激光捕获显微切割——分离单个多巴胺能神经元及完整腹侧被盖区的示范操作

本实验的总体目标是从载玻片上的组织切片中分离多巴胺能神经元。首先将冷冻的腹侧中脑组织切片贴附到定制载玻片或膜切割载玻片上，随后通过快速荧光免疫组织化学方法对多巴胺能神经元进行标记。

然后对组织进行脱水处理，并装载到激光显微切割系统中。接着，利用红外激光将标记的多巴胺能神经元附着到LCM帽上，进而分离出目标RNA或分子。结果表明，通过激光显微切割技术可获得足量且高质量的RNA，适用于定量PCR检测。

与现有的方法（如大体解剖或显微打孔）相比，该技术的主要优势在于能够分离特定的单个细胞群体或非常精细的脑区。为准备用于RNA分离的切片，将硅烷化预处理载玻片或聚乙烯醇缩甲醛膜载玻片浸入去污染溶液中，并使用无RNA酶的水清洗三次，再用梯度浓度的无RNA酶乙醇对载玻片进行脱水处理，随后在真空条件下干燥30分钟。使用冷冻切片机切割厚度为10微米的组织切片，并将其贴附于预先处理好的无RNA酶载玻片上。在切片过程中始终保持样品处于冷冻状态，以保证RNA的质量。

接下来进行免疫组织化学操作。使用疏水性画笔勾勒出组织轮廓，待其干燥后，用1:1的丙酮-甲醇溶液固定组织，在负20摄氏度下固定10分钟。从冷冻箱中取出组织后，向切片上覆盖100至200微升的酪氨酸羟化酶抗体NPBS溶液，并加入1% Triton，孵育10分钟。

然后使用含1% Triton的PBS冲洗载玻片，再在切片上覆盖100至200微升Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG，孵育5分钟，随后用PBS冲洗载玻片两次。接着，将样品依次浸入无RNA酶的乙醇中脱水，每次30秒，操作方式如本视频前面所示。在二甲苯中孵育1分10秒，再洗涤5分钟。

在使用激光显微切割（LCM）前立即取出载玻片，使其自然风干。在按照文本方案将LCM帽和载玻片装入并设置好LCM系统后，调节并调整红外激光捕获的强度。将帽放置在载玻片上远离组织的区域，位于捕获激光工具栏的指定位置。

选择启用，调节激光的脉冲功率和击打次数。当帽盖位于载玻片无组织区域时，发射红外激光，并检查激光是否足以熔化LCM帽膜。调整红外激光强度后，单击右键，选择“捕获激光已就位”，以准确定位激光，从而从cline制备载玻片上分离单个多巴胺能神经元。

首先移动到目标区域，以从梯度预处理侧捕获单个细胞。在显微切割工具栏中，选择 LCM 选项卡，然后选择单点图标。接着在显微镜工具栏中，使用快门选项卡在荧光和明场之间切换，通过荧光滤光片选项卡选择合适的滤光片，并使用物镜选项卡切换放大倍数。

当在实时视频窗口中可见目标细胞时，调整用于标记目标细胞的光斑大小，使其与细胞的大小大致相同。通过选择单点图标，然后单击目标细胞来标记细胞。当细胞在显微切割工具栏上被标记后，选择“开始切割与捕获”选项卡，红外激光将自动对所有已标记的细胞进行照射。

将帽移离切片区，移至载玻片的空白区域，以检查细胞是否已捕获到激光捕获显微切割（LCM）帽上。完成组织收集后，通过右键单击帽并选择“移动至”然后选择“卸载”，具体操作如文本方案中所述；使用经免疫组织化学处理的载玻片作为参考，以确定笔膜上组织的目标区域。在显微切割工具栏中，选择“切割与捕获”选项卡，然后选择“切割线”选项卡，并以免疫组织化学标记的载玻片为指导，在10倍物镜下勾画出目标区域。

按照之前演示的方法测试、点燃并瞄准红外和紫外激光。在本视频中，在显微切割工具栏中选择“开始捕获和切割”选项卡。然后将LCM帽从组织上移开，以确定组织是否已从切片上移除并附着到帽上。

完成组织采集后，如需移除帽盖，可右键单击帽盖并选择“移动至”，然后卸载显微图像。这些图中的显微图像表明，激光捕获显微切割技术（LCM）能够利用红外激光或红外与紫外激光组合，分离出单个酪氨酸羟化酶免疫反应性多巴胺能神经元。由于LCM分离的组织细胞最常见的用途是RNA分析，因此所展示的实验步骤已优化，以保持RNA的完整性；这一点可通过28S rRNA峰相对于18S rRNA峰的高度相对降低来判断。与全脑RNA相比，经过免疫组织化学染色后再进行丙酮固定的LCM样本，其RNA质量有所下降。为了测定通过L-C-M-R-N-A从腹侧被盖区多巴胺能神经元获取的RNA数量，根据标准曲线对生理盐水处理组切片进行RNA定量分析，结果显示，分别从5、100和200个多巴胺能神经元中分离得到17.3、24.8和50.9皮克/微升的RNA。

采用qPCR检测RNA质量时，将不同浓度的全脑RNA和多巴胺能神经元RNA进行逆转录，并检测β-肌动蛋白基因。根据实验结果，分别从5、100和200个多巴胺能神经元中计算出RNA浓度为3.55、60.82和20.58皮克/微升。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用激光显微切割技术来分离单个多巴胺能神经元，或分离多巴胺能神经元的特定区域。