片
<ol>
	<li>将一个5 ml鲁尔接头注射器连接到20号鲁尔短管和一根粗管上约 3 cm</li>
	<li>取待上样至芯片中的细胞培养物样本。</li>
</ol>
加样时推荐的细胞浓度为每毫升1-5 × 106个细胞。细胞浓度过高的培养物在加样前需进行稀释。当在YPD培养基中培养细胞时，若在加样前先用含有相似葡萄糖浓度的最低限度培养基洗涤并重悬细胞，可使细胞加样效率提高数倍。在芯片运行过程中，可再次安全地使用YPD培养基。
<ol start="3">
	<li>将约1 ml细胞悬液加入注射器中，并完全排出注射器内的空气。</li>
	<li>将注射泵的流速降低至0.5 μl/min。在加样过程中（步骤4.5），注射泵维持的低速持续流动会将未贴壁的细胞通过侧通道推出（图2C）。</li>
	<li>将装有细胞悬液的注射器连接到出口通道的管路上，轻轻推动注射器活塞以加载细胞。通过目镜或计算机屏幕观察细胞进入并在微垫下方沉降的过程。</li>
	<li>持续对活塞施加压力，直至足够数量的细胞沉降在微垫下方。每个微垫的最佳负载量为1–3个细胞。由于细胞在微垫下方随机沉降，部分微垫可能无细胞，而另一些微垫则可能完全被细胞填满，这是常见现象。</li>
	<li>断开用于加样细胞的注射器及其连接的粗管与出口通道细管的连接，以较高流速（10 μl/min）冲洗侧通道数分钟，以去除气泡和/或尚未离开芯片的细胞（图2B）。若不将侧通道中的细胞清除，这些细胞可能在侧通道内生长，进而干扰后续实验。</li>
	<li>将注射泵的流速恢复至0.5 μl/min，并通过连接一段末端带有导管塞的粗管（约 5 cm长）关闭侧通道（图2D）。</li>
	<li>将流速提高至最终流速1–5 μl/min。流速可根据培养基和酵母菌株的不同而调整。</li>
	<li>使用适合实验目的的显微镜和相机设置开始录制视频。确保显微镜载物台移动速度足够慢，以便油镜能够跟上。在测定复制性寿命时，每10分钟拍摄一次细胞图像。为保护细胞免受微分干涉差（DIC）成像过程中卤素灯发射的微量紫外光影响，建议在光路中额外添加一个紫外滤光片。若使用荧光显微镜，建议减少成像频率（例如 每20分钟一次），以避免光毒性效应。当实验开始时加载的所有细胞均死亡时，实验即告完成；在正常条件下，该过程最长可达5天。建议在实验过程中定期检查图像的焦距，并在必要时进行调整。</li>
</ol>

<ol><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).</li>
<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209(2009).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. , (2012).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cancer+stem+cell+migration+using+compartmentalizing+microfluidic+devices+and+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e3297(2011).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+determining+yeast+replicative+life+span+in+a+long-lived+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li>
<li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li>
<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SIR2%2F3%2F4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li>
<li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li>
<li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li>
<li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述的微流控方法是衰老研究中一种重要的新型工具，它能够简便、自动地生成酵母复制性寿命数据，并结合连续的高分辨率成像。这些特性相较于传统的显微解剖方法在实验能力上实现了显著提升，但该方法仍存在一些局限性，需予以考虑。
请注意，所测定的复制寿命可能受到母细胞滞留效率的影响：每个在微垫下保留的细胞都有一定概率被冲洗出芯片例如 邻近细胞的出芽可能会将其从微垫上推开）。细胞被冲洗出去的累积概率随着寿命的延长而增加。因此，短寿命细胞在被冲走之前完成其生命周期的可能性高于长寿命细胞。微流控装置获得相似寿命数据的事实表明4 与经典的显微解剖方法一样11-13 表明该潜在问题即使存在，也仅为轻微或无关紧要。
需要注意的是，与传统的显微解剖方法不同，使用微流控装置无法在实验开始时选择新生的子代细胞。然而，当将来自对数生长期液体培养物的细胞加载到芯片中时，所加载的大多数细胞为新生或相对年轻的细胞即 约54%的细胞此前从未出芽，约27%出芽一次14</sup...

