在芽殖酵母连续高分辨率显微观察复制性衰老

该程序的总体目标是在整个复制生命周期内跟踪单个单倍体酵母细胞。第一步是制作包含一系列微焊盘的微流控芯片。接下来，将酵母细胞加载到微流体芯片中，由于微垫下方的区域高度与酵母细胞的直径相似，因此细胞将在那里沉淀。

随后，将新鲜培养基连续流涂在被捕获的酵母细胞上，并通过培养基明场和荧光流洗去出现的子细胞。显微镜用于观察衰老酵母细胞中可能发生的细胞或细胞器形态、蛋白质表达和蛋白质定位的变化。与传统的显微切割方法相比，该技术的主要优点是劳动强度较低，并且能够对单个酵母细胞的整个生命周期进行长期连续的显微成像。

虽然这种方法可以提供对复制性衰老的见解，但它也可用于需要长时间连续显微镜观察的研究。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在生产 micro feic 芯片的特定步骤时需要小心。此外，将电池加载到 micro feic 芯片中可能需要一些经验。

硅片模具是通过软光刻生产的。有关其生产的详细信息，请参阅随附的协议。Text 将一块坚韧的标签切成大约 0.5 毫米 x 3 毫米的细条。

用手术刀小心地将条带放在硅晶片模具上，略微位于入口通道和微型焊盘之间的通道结构顶部。接下来，用双层铝箔覆盖玻璃培养皿，然后将晶片放入培养皿中。在微流体芯片的生产过程中，铝箔将防止 PDMS 在晶圆和培养皿之间运行。

要开始制作微流控芯片的程序，请将空塑料杯放在天平上并撕碎天平。将 40 克 PDMS 底座倒入塑料杯中。以 1 比 10 的重量重量比添加 PDMS 固化剂，在本例中约为 4 毫升。

使用一次性塑料移液器充分混合几分钟，重要的是将混合物充分混合，以确保稍后 PDMS 的正确聚合。将 PDMS 倒在玻璃培养皿中的晶片顶部。培养皿中的 PDMS 混合物将包含大量对 Degas 不利的气泡。

PDMS 将培养皿置于干燥皿中，将其连接到真空泵中约 30 分钟，当所有气泡都去除后。将装有晶片的培养皿放在 120 摄氏度的热板顶部 1 小时，然后在 65 摄氏度下再放置一小时，从而聚合 PDMS。两小时后，从玻璃培养皿中取出铝箔晶片和聚合 PDMS。

从晶圆背面将铝箔剥离到 PDMS 中。然后小心地从晶圆顶部提起 PDMS 层。将 PDMS 层倒置，使通道朝上放在工作台上，然后用手术刀小心地剪出印在 PDMS 上的单芯片设计。

尝试在通道边缘周围保留大约 3 毫米的 PDMS。下一步是在入口出口和侧通道末端的 PDMS 上打孔，如下图所示。要打孔，请将 20 号诱饵存根笔直地推入 PDMS。

拉出诱饵存根之前，先拆下诱饵存根中的 PDMS 柱。同样，这可以防止 PDMS 色谱柱堵塞新打孔。打出所有孔后，将透明胶带放在芯片表面并立即取下胶带，以清洁芯片表面的灰尘颗粒和残留的 PDMS。

同样，清洁将要安装芯片的盖玻片。将芯片和盖玻片放在台式紫外线臭氧清洁剂的紫外线灯下方，需要粘合在一起的侧面，面向暴露在紫外线下的灯 6 到 8 分钟，然后将暴露的表面放在一起。轻轻敲击芯片的侧面，以促进 PDMS 附着到盖玻片上，并去除任何气泡。

请勿轻敲通道结构的顶部，因为这可能会导致微型焊盘连接到盖子上。玻璃也是如此。将新制作的微流体装置放在 100 摄氏度的热板上 1 小时。

然后，通过稍微抬起 PDMS 芯片的边缘，检查盖板玻璃与 PDMS 芯片的粘合情况。如果无法做到这一点，则键合成功，芯片就可以使用了。为了准备用于细胞加载的微流体芯片，请将芯片放入金属支架中，并在芯片玻璃和支架的金属部件之间放置硅凝胶。

