CometChip:一种高通量的96孔平台的微阵列人类细胞测量DNA损伤

该程序的总体目标是演示如何使用 COMET 芯片在哺乳动物细胞中进行高通量 DNA 损伤测量。这是通过首先将哺乳动物细胞加载到 COMET 芯片中来实现的。第二步是用已知会导致 DNA 损伤的化学物质处理细胞。

接下来，使用传统的 COMET 检测方案裂解细胞和 Electro East。最后一步是细胞 DNA 的荧光成像，以可视化受损 DNA 的迁移。最终，图像分析软件用于量化 DNA 损伤的程度。

因此，com 检测已经存在了很长时间，它是一种非常有用的检测方法，可用于观察许多不同种类的 DNA 损伤。但问题是它的通量真的很低，而且缺乏灵敏度。因此，我们创建了 COMET 芯片，它基本上是 COMET 分析的非常高通量版本，可以进行高通量筛选，例如用于药物筛选和流行病学研究。

我实验室的 Jing GA 研究生将演示该程序。彗形芯片是一种凝胶，具有一系列微孔，由微制造的邮票产生，带有直径与单个细胞一样小的微柱，开始放入单孔矩形板凝胶粘合膜中，面朝下。在一次 XPBS 中用 25 毫升洗涤凝胶两次后，将逗号芯片放在玻璃板上，然后相应地标记凝胶的方向。

现在，将倒置的无底 96 孔板轻轻压入凝胶中，确保所有 96 孔都在凝胶区域内。然后用 1.5 英寸活页夹将 96 孔板的任一侧夹在玻璃板上。最后，从每个中吸出任何多余的 PBS。

根据标准程序充分收获悬浮细胞或贴壁细胞，并用培养基稀释细胞至终浓度为每毫升 100， 000 至 100 万个细胞。如有必要，确保通过细胞过滤器获得单细胞悬液。将 100 微升细胞悬液移液到每个孔中，完成后将 Comet Chip 96 孔板

用凝胶粘合膜盖住板以防止蒸发，然后从培养箱中取出板后，放入 37 摄氏度的培养箱中 30 分钟。30 分钟后，从每个中吸出培养基，然后取出活页夹和无底 96 孔板 将彗星芯片与玻璃板成一定角度握住，然后用一个 XPBS 轻轻冲洗以去除 aros 顶部的多余细胞。现在通过明场显微镜上的四个 x 物镜观察板，以检查最佳细胞加载量 加载足够的细胞后，将 com 芯片放在平坦的表面上，覆盖层含有 1% 低熔点农产品，已预热至 37 摄氏度。

让覆盖物在室温下凝固 3 分钟，然后将其置于 4 摄氏度下 5 分钟，以完全确定以向细胞中注入感兴趣的化学物质。首先，小心地将 Comet 芯片的孔与新的无底 96 孔板的孔对齐，然后向下压。像以前一样，用活页夹将 96 孔板固定到玻璃板上。

然后将板放在冰上，以所需剂量加入 100 微升感兴趣的化学物质 在每个孔中，让正在研究的化学物质在给药后以所需的时间留在细胞上，从每个孔中吸出化学溶液，并在需要时用一个 XPBS 冲洗。将凝胶切成单独的小块。然后为了研究修复动力学，将培养基加入孔中孵育，并在特定时间点对 LY 细胞进行细胞裂解以进行碱性彗星测定。

通过向碱性裂解储备液中加入 1% Triton X 100，为每个芯片制备大约 25 mL 的工作碱性裂解缓冲液。然后在 4 摄氏度下预冷却。将碱性裂解缓冲液倒入比彗星芯片稍大的容器中。

然后将碱性芯片浸入冰箱中冷藏的工作碱性裂解缓冲液中，并在 4 摄氏度下进行过夜裂解。第二天，从裂解缓冲液中取出彗星芯片，并用一个 XPBS 快速研磨。然后将芯片放入电泳室中，凝胶膜面朝下，并用双面胶带固定。

将腔室移至 4 摄氏度的冷藏室中，用冷碱性电泳缓冲液填充腔室，使其水平刚好覆盖凝胶。然后将芯片在 4 摄氏度下放置 40 分钟，让碱性解旋。最后，以每厘米 1 伏特和 300 毫安的电流运行凝胶 30 分钟。

在冷藏室中，调整腔室中电泳缓冲液的体积，以达到所需的运行电流。对于中性彗星测定，通过向中性裂解储备溶液中加入 1%Triton X 110% DMSO 来制备工作中性裂解缓冲液。同样，为每个芯片准备大约 25 毫升的工作裂解缓冲液。

将工作中的中性裂解缓冲液放入设置为 43 摄氏度的培养箱中预热。中性裂解缓冲液加热后，将逗号芯片浸入中性裂解缓冲液中，并置于 40 摄氏度的培养箱中过夜。第二天，去除中性裂解缓冲液，然后用中性电泳缓冲液在 4 摄氏度下反应 15 分钟两次每次将芯片固定在电泳室中并转移到冷藏室中。

和以前一样，用冷中性电泳缓冲液填充电泳室，使其刚好覆盖凝胶，让凝胶在冷藏室中放置 60 分钟，在冷藏室中以 0.6 伏/厘米和 6 毫安的电压运行凝胶 60 分钟。同样，如果需要，调整腔室中电泳缓冲液的体积，以达到所需的运行电流。从冷藏室中取出 com 芯片后，通过在 4 摄氏度下洗涤和中和缓冲液两次，每次 15 分钟来中和凝胶。

留在带有荧光 DNA 染料（如 cyberg gold 或溴化铱）的芯片中。根据制造商的说明和使用荧光显微镜的图像，来自未经处理的 TK 的代表性微孔彗星 6 个淋巴母细胞显示在该图的顶部面板中。来自 TK 的那些 6 个细胞在中间面板暴露于 50 微摩尔过氧化氢，在底部面板暴露于 100 微摩尔过氧化氢。

所有曝光均在 4 摄氏度下持续 20 分钟。该折线图显示了 TK six 电池的过氧化氢剂量反应。每个数据点是三个独立实验的平均值，其中每个实验获得了至少 50 颗彗星的尾部 DNA 的中位百分比。

该图显示了 TK 6 细胞的逗号芯片测定的样品间变化，暴露了每个孔的过氧化氢百分比尾部 DNA 数据。每个框代表每个井中至少 50 颗单独彗星的中位数。12 个孔的平均值为 77 点，53%，标准差为 3.99%，变异系数为 5.2%此图显示了实验之间的差异。

相同的过氧化氢暴露重复 6 次，每次重复的数据显示为灰色条。每个框代表每次重复中至少 100 颗彗星的尾部 DNA 的中位数百分比。六次重复的平均值为 49.57%，此处的后栏显示。

六次重复的标准差为 4.99%，均值的误差线为 2.04%，表示为图中的空气条，与传统的普通测定法一样。研究人员可以自由地对该程序进行修改或使用其他混乱，例如包括纯化的损伤特异性酶来回答有关细胞中产生的 DNA 损伤类型的其他问题。彗星芯片技术为哺乳动物细胞研究了解 DNA 损伤和修复铺平了道路。

而且由于它的通量高，它可以进行临床和流行病学研究，而这在以前由于样本数量而无法