Name: 电子舌生成连续的识别模式的蛋白质分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 了解基于组合化学方法构建电子舌技术，利用表面等离子体共振成像实时监测蛋白质结合事件，生成二维连续演化图谱和三维连续演化景观，实现常见纯化蛋白质的高效鉴别与分析。

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作者谨此感谢格勒诺布尔 LANEF 博士项目对 Laurie-Amandine Garçon 的资助支持。本工作由法国国家科研署（ANR 资助号：06-NANO-045）提供经费支持。

1. 各种溶液和蛋白质样品的制备
<ol>
	<li>配制含有 50 mM NaH 的 100 ml 磷酸盐缓冲液（PBS-G）2PO4，50 mM NaCl 和 10% 甘油，pH 6.8。</li>
	<li>配制 250 ml HEPES 缓冲液，含 10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20，pH 调至 7.4。</li>
	<li>配制构筑单元1（BB1）乳糖和构筑单元2（BB2）硫酸化乳糖的储备溶液图1)&#160;在 PBS-G 中浓度为 0.2 mM。</li>
	<li>在 HEPES 中制备 1 ml 蛋白质溶液：Arachis hypogaea 凝集素（AHL）500 nM，肌红蛋白 1 µM，溶菌酶 500 nM。</li>
	<li>用超纯水配制20 ml 1% SDS溶液。</li>
</ol>
2. CoCRR 芯片的制备
<ol>
	<li>使用等离子清洗仪在使用前48小时清洁棱镜的金表面，清洗条件如下：75% 氧气，25% 氩气，0.6 mbar，功率40 W，清洗3分钟。</li>
	<li>在PBS-G缓冲液中，以总BB浓度为0.1 mM，按[BB1]/([BB1]+[BB2])比例从0%到100%以10%为增量，配制十一份纯品及混合溶液。</li>
	<li>使用非接触式点样仪，在棱镜表面每种比例溶液点样8 nl液滴，每个比例设四个重复，共44个点（图2）。 
	注意：PBS-G中添加10%甘油对于减少溶剂蒸发以及点样后BB浓度变化至关重要。</li>
	<li>将棱镜置于含有1 ml超纯水的培养皿中，室温下静置过夜，使BB1和BB2在金表面自发组装形成自组装单分子层（SAMs）。本实验假设混合SAMs的平均表面组成反映了沉积混合溶液的组成（图3）11。</li>
	<li>用超纯水彻底冲洗棱镜，然后在氩气流下吹干。</li>
</ol>
3. 利用 SPRi 进行蛋白质检测
<ol>
	<li>将 SPRi 仪器放置的培养箱温度设置为 25 °C，以避免在蛋白质检测过程中因温度变化引起折射率改变。</li>
	<li>将未功能化的清洗棱镜插入连接至计算机控制的注射泵、脱气装置和六通中压进样阀的 10 µl 聚醚醚酮（PEEK）流动池中（图 4）。用新近过滤并脱气的 HEPES 运行缓冲液充满流路系统。</li>
	<li>取出清洗棱镜，将含有 CoCRR 阵列的棱镜插入流动池。以 100 µl/min 的流速运行 HEPES 缓冲液，并借助 CCD 相机通过快速流过运行缓冲液的方式去除棱镜表面存在的任何气泡。</li>
	<li>利用 SPRi 系统内置软件，基于对比度良好的阵列图像，通过绘制相同直径的圆形来定义每个点的研究区域。</li>
	<li>为所有检测点绘制等离子体共振曲线，即反射率随入射角变化的曲线。</li>
	<li>选择反射率曲线斜率最大的位置作为工作角（用于记录动力学曲线的角度）。旋转扫描镜以固定选定的工作角，用于动力学测量。</li>
	<li>持续以 HEPES 缓冲液冲洗流路系统，直至所有检测点的反射率信号稳定且恒定。</li>
	<li>将注射阀置于“加载”位置，用注射器注入 1 ml AHL 溶液至样品环（500 µl）中；随后将注射阀切换至“进样”位置。所有蛋白质进样的流速均为 100 µl/min。</li>
	<li>开始动力学测量，同时监测所有检测点随时间变化的反射率信号。</li>
	<li>蛋白质进样结束后，用运行缓冲液冲洗阵列 8 分钟，最后注入 1 ml 1% SDS 溶液以再生表面。</li>
	<li>对其他蛋白质重复相同的操作步骤。</li>
</ol>
4. 数据处理与分析
<ol>
	<li>蛋白质溶液进入流通池后，发生分子结合，导致表面等离子体共振（SPR）曲线发生偏移并引起反射率变化。图像采集软件将测得的光强值转换为灰度等级，生成 SPR 图像（图 5A），并绘制反射率随时间的变化曲线，得到传感图（图 5B）。</li>
	<li>使用数学计算软件，将每次蛋白质注入结束时的反射率（R%）对 [BB1]/([BB1]+[BB2]) 比值作图，为每个样品生成二维连续演化谱（CEP）（图 5C）。</li>
	<li>将 [BB1]/([BB1]+[BB2]) 比值添加到传感图（图 5B）&#160;中，为每种蛋白质生成三维连续演化景观（CEL）（图 5D）。</li>
</ol>