芽殖酵母是衰老研究的重要模式生物1。直到最近，研究酵母细胞的复制性衰老仍是一个费力的过程，需要采用显微解剖方法，即手动将每个芽体从母细胞上分离2,3。为解决这一问题，我们近期提出了一种新型的微流控装置，能够在整个生命周期中追踪单个母细胞4。
在我们的微流控芯片中，酵母细胞被截留在基于软弹性体的微垫下（参见 图1）。持续流动的培养基会冲走新形成的子代细胞，并为细胞提供新鲜营养。在单次实验中，可全程全自动监测多达50个母细胞的整个复制性寿命。由于微流控芯片具有优异的光学特性，可同时监测酵母细胞生物学的多个不同方面（例如 通过使用荧光蛋白
 
与传统的解剖方法相比，微流控装置具有显著优势。它能够在整个衰老实验过程中提供明确且恒定的环境。该方法无需昂贵的专用设备，可在配备自动对焦、延时成像功能以及细胞培养温度控制的任何显微镜上运行。微流控芯片的制备与操作可在数天内掌握。此外，细胞可直接从指数生长期的培养物中加载，这一优点优于另一种 recently published 微流控方法5，后者需要对母细胞进行生物素标记a。结合高分辨率成像，本文所述方法能够以前所未有的方式测量酵母衰老过程中细胞形态、蛋白质表达及定位的渐进性变化。对单个细胞进行长期监测的能力也为酵母细胞周期研究提供了独特的可能性。
a该方法最近已得到优化，去除了方案中的生物素标记步骤16，该研究在本文手稿审稿期间发表。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DC Sylgard 184 弹性体</td><td>Mavom bv</td><td>1060040</td><td>本包装包含PDMS基础剂和PDMS固化剂。</td></tr><tr><td>玻璃培养皿 120/20 mm</td><td>VWR International</td><td>391-2850</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 22×40 mm</td><td>CBN Labsuppliers BV</td><td>190002240</td><td></td></tr><tr><td>Tough-Tags</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359106</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性塑料杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml 移液管</td><td>VWR International</td><td>612-1245</td><td></td></tr><tr><td>透明胶带</td><td>VWR International</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Baysilone 膏体（GE Bayer 硅酮）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85403-1EA</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 微孔管，0.012&quot;ID × 0.030&quot;OD</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06417-11</td><td>简称细管</td></tr><tr><td>Tygon 微孔管，0.030&quot;ID × 0.090&quot;OD</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06418-03</td><td>简称粗管</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>VWR International</td><td>233-5334</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 鲁尔锁注射器</td><td>BD</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 注射器，鲁尔接头</td><td>VWR International</td><td>613-1599</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>VWR International</td><td>232-2132</td><td></td></tr><tr><td>20 号鲁尔短管接头</td><td>Instech Solomon</td><td>LS20</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（孔径 0.20 &amp;mu;m）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢导管塞，20 号 × 12 mm</td><td>Instech Solomon</td><td>SP20/12</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR International</td><td>391-0892</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>台式紫外臭氧清洗仪</td><td>NOVA Scan</td><td>PSD-UVT</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Pump 11 Elite</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 硅模板（晶圆）</td><td></td><td></td><td>自制；详情请联系通讯作者</td></tr><tr><td>天平</td><td>Sartorius corporation</td><td>ED4202S</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>KNF Neuberger</td><td>N022 AN.18</td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>VWR International</td><td>467-2115</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>VWR International</td><td>460-3267</td><td></td></tr><tr><td>可选：盖玻片（22×40 mm）金属支架</td><td></td><td></td><td>自制；详情请联系通讯作者</td></tr><tr><td>（荧光）显微镜，配备 60 倍物镜、自动对焦、延时成像功能，最好带有自动化（电动 XY 控制）载物台</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr></tbody></table>

芽殖酵母复制性衰老的连续高分辨率显微观察

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

我们展示了一种简单的微流控装置，可用于在整个寿命过程中追踪单个出芽酵母细胞。该微流控芯片利用母细胞与子细胞之间的尺寸差异，通过一系列微垫结构实现分离。在加载细胞时，由于微垫与盖玻片之间的距离接近酵母细胞的直径（3–4 μm），细胞被截留在微垫下方。加载完成后，培养基持续流经芯片，这不仅在整个实验过程中维持了稳定且可控的环境，同时将不断产生的子细胞冲走——由于子细胞体积较小，无法被保留在微垫下方。该装置对母细胞的保留效率极高，单次实验中可对多达50个独立细胞进行完全自动化的监测，持续达5天或更长时间（如有需要）。此外，芯片优异的光学特性使得在细胞整个衰老过程中均可实现高分辨率成像。

