径向移动性和逆转录病毒复制的载体转导，非粘附Alloresponsive T细胞的杀伤功能

以下实验的总体目标是显示非贴壁效应 T 淋巴细胞在单层贴壁肿瘤细胞上的迁移。这是通过首先在聚 D 赖氨酸包被的特氟龙掩蔽载玻片的孔中建立单层贴壁肿瘤细胞来实现的，作为第二步荧光标记的效应器，T 淋巴细胞使用细胞沉降歧管沉降到单层的中心。Next Light 和荧光显微镜用于可视化非贴壁细胞在单层上的迁移。

结果表明，在用逆转录病毒载体转导淋巴细胞后，非贴壁 T 淋巴细胞在与贴壁肿瘤细胞单层共培养中的迁移和效应功能得以维持。与现有方法相比，该技术的主要优点是可以在具有贴壁肿瘤细胞的煤培养物中测量非贴壁效应器 T 淋巴细胞的径向迁移。这对原发性或转移性脑肿瘤患者具有深远的影响，因为经修饰以表达促药物激活基因（如胞嘧啶脱氨酶）的同种异体细胞毒性 T 淋巴细胞正在作为消除大脑肿瘤的多模式方法进行测试。

通常，由于肿瘤细胞生长在粘附特性上的异质性，刚接触这种方法的个体将难以建立贴壁肿瘤细胞单层。该方法的视觉演示至关重要，因为产生均匀肿瘤单层和非粘附 L-O-C-T-L 的步骤需要对两种细胞类型的特征有丰富的经验了解。首先放置最多 4 个消毒。

10 孔特氟龙涂层载玻片，装在 150 毫米 x 15 毫米无菌培养皿中。在载玻片旁边放置一个 35 毫米 x 10 毫米的培养皿，其中装有 2 到 3 毫升无菌水，以提供湿度。接下来，用每毫升 100 μg 的聚 D 赖氨酸或聚 L 赖氨酸溶液覆盖每个孔，对载玻片进行预处理。

将玻片在室温下孵育 1 小时，然后吸出溶液，并在制备样品孔的情况下用 PBS 冲洗孔表面两次。收获贴壁肿瘤细胞的汇合瓶。通过光学显微镜计数活细胞的数量，然后以 5 倍 10 至每毫升 6 个细胞的浓度悬浮细胞。

在缓冲生长培养基中，根据肿瘤细胞类型，向每个孔中加入 5 至 10 微升细胞悬液，用培养基将孔的体积增加到 40 微升，然后缓慢上下移液以均匀分布细胞。接种孔后，让肿瘤细胞在室温下沉淀 30 分钟。然后盖上培养皿的盖子，小心地将其转移到 37 摄氏度的加湿培养箱中，用 5% 二氧化碳孵育至少 24 小时。

每天更换孔上的培养基，小心地从单层中取出一些培养基，并用更大体积的新鲜完全 T 细胞培养基代替。细胞通常会在 1 到 3 天内汇合，以准备细胞沉淀到肿瘤细胞单层上。收获非贴壁 T 细胞，并根据制造商的方案在测定前至少一小时用细胞增殖染料标记它们。

接下来，将包含肿瘤细胞载玻片的加湿室放入生物安全柜中。通过移液用 PBS 洗涤孔，然后向孔中加入 45 微升含 10% 血清的完全培养基。将灭菌的细胞沉降歧管滑过孔，直到歧管末端的钩子接触到载玻片底部。

确保介质在歧管通道中可见。然后计数非贴壁细胞，并以 10 到 5 倍的 1 到 2 倍悬浮它们。培养基中每 μL 的细胞数。

轻轻破坏细胞以消除任何会干扰细胞沉淀的细胞簇。将 1 微升细胞悬液缓慢移液到每个细胞歧管的通道中。然后将设备在室温下孵育 20 至 30 分钟，以使通道中的细胞沉淀在单层细胞上。

细胞沉淀后，轻轻地将歧管笔直向上提起，不要接触载玻片。确保细胞沉淀已位于歧管通道的圆周内。使用显微镜，坐着的细胞应略微粘附在单层上，以便轻轻移动载玻片不会分散沉淀。

确认细胞已沉淀后，将载玻片转移到配备有二氧化碳和湿度室的倒置显微镜中。使用 4 x 物镜对细胞进行明场和多通道荧光成像。在明场和荧光通道中采集给定区域的图像，然后使用图像捕获软件添加微米棒。

获取所有时间点后，将载玻片存放在时间点之间的加湿培养箱中。将图像文件拖放到图像编辑程序中，然后选择添加图层选项以创建具有多个图层的图像文件。将光照和荧光图像合并为一个图层。

使用采集软件拍摄 8 毫米 x 8 毫米区域的照片。该软件应设置为使用在整个孔中最好表示的通道自动将捕获的图像拼接在一起。如果仅对荧光通道进行成像，则应为贴壁细胞成像的通道。

或者，可以使用图像编辑软件拼接图像。这是通过将图像中保存的区域从一个图像对齐到另一个图像并将图像相互叠加直到生成完整图片来完成的。使用图像软件将图像拼接在一起。

使用组合图像制作表面强度荧光图，并使用 Image J 软件可视化荧光 T 细胞聚集或随时间扩散。人同种异体反应细胞毒性 T 淋巴细胞（称为 Allo CTL）转导，编码翠绿色荧光蛋白表达基因的具有复制能力的逆转录病毒载体位于单层神经胶质瘤细胞的中心。4 小时后，所有 OCTL 在 24 小时内都形成了可见的聚集体。

贴壁细胞单层中出现空斑块，表明肿瘤细胞裂解，一些同种异体 CTL 已迁移到前缘之外。荧光标记的小鼠 Allo CTL 在一小时时位于流感荧光标记的神经胶质瘤细胞单层的中心 Allo CTL 与 神经胶质瘤细胞密切相关 48 小时，Allo CTL 已从单层表面强度的中心迁移。使用 Image J 软件从这些图像生成荧光图，并显示 48 小时后大量从中心迁移。

每天更换肿瘤细胞单层的培养基以维持健康的培养条件非常重要。此外，一旦掌握，非贴壁细胞的沉降大约需要 20 分钟。遵循此程序。其他方法（如细胞路径追踪）可用于回答有关 allo CTL 跨单层迁移的速率或它们与执行细胞毒性功能的肿瘤细胞接触的时间的问题。

该方案将帮助免疫基因治疗领域的研究人员探索基因修饰的 T 淋巴细胞在与肿瘤细胞共培养中的迁移。观看此视频后，您应该对如何在每次共培养物中制备非贴壁细胞和贴壁细胞以及如何使用细胞沉降歧管研究非贴壁细胞在肿瘤细胞单层上的水平径向迁移有很好的了解。