<ol><li>Margulies, D., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+protein+recognition+as+an+alternative+approach+to+antibody-mimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).</li>
<li>Umali, A. P., Anslyn, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+approach+to+differential+sensing+using+synthetic+molecular+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).</li>
<li>Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-based+detection+of+different+proteins+using+an+array+of+fluorescent+protein+surface+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).</li>
<li>Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+of+proteins+based+on+an+array+of+functionalized+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).</li>
<li>Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+receptors+create+patterns+that+distinguish+various+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Differential receptors create patterns that distinguish various proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).</li>
<li>Wright, A. T., Anslyn, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+receptor+arrays+and+assays+for+solution-based+molecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition.</a> Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).</li>
<li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle%E2%80%93fluorescent+polymer+%E2%80%98chemical+nose%E2%80%99+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).</li>
<li>De, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+proteins+in+human+serum+using+conjugates+of+nanoparticles+and+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein.</a> Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+evolution+profiles+for+electronic-tongue-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).</li>
<li>Campbell, C. T., Kim, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPR+microscopy+and+its+applications+to+high-throughput+analyses+of+biomolecular+binding+events+and+their+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics.</a> Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).</li>
<li>Stranick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer-scale+phase+separation+in+mixed+composition+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers.</a> Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

构建该eT系统最关键的步骤在于确保系统具有良好的可重复性。例如，在使用前采用标准化程序清洁棱镜的金表面，在BB1和BB2的11种纯溶液及混合溶液中添加10%甘油，以消除BB分子在棱镜金表面自组装过程中溶剂的挥发，针对每个[BB1]/([BB1]+[BB2])比例沉积多个重复样本，&#160;etc。对于SPRi蛋白检测而言，工作角度的选择至关重要，通常将其设定在反射率曲线斜率最大的位置。此外，每次蛋白检测均需采用标准化的实验条件，如工作温度、流速等，&#160;etc。每次蛋白注入后，必须使用适当的溶液对CoCRR阵列进行再生，以实现系统的重复使用，同时确保受体不受任何损伤并完全恢复其活性。
为了证明所开发的 eT 不仅如先前报道的那样9适用于糖结合蛋白的研究，也适用于普通蛋白质，本研究选用了一种凝集素 AHL 以及两种非糖结合蛋白——肌红蛋白和溶菌酶。这些蛋白在 HEPES 缓冲液（pH 7.4）中具有不同的电荷特性：AHL（等电点（pI）为 6.0）、肌红蛋白（pI 为 7.2）和溶菌酶（pI 为 11）。值得注意的是，...