在本实验方案中，细胞直接从对数中期培养物中加载至微流控芯片。为了确定被困在微流控芯片中的细胞的年龄分布是否与加载前的培养物相似，使用与FITC偶联的小麦凝集素（WGA-FITC）对细胞进行染色，以观察芽痕。如图3所示，细胞在微流控芯片微垫下方的滞留并未偏向特定年龄的细胞。
通过计数单个母细胞产生的芽体数量，即可简单测定复制性寿命。通过绘制存活细胞百分比与芽体数量的关系曲线，可将该数据转化为寿命曲线。可采用Kaeberlein等所使用的统计学方法进行分析。 等9可用于比较不同实验中的寿命数据。 图4 显示了野生型BY4741酵母菌株及两种突变体的寿命曲线示例sir2Δ fob1Δ
视频 1 野生型 BY4741 酵母细胞在 YPD 培养基上生长的延时视频。图像每 10 分钟采集一次。该细胞在死亡前共产生 30 个芽体。比例尺：5 μm。<a href="...

本文介绍了一种微流控装置的操作方法，该装置可在单个出芽酵母细胞的整个复制和/或时间寿命过程中，实现连续、高分辨率的显微成像。

我们展示了一种简单的微流控装置的使用方法，该装置可用于在整个生命周期中追踪单个出芽酵母细胞。

本实验的总体目标是在单倍体酵母细胞的整个复制寿命期间对其进行追踪。第一步是制备包含微垫阵列的微流控芯片。接下来，将酵母细胞加载到微流控芯片中，由于微垫下方区域的高度与酵母细胞的直径相近，细胞将在此处沉降。随后，将新鲜培养基持续流过被固定的酵母细胞，新生的子细胞被培养基流冲走，通过明场和荧光显微镜观察细胞或细胞器形态、蛋白质表达以及蛋白质定位在衰老酵母细胞中可能发生的变化。与传统的显微解剖方法相比，该技术的主要优势在于劳动强度较低，并能够对单个酵母细胞的整个生命周期进行长期连续的显微成像。尽管该方法可为复制性衰老研究提供见解，也可用于需要长时间连续显微观察的研究。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为在微流控芯片制备的某些特定步骤中需要格外小心。此外，将细胞加载到微流控芯片中可能需要一定的操作经验。硅晶片模具通过软光刻技术制备。有关其制备细节，请参阅配套的实验方案。将一块耐用标签裁切成约0.5毫米×3毫米的细条。使用手术刀，将条带小心地放置在硅片模具上，位置略高于进样通道与微米级父结构之间的通道结构。接着，用双层铝箔覆盖一个玻璃培养皿，并将硅片放入培养皿中。在微流控芯片制备过程中，铝箔可防止PDMS渗入硅片与培养皿之间。开始制作微流控芯片的步骤时，将一个空的塑料杯放在天平上并归零。向塑料杯中倒入 40 克 PDMS 基液。按 1:10 的质量比加入 PDMS 固化剂，本例中约为 4 毫升。使用一次性塑料移液管充分混合数分钟，确保混合物充分混匀，这对于后续PDMS的正确聚合至关重要。将PDMS倒在玻璃培养皿中的晶圆上方。培养皿中的PDMS混合物会含有大量气泡，需要进行脱气处理。将PDMS放置在培养皿中，连接真空泵并置于干燥器内抽真空约30分钟，直至所有气泡完全去除。将带有硅片的培养皿置于120摄氏度的加热板上加热1小时，随后在65摄氏度下继续加热1小时，使PDMS固化聚合。两小时后，从玻璃培养皿中取出铝箔硅片及已聚合的PDMS。从晶圆背面将铝箔从PDMS上剥离。然后小心地从晶圆顶部揭起PDMS层。将PDMS层倒置放置在实验台上，使通道朝上，并用解剖刀小心切割出印在PDMS上的单个芯片设计。尽量在通道边缘周围保留约三毫米的PDMS。下一步是按照本图所示，在入口、出口和侧通道的末端位置对PDMS打孔。打孔时，将一根20号钝头针以直线方向完全穿过PDMS。在拔出引诱针座之前，先移除针座内PDMS的柱体。这一步骤同样是为了防止PDMS柱体堵塞新打的孔。所有孔打完后，通过在芯片表面贴上透明胶带并立即撕去胶带的方式，清除表面的灰尘颗粒和残留的PDMS。同样，清洁将要粘附芯片的盖玻片。