总蛋白提取和二维凝胶电泳方法鼻疽物种

在洋葱伯克霍尔德属的成员是重要的临床意义病原体。我们描述了一种菌体总蛋白的提取，采用机械破碎，和2-D凝胶电泳随后蛋白质组学分析。

该程序的总体目标是生成细菌蛋白质组的二维图。这是通过首先培养细菌培养物并收获蛋白质来实现的。接下来，根据其 pH 值在单一维度上分离收获的蛋白质。

通过第一维分离后的等电聚焦，蛋白质根据其分子量在第二维进一步分离。最后，对第二维凝胶进行染色，并观察蛋白质。最终，可以通过二维电泳获得显示蛋白质表达差异的结果。

这种方法可以帮助回答细菌发病机制领域的关键问题，例如在某些条件下会产生哪些蛋白质，以及不同的细菌分离株在蛋白质生产方面有何不同？此信息有助于识别可能涉及毒力的候选蛋白。将 100 毫升 bur 冷乳品培养物培养至固定相后，将 35 mL 转移至离心管中，并在 4、500 Gs 和 4 摄氏度下旋转 20 分钟。

复苏，将沉淀悬浮在 35 毫升冷 PBS 中，然后重复离心。Resus 将沉淀悬浮在 1 毫升冷 PBS 中后，将溶液转移到无菌的 2 毫升微管中并再次离心。在一毫升冷 PBS 中重复洗涤，然后在 4 摄氏度和 14， 000 克下旋转，弃去上清液一分钟，加入一毫升 P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F 溶液，将溶解的沉淀转移到含有约 0.5 毫升预灭菌玻璃珠的 2 毫升螺旋盖管中。

然后在冷藏室中破坏细胞，使用迷你微珠机三次，每次 1 分钟，每次离心后将样品放在冰上 1 分钟，然后将上清液转移到无菌的 5 毫升聚苯乙烯管中。为了提高产量，请重复磁珠撞击两次，并额外加入 P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F。拉取样本。

然后在测定蛋白质数量后，将 200 微克等分试样储存在零下 80 摄氏度，直到准备好用于进行第一维。等电聚焦或 IEF 首先使用带材清洁溶液清洁带材支架。然后用 milli Q 水冲洗条带。

然后将它们倒置干燥，干燥后将每个样品分配给一个凝胶条架编号。将先前制备的 200 μg 蛋白质样品加载到试纸架的侧孔中，并使用移液器使用干净的镊子将样品沿支架分配。从包装中拉出凝胶条。

然后从凝胶条上去除保护层，然后以缓慢滑动的方式将它们粗糙的一面朝下衬里，以使胶条从负端到正端湿润。为防止燃尽，将蘸有消毒水的吸墨纸放在电极顶部和凝胶条下方。去除气泡并覆盖一层薄薄的矿物油以防止干燥。

将 IEF 机器上的凝胶条架对齐。使用此处列出的程序运行示例。在最后一步中，可以随时去除凝胶。

程序完成后，从条带支架上取下胶条，除非立即使用，否则请用保鲜膜覆盖并储存在零下 80 摄氏度，直到准备好进行第二维 SDS 页面组装用于 SDS 页面的凝胶蓖麻装置后，通过添加 draquel 1.5 摩尔 tris 缓冲液和 MCU 水，在带有真空吸头和搅拌棒的烧瓶中制备凝胶溶液，将溶液混合并脱气以中等速度真空 20 分钟。真空完成后，沿培养瓶侧面移液，向凝胶溶液中加入 10%SDS。为避免引入气泡，然后加入新鲜制备的每硫酸盐铵和 temid 并搅拌。

倒入凝胶并使其凝固，然后将 DTT 溶解到先前制备的平衡溶液中。从零下 80 摄氏度的储存中取出胶条，打开包装，将 IPG 胶条凝胶面朝下放入缓冲液中，孵育 30 分钟。接下来，向正在运行的槽中加入 4.5 升电泳缓冲液。

然后用镊子从 e 平衡溶液中取出条带，用纸巾沥干多余的缓冲液。拆卸凝胶灌铸装置并用温水清洗玻璃板。用电泳缓冲液替换凝胶顶部的水后，用干净的镊子将一条条带放在长板的顶部，凝胶面朝向您。

用 1 x 缓冲液润滑胶条，并使用塑料条将 IPG 胶条进一步向下滑向凝胶，去除胶条和凝胶之间的所有气泡。将 agarro 密封溶液添加到条带顶部以将其密封到位。然后对所有试纸条重复该过程后，将其放入凝胶槽中。

确保外腔室中的 1 x 缓冲液水平处于指定水平后，连接上腔室。将上缓冲液室的框架放在玻璃板顶部并向下按压。将两个 x 电泳缓冲液添加到上腔室中，直至中线。

然后将 1 x 电泳缓冲液添加到外腔中，直至到达顶线。盖上盖子，打开电泳装置和电源组。在 52 伏特、96 毫安和 5 瓦特的电压下运行样品过夜。

运行凝胶，直到引导线距离底部 1 厘米。运行后，从脚轮中取出板。从玻璃板中取出凝胶后，将它们在溶液 1 中固定至少一小时或在 4 摄氏度下过夜。

然后转移凝胶以固定溶液 2 并振荡 1 小时。用 Milli Q 水洗涤凝胶 4 次，每次 15 分钟。然后使用硝酸银溶液对凝胶进行 30 分钟或长达 48 小时的染色。

在 Milli Q 水中洗涤凝胶一分钟后，将其转移到显影液中，直到凝胶染色。大约 5 到 30 分钟停止反应，转移凝胶以终止溶液 10 分钟。此处显示的是 ol dia multivorans 全细胞蛋白提取的 Kumasi Blues 染色凝胶。

在 LB 或酵母甘露醇肉汤中生长并在固定相收获的临床分离株。在两个不同场合从相同细菌培养物中提取的蛋白质谱的比较分析表明，相似的条带模式表明蛋白质提取成功。在这张图中，对来自 Bural dio 的 200 μg 总蛋白进行 2D 凝胶电泳分析，伪显示大量 500 多个斑点，可以通过质谱法单独识别。

按照此程序，可以执行其他方法，如细胞术，以确定密切相关的细菌分离物之间的定量和定量差异。此外，通过修改染色方法，研究人员可以通过斑点切除和质谱法确定蛋白质斑点的身份。