逆转录病毒复制载体转导的非黏附性同种反应性T淋巴细胞的径向迁移能力与细胞毒性功能

以下实验的总体目标是展示非黏附性效应T淋巴细胞在黏附性肿瘤细胞单层上的迁移过程。该实验首先在聚D-赖氨酸包被的特氟龙掩膜载玻片的孔中建立一层黏附性肿瘤细胞单层；第二步，将荧光标记的效应T淋巴细胞通过细胞沉降装置沉降到单层细胞中央；随后利用明场与荧光显微镜观察非黏附细胞在单层细胞上的迁移行为。

实验结果表明，在与贴壁肿瘤细胞单层共培养的条件下，经逆转录病毒载体转导后的非贴壁T淋巴细胞仍能维持其迁移能力和效应功能。该技术相较于现有方法的主要优势在于，可在与贴壁肿瘤细胞共培养体系中定量测定非贴壁效应T淋巴细胞的径向迁移能力。这一发现对于原发性或转移性脑肿瘤患者具有深远意义，因为目前正将经基因修饰以表达前药激活酶（如胞嘧啶脱氨酶）的同种异体细胞毒性T淋巴细胞，作为一种多模式联合疗法用于清除脑内肿瘤的探索性研究。

通常，初次使用该方法的研究人员会因肿瘤细胞在贴壁特性上的生长异质性，而在建立贴壁肿瘤细胞单层时遇到困难。本方法的可视化演示至关重要，因为要获得均匀的肿瘤单层以及有效沉淀非贴壁的 L-O-C-T-L 细胞，需要对这两类细胞的特性具备熟练的经验性理解。开始时，可放入最多四个已灭菌的。

在无菌的150毫米×15毫米培养皿中放置10孔特氟龙涂层载玻片。在载玻片旁放置一个35毫米×10毫米的培养皿，内含2至3毫升无菌水，以提供湿度。接下来，通过在每个孔中加入100微克/毫升的聚D赖氨酸或多聚L赖氨酸溶液，对载玻片进行预包被。

将切片在室温下孵育一小时，然后吸除溶液，并用PBS冲洗孔表面两次（样本孔已预先准备好）。收集一个融合生长的贴壁肿瘤细胞培养瓶中的细胞。通过光学显微镜计数活细胞数量，然后将细胞重悬于浓度为每毫升5×10⁶个细胞的溶液中。

在缓冲生长培养基中，根据肿瘤细胞类型，向每个孔中加入 5 至 10 微升细胞悬液，再用培养基将孔内液体体积补至 40 微升，缓慢吹打混匀，使细胞均匀分布。接种完成后，将培养板置于室温下静置 30 分钟，使肿瘤细胞沉降。随后盖上培养皿盖子，小心转移至含 5% 二氧化碳的 37 摄氏度恒温湿化培养箱中，培养至少 24 小时。

每天更换培养孔中的培养基，小心移除单层细胞中的部分培养基，并加入更大体积的新鲜完全T细胞培养基。通常在1至3天内细胞将生长至融合，以备后续沉降至肿瘤细胞单层上。在进行检测前至少一小时，收集非贴壁的T细胞，并根据制造商说明书用细胞增殖染料进行标记。

接下来，将装有肿瘤细胞玻片的湿化 chamber 置于生物安全柜中。用移液枪吸取 PBS 清洗各孔，然后向各孔中加入 45 µL 含 10% 血清的完全培养基。将一个已灭菌的细胞沉降 manifold 缓慢滑过各孔，直至 manifold 末端的钩子接触玻片底部。

确保培养基在灌注通道中可见。然后计数非贴壁细胞，并将其悬浮于培养基中，浓度为每微升含一至二乘以十的五次方个细胞。

轻柔地重悬细胞，以消除可能干扰细胞沉降的细胞团块。将一微升细胞悬液缓慢移入多通道装置的每个通道中，然后将装置在室温下孵育20至30分钟，使通道中的细胞沉降到单层细胞上。

待细胞沉降后，轻轻垂直提起多通道装置，切勿触碰玻片。确保细胞沉淀已位于多通道装置通道的范围内。在显微镜下观察，已沉降的细胞应轻微贴附于单层细胞上，轻移玻片时不会使沉淀散开。

确认细胞已沉降后，将载玻片转移至配备二氧化碳和湿度培养室的倒置显微镜上。使用4倍物镜对细胞进行明场和多通道荧光成像。在明场和荧光通道中采集特定区域的图像，然后通过图像采集软件添加微米标尺。

在获取所有时间点的数据后，将载玻片存放在加湿的培养箱中。将图像文件拖放到图像编辑程序中，并选择添加图层选项，以创建具有多个图层的图像文件。将明场图像和荧光图像合并到一个图层中。

使用采集软件拍摄一个8毫米×8毫米区域的图像。软件应设置为自动拼接所捕获的图像，拼接时应选择在整个孔内代表性最好的通道。如果仅拍摄荧光通道，则应使用用于成像贴壁细胞的通道。

或者，可以使用图像编辑软件进行图像拼接。该过程通过将各图像之间保持不变的区域对齐，并将图像相互叠加，直至生成一幅完整的图像。使用图像软件将这些图像拼接在一起。

使用组合图像，通过 Image J 软件生成表面荧光强度图，以可视化随时间推移的荧光 T 细胞聚集或扩散情况。已知的人类同种反应性细胞毒性 T 淋巴细胞（Allo CTL）经转导，携带编码翡翠绿色荧光蛋白表达基因的复制型逆转录病毒载体，并将其置于胶质瘤细胞单层的中央。4 小时后，Allo CTL 在 24 小时内已形成可见的聚集体。

贴壁细胞单层中出现空斑，表明肿瘤细胞发生裂解，且部分同种异体细胞毒性T淋巴细胞（allo CTL）已迁移至边缘以外。在1小时时，荧光标记的小鼠同种异体CTL位于荧光标记胶质瘤细胞单层的中央；至48小时时，同种异体CTL与胶质瘤细胞紧密接触，并已从单层表面中央区域迁移出去。通过ImageJ软件对这些图像生成荧光分布图，显示48小时后细胞已显著从中心区域迁移扩散。

为了维持肿瘤细胞单层培养的健康状态，每天更换培养基非常重要。此外，掌握该操作后，非贴壁细胞的沉降时间应约为 20 分钟。还可采用其他方法，例如细胞轨迹追踪，以研究异体 CTL 穿越单层的速率，或其与肿瘤细胞接触并执行细胞毒性功能所持续的时间。

本方案将帮助免疫基因治疗领域的研究人员探索基因修饰的T淋巴细胞在与肿瘤细胞共培养时的迁移行为。观看本视频后，您应能充分掌握如何制备用于共培养的非贴壁细胞和贴壁细胞，以及如何利用细胞沉降装置研究非贴壁细胞在肿瘤细胞单层上的水平径向迁移。