CometChip：一种用于在微阵列化人细胞中高通量检测DNA损伤的96孔平台

本实验的总体目标是演示如何使用 COMET 芯片在哺乳动物细胞中进行高通量 DNA 损伤检测。首先将哺乳动物细胞加载至 COMET 芯片中，实现这一目标；第二步是用已知可引起 DNA 损伤的化学物质处理细胞。

接下来，采用传统的COMET实验方案对细胞进行裂解和电泳。最后一步是通过荧光成像观察细胞DNA，以可视化受损DNA的迁移情况。最终利用图像分析软件对DNA损伤程度进行定量分析。

COMET 实验已经存在了很长时间，是一种用于检测多种不同类型 DNA 损伤的非常有用的实验方法。但其存在的问题是通量极低，且缺乏灵敏度。因此，我们开发了 COMET 芯片，这实际上是 COMET 实验的一种高通量版本，使得高通量筛选成为可能，例如用于药物筛选以及流行病学研究。

我实验室的研究生 Jing 将演示该实验步骤。Coma 芯片是一种凝胶，其上含有微孔阵列，这些微孔由微加工制成的带有微柱的模具形成，微柱直径可小至单个细胞的尺寸。开始时，将凝胶的一面朝下放入一个单孔矩形培养皿中。用 25 毫升 1×PBS 洗涤凝胶两次后，将 Coma 芯片置于玻璃板上，然后相应地标记凝胶的方向。

现在轻轻将一个去底的96孔板倒置压入凝胶中，确保96个孔均位于凝胶区域内。然后用1.5英寸长的文件夹夹子将96孔板两侧固定在玻璃板上。最后，用移液器吸去每个孔中多余的PBS。

根据标准操作规程收集悬浮或贴壁细胞，并用培养基将细胞稀释至终浓度为每毫升100,000至100万个细胞。如有必要，通过细胞滤网过滤，确保获得单细胞悬液。将100微升细胞悬液加入每个孔中，完成后即为彗星芯片96孔板。

用凝胶封膜覆盖培养板以防止蒸发，然后将培养板置于37摄氏度的培养箱中孵育30分钟。从培养箱中取出培养板后，待30分钟结束，吸去每个孔中的培养基，随后移除夹子和无底的96孔板。将彗星芯片连同玻璃板倾斜持握，用一份1×PBS轻轻冲洗，以去除彗星芯片表面多余的细胞。现在通过明场显微镜的4倍物镜观察培养板，检查细胞加载是否达到最佳状态。当细胞加载充足后，将彗星芯片放置于平整表面上，并覆盖一层已在37摄氏度预热的1%低熔点琼脂糖。

在室温下静置覆层三分钟使其凝固，然后置于四摄氏度环境中五分钟，以完成固定，从而将目标化学物质施加于细胞。首先，仔细将彗星芯片的孔与新的无底96孔板的孔对齐并压紧。使用长尾夹将96孔板如前所述固定在玻璃板上。

然后将培养板置于冰上，向每孔中加入100 µL目标化学物质至所需剂量。使待研究的化学物质在加药后于所需时间内与细胞共孵育，随后从各孔中吸除化学溶液，必要时用1×PBS冲洗。将凝胶切成独立的小块。为研究修复动力学，向各孔中加入培养基，孵育并在特定时间点进行细胞裂解，以获取LY细胞用于碱性彗星实验。

通过向碱性裂解储备液中加入1% Triton X-100，为每个芯片配制约25毫升的工作用碱性裂解缓冲液。然后在4°C预冷。将碱性裂解缓冲液倒入一个略大于彗星芯片的容器中。

然后将碱性芯片浸入预冷的工作浓度碱性裂解缓冲液中，放入冰箱，在4°C下过夜裂解。次日，从裂解缓冲液中取出彗星芯片，用1倍PBS快速漂洗。随后将芯片放入电泳槽中，使凝胶膜面朝下，并用双面胶带固定。

将电泳室移至4°C的冷室中，加入预冷的碱性电泳缓冲液，液面刚好覆盖凝胶即可。然后在4°C条件下静置芯片40分钟，以使DNA充分碱性解链。最后在1伏特/厘米电压和300毫安电流下电泳30分钟。

在低温室中，调节电泳槽内电泳缓冲液的体积以达到所需的运行电流。对于中性彗星实验，通过向中性裂解储备液中加入1% Triton X-100和10% DMSO，配制工作用中性裂解缓冲液。同样，每张芯片大约准备25毫升的工作裂解缓冲液。

将工作用中性裂解缓冲液置于43摄氏度的培养箱中预热。中性裂解缓冲液升温后，将comma芯片浸入其中，并于40摄氏度培养箱中孵育过夜。次日，移除中性裂解缓冲液，随后在4摄氏度条件下，用中性电泳缓冲液洗涤芯片两次，每次15分钟。每次操作时，将芯片固定于电泳槽中，并转移至冷室。

同前，将电泳槽中加入冷的中性电泳缓冲液，液面刚好覆盖凝胶，然后将凝胶置于4°C冰箱中静置60分钟。在4°C条件下，以每厘米0.6伏、6毫安的电流电泳60分钟。如有需要，可再次调节电泳槽中缓冲液的体积，以达到所需的运行电流。从4°C冰箱中取出com芯片后，用洗涤中和缓冲液在4°C下洗涤凝胶两次，每次15分钟，以中和凝胶。

使用荧光DNA染料（如CyberGold或铱溴化物）在芯片中进行染色。根据制造商的说明，通过荧光显微镜成像，本图顶部面板显示了未经处理的TK6淋巴母细胞中具有代表性的微孔彗星图样；中间面板为暴露于50 µmol/L过氧化氢的TK6细胞，底部面板为暴露于100 µmol/L过氧化氢的TK6细胞。

所有处理均在 4°C 下进行 20 分钟。该线图显示了 TK6 细胞对过氧化氢的剂量反应。每个数据点代表三次独立实验的平均值，每次实验获得至少 50 个单独彗星图的中位尾 DNA 百分比。

该图显示了暴露于过氧化氢的 TK6 细胞在彗星芯片实验中的样本间变异，每个孔的尾部 DNA 百分比数据均展示于此。每个方框代表来自每个孔至少 50 个独立彗星的中位数。12 个孔的平均值为 77.53%，标准差为 3.99%，变异系数为 5.2%。该图显示了实验间的变异情况。

相同的过氧化氢暴露重复了六次，每次重复的数据以灰色条形表示。每个方框代表每次重复中至少100个单个彗星的尾部DNA百分比中位数。六次重复的平均值为49.57%，在此以黑色条形表示。

六次重复实验的标准差为4.99%，图中以空气柱形式表示的平均值误差条为2.04%。与传统的常规检测方法类似，研究人员可自由修改本实验流程，或使用其他方法，例如加入纯化的损伤特异性酶，以进一步探究细胞中DNA损伤的类型。彗星芯片技术为研究哺乳动物细胞的DNA损伤与修复机制奠定了基础。

而且由于其高通量特性，使得开展临床和流行病学研究成为可能，而这类研究在过去由于样本数量庞大而无法实现。