激光捕获显微切割 - 个人多巴胺神经元的分离和整个腹侧被盖区的示范

个别的多巴胺神经元的分离或用直接或间接的免疫组织化学的腹侧被盖区，使用激光捕获显微切割证实。对于使用红外激光从玻璃载片隔离的组织，并从用红外和紫外激光的组合膜载玻片参数进行了讨论。

该程序的总体目标是从载玻片上的组织切片中分离多巴胺神经元。这是通过首先将冷冻的腹侧中脑组织切片到程式化载玻片或笔膜载玻片上来实现的。接下来，用快速荧光免疫组织化学标记多巴胺神经元。

然后将组织脱水并加载到激光捕获显微镜中。然后使用红外激光将标记的多巴胺神经元连接到 LCM 帽上，并分离出感兴趣的 RNA 或分子。结果表明，使用激光捕获显微镜可以获得足够数量和质量的 RNA 用于定量 PCR 测量。

与现有方法（如大体解剖或微穿孔）相比，该技术的主要优点是单个细胞群可以是孤立的或非常离散的大脑区域。为了准备 RNA 分离浸渍，将塞林制备载玻片或聚甲基化聚乙烯或笔膜载玻片放入去污溶液中，并使用不含 RNA 的水洗涤 3 次，使用一系列分级的不含 RNA 的乙醇，将载玻片脱水并用低温恒温器真空干燥 30 分钟，切下 10 微米厚的组织切片，并安装在制备的 RNA 上。游离玻片在切片过程中使样品保持冷冻，以保持 RNA 质量。

接下来进行免疫组化。使用疏水笔勾勒组织轮廓，让它们干燥，然后在一对一的丙酮甲醇溶液中干燥。将组织在零下 20 摄氏度下固定 10 分钟从冰箱中取出组织后，用 100 至 200 微升酪氨酸羟化酶抗体 NPBS 和 1%tritton 覆盖切片 10 分钟。

然后使用含 1% tritton 的 PBS 冲洗玻片，然后用 100 至 200 μL 山羊抗兔 IgG（用 Alexa Fluor 4 88 标记）覆盖切片，孵育 5 分钟，然后使用 PBS 冲洗玻片两次。接下来，将样品整合的无 RNA 乙醇系列脱水 30 秒，每个样品如本视频前面所示。在二甲苯中孵育 1 分钟零 1 秒，洗涤 5 分钟。

用于 LCM 之前立即取出载玻片，并让它们风干。加载 LCM 帽和载玻片并根据文本协议设置 LCM 系统后，调整并瞄准红外激光捕获的强度。将帽放在捕获激光工具栏上远离组织的载玻片区域。

选择 enable，调整激光的功率脉冲和命中次数。当盖子覆盖在玻片上没有组织的一部分时，点燃红外激光器，并检查激光是否充分熔化了 LCM 盖膜。调整 IR 激光强度后，右键单击并选择 Capture laser（捕获激光）以对准激光，以对 cline prep 载玻片上的单个多巴胺神经元执行 LCM。

首先移动到感兴趣的区域以捕获细胞，以捕获 cline 制备侧的单个细胞。在显微解剖工具栏中，选择 LCM 选项卡，然后选择单点图标。接下来，在显微镜工具栏中，使用快门选项卡在荧光和明场之间切换，使用荧光滤光片选项卡选择合适的滤光片，并使用物镜选项卡更改放大倍率。

一旦感兴趣的单元格在实时视频窗口中可见，请将用于标记感兴趣单元格的光斑大小调整为单元格的近似大小。通过选择单点图标，然后单击单元格来标记感兴趣的单元格。在显微切割工具栏上标记细胞后，选择 go cut and capture 选项卡，红外激光将自动向所有选定的标记细胞发射。

将盖子从切片上移到载玻片的开放区域，以检查细胞是否被捕获到 LCM 帽上。完成组织收集后，右键单击盖子并选择移动，然后按照文本协议中的概述卸载来移动盖子，使用用于免疫组织化学处理的载玻片作为指南，从笔膜上的组织中选择感兴趣的区域。在显微解剖工具栏中，选择切割和捕获选项卡，然后选择切割线选项卡，并使用免疫组织化学标记的载玻片作为指导，在 10 x 物镜下勾勒出感兴趣的区域。

如前所述，测试、发射和瞄准红外和紫外激光器。在此视频中，在显微解剖工具栏中，选择 go capture and cut（开始捕获和剪切）选项卡。然后将 LCM 帽从组织上移开，以确定组织是否从切片中取出并连接到帽上。

收集完组织以取下盖子后，右键单击盖子并选择移动，然后卸载显微照片，这些图表明 LCM 能够使用 IR 激光或 IR 和 UV 激光分离单个酪氨酸羟化酶免疫反应性多巴胺神经元，因为使用 LCM 分离的组织中细胞的最常见用途是 RNA 分析。所提出的程序经过优化以保持 RNA 完整性，如 RRNA 28 S 峰与 18 S 峰相比高度相对降低，免疫组织化学后完整性较低的 LCM 样品中的 RNA 质量降低，然后与全脑 RNA 相比，丙酮固定。为了测量从通过 L-C-M-R-N-A 从盐水制备腹侧蓝绿色区域的多巴胺神经元获得的神经元中获得的 RNA 的数量，根据标准曲线分离载玻片，分别从 5、100 和 200 个多巴胺神经元中分离出总计 17.3、24.8 和 50.9 皮克/微升。

E 使用 QPCR 测量 RNA 质量，将来自多巴胺神经元的全脑 RNA 和 RNA 的浓度范围反向转录，并从这些测量中测量 β 肌动蛋白基因，分别从 5、100 和 200 个多巴胺神经元中计算出 55、6、0.82 和 20 点 58 皮克/微升的浓度。看完这个视频，你应该对如何使用激光捕捉显微镜来分离单个多巴胺神经元或分离多巴胺神经元的区域有了很好的了解。