要形成防水密封，请轻轻拧紧螺母以避免打破玻璃。将细管连接到芯片的侧通道和出口通道。使用镊子可以更轻松地将管子插入冲孔中。

用培养基填充 50 毫升诱饵锁注射器。从注射器中取出空气，然后依次将其连接到注射器。过滤 20 号诱饵短管、短而粗的管子和细管。

将注射器放入注射泵中，然后快进泵，直到细管完全充满培养基。将连接到注射器的细管推入注射器的入口通道，让介质以每分钟 10 微升的速度流过芯片。收集将芯片留在培养皿中的培养基。

介质将通过侧通道流出。由于大而坚韧的标签制成的侧通道和出口通道之间的电阻差异。将芯片放在显微镜载物台上，并将显微镜的焦点放在垫子上。

要开始此过程，请将 5 毫升诱饵尖端注射器连接到 20 号诱饵短管和粗管。向注射器中加入大约 1 毫升要加载到芯片中的细胞悬液。上样的首选细胞计数为每毫升 6 个细胞的 1 到 5 乘以 10。

将注射泵的流速降低到每分钟 0.5 微升。此过程最困难的部分是将细胞加载到 microme 芯片中。这通常需要一些练习。

将装有细胞悬液的注射器连接到出口通道的管子上。通过按压注射器的柱塞来加载细胞。通过眼睛或电脑屏幕轻轻观察细胞进入并沉淀在微型垫下。

保持柱塞上的压力，直到足够的细胞沉淀在垫下方。最佳负载为每个焊盘 1 到 3 个电池。断开用于细胞加载的注射器，并以更高的流速冲洗侧通道几分钟，以去除气泡和/或尚未从芯片中排出的细胞。

再次将注射泵的流量降低到每分钟 0.5 微升，并通过将其连接到末端包含导管塞的粗管上来关闭侧通道。将注射泵的流量增加到每分钟 1 至 5 微升的最终流速。流速可能因培养基和酵母菌株而异。

使用适合实验目标的显微镜和相机设置开始拍摄视频。这是在 YPD 上生长的单个野生型 E 细胞的延时电影示例。中度图像每 10 分钟拍摄一次，刚才显示的比例尺代表 5 微米。

细胞在死亡前总共产生 30 个芽。复制寿命可以通过计算单个母细胞产生的芽数来确定。通过绘制活细胞的百分比与产生的芽数或世代数的关系，这些数据被转换为寿命曲线。

该图显示了野生型酵母菌株和两种突变菌株的寿命曲线示例。删除 SER two 基因会导致寿命缩短，而删除 FOB one 基因会导致寿命延长。可以使用微流体装置研究线粒体形态作为年龄的函数。

用 BY 7 42 个表达 ILV 3G FP 的野生型酵母细胞进行了衰老实验，该细胞靶向线粒体。在该图中，白色箭头表示单个细胞中线粒体形态的年龄相关变化的代表性示例。所有图像的缩放比例都相同，比例尺表示 5 微米。

第二部延时电影是来自实验的表达 ILV 3G FP 的单个细胞，其中观察到线粒体形态随年龄的变化。图像每 30 分钟拍摄一次，比例尺代表 5 微米。最终图显示了在不同复制年龄的同一组细胞中观察到的线粒体形态，这些细胞在 10 个芽之后和死亡之前产生第一个芽。

每个形态类别的示例图像包括管状、碎片状管状以及斑点和大斑点。在中年细胞中看到的形态变化类似于以前报道的那些通过持续监测细胞分裂的过程。这种方法可以帮助回答酵母复制老化中的关键问题，例如酵母细胞为什么会老化，正在发生哪些表型变化，以及这些变化如何影响酵母的复制寿命？

看完这个视频后，你应该知道如何创建自己的微芯片，并使用基本上任何荧光显微镜研究细胞中的复制衰老。