精确且快速的蛋白质检测方法在医学诊断和蛋白质组学中具有重要意义。传统的蛋白质检测阵列（如生物芯片）基于“锁钥”识别原理，需要特定的受体，例如适配体、抗体或模拟物。
近年来，受人类嗅觉和味觉启发的差异传感技术已成为一种替代方法1。这种电子鼻/电子舌（eN/eT）方法基于分析物与一组交叉反应性受体（CRRs）的差异性结合，这些受体无需对目标分子具有高度特异性或选择性，因而能够避免开发高选择性受体所带来的繁琐过程。所有受体的联合响应为每种样品生成独特的响应模式，类似于指纹，从而实现样品的识别。
开发用于有效蛋白质检测的电子鼻/电子舌所面临的两个关键挑战是：制备能够区分结构相似分析物的传感元件，以及为结合事件提供合适的信号转导系统。迄今为止，已有研究报道了多种用于传感器阵列开发的方法2。例如，一项研究利用四羧基苯基卟啉衍生物制备共价受体阵列（CRRs），通过将羧基与各种氨基酸或二肽偶联，形成具有疏水核心（可与蛋白质产生亲和力）和不同电荷外围（实现差异化结合）的差异性受体，从而实现基于阵列的蛋白质识别。利用该系统，通过检测受体与分析物相互作用后荧光的猝灭程度，实现了对不同蛋白质及蛋白质混合物的识别3,4。在另一项研究中，采用组合化学方法在六取代苯骨架上合成了包含三肽和硼酸基团的29种CRRs文库，并结合指示剂摄取比色法用于蛋白质检测5,6。在此设计中，每个受体因肽链结构的差异而对蛋白质表现出不同的结合能力，而硼酸基团有助于区分蛋白质与糖蛋白。最近，研究人员构建了一种由不同阳离子功能化金纳米颗粒与阴离子荧光聚合物聚对苯乙炔（poly(p-phenyleneethynylene, PPE)）偶联组成的阵列，用于蛋白质的检测与识别7。蛋白质分析物与猝灭态PPE/金纳米颗粒复合物之间的竞争性结合可恢复荧光信号，从而为不同蛋白质产生独特的识别图谱。在本研究中，通过调节纳米颗粒末端基团的理化性质，可调控功能化纳米颗粒与蛋白质之间的相互作用。此外，研究证明该方法可在复杂且富含蛋白质的介质（如人血清）中，在生理相关浓度下有效进行蛋白质分析，显示出电子舌（eT）在真实样本分析中用于疾病状态诊断的潜力8。
尽管这些系统前景广阔，但仍存在一些固有的局限性。它们需要设计并合成5到29种具有相当复杂结构的CRRs。此外，与每次检测后可重置的嗅觉系统不同，蛋白质检测需要为每个样品单独制备传感阵列。最后，实时监测结合事件极为困难。
在此背景下，提出了一种组合策略，即使用少量具有不同理化性质（亲水性、疏水性、带正电、带负电、中性）的简单且易于获得的分子 等等.) 作为构建单元（BBs）9通过以不同且可控的比例混合BBs，并使其在棱镜的金表面上自组装，从而构建出一系列具有适宜蛋白质结合特性的组合表面。值得注意的是，该系统中的自组装单分子层能够以高度多样化的方式便捷调节多种表面特性，从而可快速高效地制备多种组合交叉反应受体（CoCRRs）。蛋白质检测采用光学检测系统——表面等离子体共振成像（SPRi）技术。简言之，来自LED的宽束单色偏振光照射棱镜表面的整个CoCRR阵列区域，高分辨率CCD视频相机则实时获取CoCRR阵列各点位的差分图像，捕捉阵列表面局部变化，提供有关结合事件及动力学过程的详细信息。10与此同时，借助成像软件，SPR图像中对应于各个点位的信号被自动转换为反射率随时间变化的曲线，从而生成一系列称为传感图（sensorgrams）的动力学结合曲线。因此，SPRi可实现无标记、同步、并行且实时的结合事件观测。此外，所获得的CoCRR芯片可再生并可重复用于蛋白质分析。
本方案描述了仅使用两种小分子作为构建单元来构建电子舌的方法，并展示了其在基于SPRi获得的连续识别模式对常见蛋白质进行分析中的应用。

