总蛋白提取与二维凝胶电泳方法 伯克霍尔德菌属 物种

本实验的总体目标是生成细菌蛋白质组的二维图谱。首先通过培养细菌并收获其蛋白质来实现这一目标。随后，将收获的蛋白质根据其 pH 值进行一维分离。

在第一向分离后，通过等电聚焦，蛋白质在第二向根据其分子量进一步分离。最后，对第二向凝胶进行染色并使蛋白质可视化。最终，可通过双向电泳获得显示蛋白质表达差异的结果。

该方法有助于解答细菌致病性研究领域中的关键问题，例如在特定条件下会产生哪些蛋白质，以及不同细菌分离株在蛋白质表达上存在何种差异？这些信息有助于鉴定可能参与毒力作用的候选蛋白质。将100毫升的乳酸菌乳制品培养物培养至稳定期后，取35毫升转移至离心管中，在4,500 ×g 及4°C条件下离心20分钟。

重悬，将沉淀物悬浮于35毫升冷PBS中，并重复离心。重悬后，将沉淀物悬浮于1毫升冷PBS中，转移溶液至无菌的2毫升微量离心管中再次离心。用1毫升冷PBS重复洗涤一次，随后在4摄氏度、14,000 G条件下离心1分钟。弃去上清液，加入1毫升PBS-EDTA-PMSF溶液，将溶解后的沉淀物转移至含有约0.5毫升预灭菌玻璃珠的2毫升螺口管中。

然后在低温房间内裂解细胞，使用微型珠磨机处理三次，每次一分钟，每轮处理后将样品置于冰上，并离心一分钟，随后将上清液转移至无菌的5毫升聚苯乙烯管中。为提高得率，使用额外一份P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F缓冲液重复珠磨破碎两次。收集样品。

然后在测定蛋白含量后，将200微克的分装样品于-80摄氏度保存，直至准备用于进行第一维等电聚焦（IEF）。开始前，先用胶条清洗液清洗胶条支架，随后用超纯水冲洗胶条。

然后将其倒置晾干，干燥后为每个样品分配一个胶条支架编号。将先前制备好的200微克蛋白质样品加入胶条支架的侧孔中，并使用移液枪配合干净的镊子将样品在支架上均匀分布。从包装中取出凝胶胶条。

然后，在将凝胶条沿负极向正极方向缓慢滑动对齐之前，先去除其保护层，并使粗糙面朝下，以使凝胶条从负极端到正极端逐渐润湿。为防止烧干，将用无菌水浸湿的滤纸置于电极上方及凝胶条下方。去除气泡后，覆盖一层薄薄的矿物油，以防止干燥。

将胶条固定架在等电聚焦（IEF）仪上对齐。使用此处列出的程序运行样品。在最后一步的任意时间点均可取出凝胶。

程序完成后，从胶条支架上取下胶条；若不立即使用，需用塑料膜包裹，并于负80摄氏度保存，直至进行第二维SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。在组装好SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳用的凝胶铸胶装置后，于带有真空口和搅拌子的烧瓶中配制凝胶溶液，加入Dracquel 1.5摩尔Tris缓冲液与MCU水混合液，并在中等速度下用真空抽气20分钟以去除溶液中的气泡。抽真空结束后，用移液器沿烧瓶壁加入10% SDS，以避免引入气泡，随后加入新配制的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。

倒入凝胶并使其凝固，然后将DTT溶解到预先配制的平衡液中。从-80摄氏度冰箱中取出胶条，解开包装，将IPG胶条胶面朝下放入缓冲液中，孵育30分钟。接着，向电泳槽中加入4.5升电泳缓冲液。

然后用镊子将胶条从平衡液中取出，并用纸巾吸去多余的缓冲液。拆卸制胶装置，并用温水清洗玻璃板。将胶的上层液体替换为电泳缓冲液后，用干净的镊子将胶条放置在长玻璃板的上方，使凝胶面朝向自己。

用一种 x 缓冲液润滑胶条，并使用塑料条将 IPG 胶条进一步向下推压紧贴凝胶，去除胶条与凝胶之间的所有气泡。在胶条顶部加入琼脂糖封胶溶液以固定其位置。随后，待所有胶条完成相同操作后，将胶板放入电泳槽中。

确保外室的缓冲液液面处于指定位置后，安装上层室。将上层缓冲液室的框架置于玻璃板顶部并向下压紧。向上层室中加入2×运行缓冲液，直至液面达到中线位置。

然后向外部室中加入1×运行缓冲液，直至液面达到顶部刻度线。盖上盖子，打开电泳仪和电源装置。以52伏特、96毫安和5瓦的条件过夜运行样品。

电泳运行至前沿线距离底部一厘米处。运行结束后，从制胶装置上取下玻璃板。将凝胶从玻璃板上取下后，置于溶液一中固定，至少一小时或在4 °C下过夜。

然后将凝胶转移至第二步固定液中，摇床孵育1小时。用Milli-Q水洗涤凝胶，每次15分钟，共洗四次。随后用硝酸银溶液对凝胶染色30分钟至48小时。

用 Milli-Q 水洗涤凝胶约 1 分钟后，将其转移至显色液中，直至凝胶染色。显色反应约需 5 至 30 分钟，随后将凝胶转移至终止液中 10 分钟以终止反应。图中所示为施氏假单胞菌（ol dia multivorans）全细胞蛋白提取物的考马斯亮蓝染色凝胶。

在LB或酵母甘露醇肉汤中培养并在稳定期收获的临床分离株。对同一细菌培养物在不同时间点两次提取的蛋白质谱进行比较分析，结果显示相似的条带模式，表明蛋白质提取成功。本图中，对来自Bural dio, pseudo的200微克总蛋白进行双向凝胶电泳分析，显示出超过500个可被质谱单独鉴定的蛋白点。

采用此方法后，还可进行流式细胞术等其他实验，以确定亲缘关系较近的细菌分离株之间的定量与定性差异。此外，通过修改染色方法，研究人员可通过切取蛋白点并结合质谱分析，确定蛋白点的身份。