将芯片和盖玻片放置在台式紫外臭氧清洗仪的紫外灯下方，使需要键合的表面朝向光源，暴露于紫外光下照射6至8分钟，然后将暴露的表面相互贴合。轻轻敲击芯片四周，以促进PDMS与盖玻片的粘附，并排除任何气泡。切勿触碰通道结构的顶部，以免微垫附着到盖板上。玻璃部件同样需要注意。将新制备的微流控装置置于100摄氏度的加热板上加热一小时。随后，轻轻抬起 PDMS 芯片的边缘，检查盖玻片与 PDMS 芯片之间的键合情况。如果无法抬起，则表明键合成功，芯片可投入使用。为准备微流控芯片进行细胞加载，将芯片置于金属支架中，并在芯片的玻璃面与支架的金属部件之间放置硅胶。为形成防水密封，应轻轻拧紧螺母，避免损坏玻璃。将细管连接至芯片的侧通道和出口通道。使用镊子可更轻松地将管路插入打孔中。用培养基填充一个50毫升的螺口注射器。排出注射器中的空气，并依次将其连接至一个注射器。通过20号螺口短管、一段短而粗的管子和一根细管进行过滤。将注射器放入注射泵中，推动泵前进，直至细管完全充满培养基。将连接注射器的细管插入芯片的进样通道，使培养基以每分钟10微升的流速流经芯片。用培养皿收集从芯片流出的培养基。培养基将通过侧通道流出，这是由于由大而坚固的标签结构形成的侧通道与出口通道之间存在阻力差异。将芯片置于显微镜载物台上，并将显微镜焦点对准焊盘区域。开始此操作时，将一个5毫升的诱饵头注射器连接到20号诱饵接头和一根粗管上。用约1毫升待加载至芯片的细胞悬液填充注射器。推荐的加载细胞浓度为每毫升1×10⁶至5×10⁶个细胞。将注射泵的流速降低至0.5微升每分钟。该操作过程中最困难的部分是将细胞加载到微流控芯片中。这通常需要一些练习。将含有细胞悬液的注射器连接到出口通道的管路上。通过推动注射器的活塞加载细胞。通过目镜或计算机屏幕，轻柔地观察细胞进入并沉降在微垫下方的过程。持续对活塞施加压力，直至有足够数量的细胞沉降到垫片下方。每个垫片上最佳的细胞负载量为一至三个细胞。断开用于加样细胞的注射器，并以较高的流速冲洗侧通道几分钟，以去除气泡以及尚未流出芯片的细胞。再次将注射泵的流速降低至 0.5 微升每分钟，并通过将侧通道连接至末端带有导管塞的粗管来关闭侧通道。将注射泵的流速增加至最终流速为每分钟 1 至 5 微升。流速可根据培养基和酵母菌株的不同而有所变化。使用显微镜和相机设置开始录制视频，设置应符合实验目标。这是一个野生型 E 细胞在 YPD 培养基上生长的时间序列视频示例。每 10 分钟拍摄一次图像，图中所示比例尺代表 5 微米。一个细胞在死亡前总共会产生30个芽体。通过计数单个母细胞产生的芽体数量，可以确定其复制寿命。该数据可通过绘制存活细胞百分比相对于芽体数量或代数的曲线，转化为寿命曲线。该图展示了野生型酵母菌株及两种突变菌株的寿命曲线示例。SER2 基因的缺失导致寿命缩短，而 FOB1 基因的缺失则导致寿命延长。可利用微流控装置研究线粒体形态随年龄的变化。利用表达定位于线粒体的 ILV2-3GFP 的 BY742 野生型酵母细胞进行了衰老实验。图中白色箭头指示了单个细胞中线粒体形态随年龄变化的一个代表性示例。所有图像均按相同比例缩放，比例尺代表 5 µm。第二段延时电影显示了来自线粒体形态随年龄变化实验中的单个细胞，该细胞表达 ILV 3G FP。图像每30分钟拍摄一次，比例尺代表5微米。最后一幅图展示了同一组细胞在不同复制年龄时观察到的线粒体形态，即在产生第一个芽之前、产生10个芽之后以及死亡之前。每种形态类别的示例图像包括管状、断裂的管状、斑点以及大斑点。在中龄细胞中观察到的形态变化与先前报道的结果相似，通过持续监测细胞分裂过程可实现这一观察。该方法有助于回答酵母复制性衰老中的关键问题，例如酵母细胞为何会衰老、正在发生哪些表型变化，以及这些变化如何影响酵母的复制寿命？观看本视频后，您将了解如何自行制备微芯片，并利用几乎任何荧光显微镜研究细胞的复制性衰老。

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