芽殖酵母复制性衰老的连续高分辨率显微观察

本实验的总体目标是在单倍体酵母细胞的整个复制寿命期间对其进行追踪。第一步是制备包含微垫阵列的微流控芯片。接下来，将酵母细胞加载到微流控芯片中，由于微垫下方区域的高度与酵母细胞的直径相近，细胞将在此处沉降。

随后，将新鲜培养基持续流经被捕获的酵母细胞，新生的子细胞被培养基的流动冲走，通过明场和荧光显微镜观察细胞或细胞器形态、蛋白质表达及蛋白质定位在衰老酵母细胞中可能发生的变化。该技术相较于传统显微解剖方法的主要优势在于劳动强度较低，并能够实现对单个酵母细胞整个生命周期的长期连续显微成像。

尽管该方法可为复制性衰老研究提供见解，也可用于需要长时间连续显微观察的研究。通常，初次使用该方法的研究者会遇到困难，因为在微流控芯片制备的某些特定步骤中需要格外小心。此外，将细胞加载到微流控芯片中可能需要一定的操作经验。

硅晶片模具通过软光刻技术制备。有关其制备细节，请参阅配套的实验方案。将坚韧标签材料裁剪成约0.5毫米×3毫米的细条。

使用手术刀，将条带小心地放置在硅片模具的进样通道与微父结构之间的通道上方。接着，用双层铝箔覆盖一个玻璃培养皿，并将硅片放入培养皿中。在微流控芯片制备过程中，铝箔可防止PDMS渗入硅片与培养皿之间。

开始制作微流控芯片的步骤时，将一个空的塑料杯放在天平上并去皮。向塑料杯中倒入 40 克 PDMS 基液。按 1:10 的质量比加入 PDMS 固化剂，本例中约为 4 毫升。

使用一次性塑料移液管充分混合数分钟，确保混合物均匀至关重要，以保证后续PDMS的正确聚合。将PDMS倒入玻璃培养皿中的晶圆表面。培养皿中的PDMS混合物会含有大量气泡，需要进行脱气处理。

将PDMS置于培养皿中，放入连接真空泵的干燥器内抽真空约30分钟，直至所有气泡完全去除。将带有硅片的培养皿置于120摄氏度的加热板上加热1小时，随后在65摄氏度下继续加热1小时，使PDMS固化聚合。两小时后，从玻璃培养皿中取出铝箔硅片以及已聚合的PDMS。

从晶圆背面将铝箔从PDMS上剥离。然后小心地从晶圆顶部揭起PDMS层。将PDMS层倒置放置在实验台上，使微通道朝上，并用解剖刀小心地切割出印在PDMS上的单个芯片设计。

尽量在通道边缘周围保留约三毫米的PDMS。下一步是按照此示意图所示，在入口、出口和侧通道末端的PDMS上打孔。打孔时，将一根20号钝头穿刺针以直线方式完全穿过PDMS。

在拔出诱饵座之前，先移除诱饵座中PDMS柱体。此步骤可防止PDMS柱体堵塞新打的孔。所有孔打完后，通过在芯片表面贴上透明胶带并立即撕去胶带的方式，清除表面的灰尘颗粒和残留PDMS。

同样，清洁将要粘附芯片的盖玻片。将芯片和盖玻片放置在台式紫外臭氧清洗仪的紫外灯下方，使需要键合的表面朝向紫外灯，暴露于紫外光下照射六到八分钟，然后将暴露过的表面相互贴合。轻轻敲击芯片四周，以促进PDMS与盖玻片的粘附，并去除任何气泡。

切勿触碰通道结构的顶部，以免微垫粘附到盖玻片上，玻璃也是如此。将新制备的微流控装置置于100摄氏度的加热板上加热一小时。

随后，轻轻抬起 PDMS 芯片的边缘，检查盖玻片与 PDMS 芯片的键合情况。如果无法抬起，则表明键合成功，芯片可投入使用。为准备微流控芯片用于加样细胞，将芯片置于金属支架中，并在芯片的玻璃面与支架的金属部件之间放置硅胶。