<table><tbody><tr><td>SPRi 仪器&amp;nbsp;</td><td>Horiba Scientific-GenOptics</td><td></td><td>SPRi 仪器置于 25 &amp;deg;C 的温度控制培养箱中。</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射泵&amp;nbsp;</td><td>Cavro 科学仪器公司</td><td>Cavro XLP 6000</td><td></td></tr><tr><td>Micro Elite 脱气装置&amp;nbsp;</td><td>Alltech</td><td>AT590507</td><td></td></tr><tr><td>六通中压进样阀</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>所用进样环体积为 500 &amp;micro;l。</td></tr><tr><td>Femto 等离子清洗仪（版本 7）</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td>配备双通道在线脱气系统。</td></tr><tr><td>点样仪</td><td>Siliflow</td><td></td><td>为一种非接触式压电点样仪。</td></tr><tr><td>SPRi 生物芯片</td><td>Horiba Scientific-GenOptics</td><td>36000067</td><td>棱镜由高折射率玻璃制成，表面镀有薄金膜（45 nm），专为成像应用而设计。</td></tr><tr><td>Erythrina cristagalli 凝集素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5390</td><td></td></tr><tr><td>Arachis hypogaea 凝集素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0881</td><td></td></tr><tr><td>肌红蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>CXCL12&amp;alpha;</td><td></td><td></td><td>由 Hugues Lortat-Jacob 博士提供；制备细节参见参考文献 9 的支持信息</td></tr><tr><td>CXCL12&amp;gamma;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>由 Hugues Lortat-Jacob 博士提供；制备细节参见参考文献 9 的支持信息</td></tr><tr><td>乳糖</td><td></td><td></td><td>由 David Bonnaff&amp;eacute; 教授提供；制备细节参见参考文献 9 的支持信息</td></tr><tr><td>硫酸化乳糖</td><td></td><td></td><td>由 David Bonnaff&amp;eacute; 教授提供；制备细节参见参考文献 9 的支持信息</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr></tbody></table>

电子舌生成连续识别模式用于蛋白质分析

Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis

在本方案中，开发了一种组合方法，以简化用于蛋白质分析的电子舌（eT）传感材料的设计与制备。通过将少量具有不同理化性质、简单且易于获取的分子作为构筑单元（BBs），以不同且可控的比例混合，并使其在棱镜的金表面自组装，从而构建出一系列具有适宜蛋白质检测性能的组合表面。通过该方法，可快速高效地获得大量交叉响应型受体。将此类组合交叉响应型受体阵列（CoCRRs）与表面等离子体共振成像（SPRi）等光学检测系统相结合，所构建的电子舌可实时监测液相样品中的结合事件，并生成包括二维连续演化图谱（CEP）和三维连续演化景观（CEL）在内的连续识别模式。该电子舌系统可有效区分常见的纯化蛋白质。

为了探究电子舌在常见蛋白质分析中的能力，选用了三种蛋白质：AHL、肌红蛋白和溶菌酶。对于每种蛋白质，电子舌均生成了独特的二维连续进化图谱（CEP），如图6所示。
此外，由于 SPRi 能够实时监测吸附和解吸动力学，因此针对每种蛋白质均生成了一种时间依赖性的连续识别模式，称为三维连续演化图谱（CEL）。图7展示了这三种蛋白质的典型 CEL。
<img alt="化学结构式；用于聚合物研究的BB1和BB2化合物的分子结构图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51901/51901fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 本实验方案中用于制备CoCRR阵...