为形成防水密封，应轻轻拧紧螺母，以避免损坏玻璃。将细管连接到芯片的侧通道和出口通道。使用镊子可更轻松地将管路插入打孔的孔洞中。

用50毫升螺口注射器吸取培养基。排出注射器中的空气，并依次连接20号螺口过滤针头、一段短而粗的管子和一根细管进行过滤。

将注射器放入注射泵中，推动泵前进，直至细管完全充满培养基。将连接注射器的细管插入芯片的进样通道，使培养基以每分钟10微升的流速流经芯片。用培养皿收集从芯片流出的培养基。

培养基将通过侧通道流出，这是由于较宽的抗性标签侧通道与出口通道之间的阻力差异所致。将芯片置于显微镜载物台上，并将显微镜焦距对准电极垫。

开始此操作时，将5毫升带接头针筒连接至20号接头针头和粗管。用待上样至芯片的细胞悬液填充针筒，体积约为1毫升。推荐上样细胞浓度为每毫升1×10⁶至5×10⁶个细胞。

将注射泵的流速降低至0.5微升每分钟。该操作过程中最困难的部分是将细胞加载到微流控芯片中，这通常需要一些练习。

将含有细胞悬液的注射器连接到出口通道的管路上。通过推动注射器的活塞加载细胞。通过目镜或计算机屏幕，轻柔地观察细胞进入并在微垫下方沉降的过程。

持续对柱塞施加压力，直至有足够数量的细胞沉降到垫片下方。每个垫片上最佳的细胞负载量为一至三个细胞。断开用于加样细胞的注射器，并以较高流速冲洗侧通道数分钟，以去除气泡以及尚未流出芯片的细胞。

再次将注射泵的流速降低至0.5微升/分钟，并通过将侧通道连接至末端带有导管塞的粗管来关闭侧通道。将注射泵的流速增加至最终流速1至5微升/分钟。流速可能因培养基和酵母菌株的不同而有所变化。

使用显微镜和相机设置开始录制视频，这些设置应适合实验目的。这是一个野生型E细胞在YPD培养基上生长的时间序列视频示例。每10分钟拍摄一次图像，图中所示比例尺代表5微米。

细胞在死亡前总共产生30个芽体。通过计数单个母细胞产生的芽体数量，可确定其复制寿命。该数据可通过绘制存活细胞百分比相对于芽体数量或世代数的曲线，转化为寿命曲线。

该图展示了野生型酵母菌株及两种突变菌株的寿命曲线示例。SER2基因的缺失导致寿命缩短，而FOB1基因的缺失则导致寿命延长。可利用微流控装置研究线粒体形态随年龄的变化。

利用表达定位于线粒体的 ILV3-GFP 的 BY742 野生型酵母细胞进行了衰老实验。在本图中，白色箭头指示了单个细胞中线粒体形态随年龄变化的一个代表性示例。所有图像均按相同比例缩放，比例尺代表 5 µm。

第二段延时电影显示了在观察线粒体形态随年龄变化的实验中，表达 ILV 3G FP 的单个细胞。图像每 30 分钟拍摄一次，比例尺代表 5 微米。最后一幅图展示了同一组细胞在不同复制年龄时观察到的线粒体形态，即在产生第一个芽之前、产生 10 个芽之后以及死亡之前。

每种形态类别的示例图像均包括管状、断裂管状、斑点以及大斑点。在中等年龄细胞中观察到的形态变化与先前报道的结果相似。通过持续监测细胞分裂过程，该方法有助于回答酵母复制性衰老中的关键科学问题，例如酵母细胞为何会衰老、发生了哪些表型变化，以及这些变化如何影响酵母的复制寿命？

观看本视频后，您将了解如何自行制备微芯片，并利用基本任何一种荧光显微镜研究细胞的复制性衰老。