本文描述了一种用于构建电子舌（eT）的新方法，该方法极大地简化了传感材料的设计与制备过程，并使电子舌能够对液体样品产生连续的演化图谱和轮廓。所获得的电子舌在常见蛋白质分析（如区分鉴别）方面具有高效性。

在本方案中，开发了一种组合策略，以简化用于构建……的传感材料的设计与制备

以下实验的总体目标是基于组合方法构建一种电子舌，并利用表面等离子体共振成像技术进行蛋白质分析。该目标通过使用乳糖和硫酸化乳糖作为基本单元，将其混合物沉积在棱镜的金膜表面，实现自组装，从而形成一组具有交叉反应性的组合受体阵列来实现。第二步应用表面等离子体共振成像技术，可实时监测结合事件，生成表面等离子体共振图像以及一系列称为传感图的动态结合曲线。接下来，基于传感器图谱，利用数学计算软件进行数据处理，以生成每个样品的二维连续演化图谱和三维连续演化景观。结果表明，电子舌能够为常见的纯化蛋白质生成 distinct 的三维连续演化景观，并可通过模式识别有效区分这些蛋白质。该技术相较于经典方法、电子感知及其他电子舌技术具有一些优势。首先，单一传感器的制备过程大大简化。通过混合少量分子，可以选择出具有高度多样性的交叉反应受体。其次，由于采用了组合式方法，我们的电子舌所产生的识别模式可被视为连续性的，从而更容易识别异常信号。因此，可以获得更可靠的分析结果，以制备组合式交叉反应受体阵列。首先，在使用前48小时，使用等离子清洗机在75%氧气、25%氩气、0.6毫巴压力和40瓦功率条件下对棱镜的金表面进行三分钟的清洗。然后配制100毫升含有10%甘油的磷酸盐缓冲液（PBSG）。在PBS中添加甘油对于减少溶剂蒸发以及沉积后构筑单元（BBB）浓度的变化至关重要。然后，从储备液中配制乳糖或构筑单元一以及硫酸化乳糖或构筑单元二的储备溶液。配制11种纯溶液和混合溶液，其比例以10%为增量，从0%到100%，每种溶液中构筑单元的总浓度为0.1毫摩尔，在PBSG中使用非接触式点样仪将这些纯溶液和混合溶液各取八纳升，以四重复方式点样于棱镜表面，每种比例共点44个点。将棱镜置于含有1毫升超纯水的培养皿中，在室温下静置过夜，使构筑单元一和构筑单元二在金表面自组装。本文假设混合自组装单分子层的平均表面组成反映了沉积混合溶液的组成。第二天，在氩气流下干燥前，用超纯水彻底清洗棱镜。将表面等离子体共振成像装置所在的培养箱温度设置为25摄氏度，以避免蛋白质检测过程中因温度变化引起的折射率改变。将一个未经功能化的清洗棱镜插入与计算机控制的注射泵、干燥器及六通中压进样阀相连的10微升聚醚醚酮流通池中。用新过滤并脱气的运行缓冲液填充流路系统。取下清洗用棱镜，插入含有组合交叉反应受体阵列的棱镜，并将流路池置于流速为100微升/分钟的条件下运行。借助CCD相机，通过通入运行缓冲液清除棱镜表面存在的任何气泡。通过使用芯片阵列的高对比度图像，并利用表面等离子共振成像系统中的集成软件，以相同直径画出每个位点的感兴趣区域圆形，从而快速定义每个位点的研究区域；随后追踪代表各点反射率随入射角变化的反射率曲线。选择工作角，即在反射率曲线斜率最大的位置处进行动力学曲线记录。旋转扫描镜以固定选定的工作角，用于动力学测量。继续让样品流经

electronic-tongue-generating-continuous-recognition-patterns-for

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科研

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Bioengineering

生物工程

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