成年转基因斑马鱼视网膜外植体培养由多光子显微镜活细胞成像

斑马鱼视网膜再生大多被使用固定的视网膜研究。然而，再生反应过程中发生的动态过程，如interkinetic核迁移，并需要活细胞成像研究的基本机制。这里，我们描述培养和成像条件下，使用多光子显微术来监控Interkinetic核迁移（INM）的实时性。

该分离程序的总体目标是对受损斑马鱼视网膜外植体培养物中正在经历动力学间核迁移的增殖细胞进行活细胞成像。这种方法可以回答视网膜再生中的关键问题，例如哪些机制驱动动间核迁移，或者肾祖细胞中的穆勒胶质细胞动态核迁移是否受到类似的调节。该技术的主要优点是可以监测再生过程中经历动力学间核迁移的增殖细胞的动态行为，从而允许研究细胞周期阶段特异性机制。

虽然这种方法可以提供对动力学间核迁移的见解，但它也可以应用于其他视网膜研究领域，例如研究小胶质细胞行为或垂死神经元的 Muller 神经胶质细胞吞噬作用。通过将斑马鱼转移到干纸巾上来开始此过程。然后，用一对弯曲的镊子取出一只眼睛，并将其转移到荧光盘上。

在立体显微镜下，调整眼睛的方向，使瞳孔面向 FluoroDish 的盖玻片，以便可以看到眼睛后部的视神经。然后，尽可能靠近眼睛后部切除视神经。此外，去除眼睛外的结缔组织。

用一把镊子将眼睛夹在鼻侧和颞侧之间，同时用一把剪刀刀片刺穿筛板，沿着眼睛的鼻侧和颞侧切割，在视镜上切开。接下来，将视网膜的背侧和腹侧拉开。用一对镊子从视网膜背侧去除巩膜，同时用第二对镊子握住连接到视网膜的晶状体。

之后，在不损坏视网膜的情况下去除晶状体和玻璃体。然后，使神经节细胞层面向 FluoroDish 的盖玻片，使视网膜变平。然后，用 10 微升 1% 低熔点琼脂糖包围视网膜。

确保视网膜没有被液体琼脂糖抬起，因为即使是轻微的升高也可能影响通过组织聚焦的能力。如果观察到隆起，请使用移液管去除琼脂糖。琼脂糖不能将组织从盖玻片上提起，这一点至关重要，因为这会降低获得高质量图像的能力。

重复此过程数次，然后加入 1% 低熔点琼脂糖以覆盖整个荧光培养皿。琼脂糖凝固后，向组织中加入 1.5 mL 培养基。在图像采集软件中，打开 A1 MP GUI TI 垫、A1 紧凑型 GUI 和 ND 采集窗口。

对于多光子成像，请确保在 A1 紧凑的 GUI 窗口中选择了 IRNDD 选项。然后，在设置字段中，为第一个二向色镜选择 IRDM，并检查带通滤光片是否设置为 525 到 50 以获取 GFP 荧光。接下来，在 A1 MP GUI 窗口中打开红外激光器。

激光器需要几分钟时间才能准备就绪。之后，将波长设置为 910 纳米以激发 GFP 荧光并通过单击自动对准按钮对准激光器。将视网膜培养物置于多光子显微镜载物台上后，确保在打开快门之前关闭房间和设备灯，以避免光电倍增管过度曝光。

为了降低噪音水平，请将显微镜放在黑暗的环境中。以 2 倍的变焦获取 300 x 300 像素的视野图像，该变焦在扫描区域窗口中设置，并在 A1 紧凑型 GUI 窗口中选择每个像素 4.8 微秒的像素停留时间。通过更改 A1 MP GUI 窗口中的采集区域和 A1 紧凑型 GUI 窗口中的增益来粗略设置激光功率。

现在，专注于神经节细胞层，并在 ND 采集窗口的 z 子窗口中设置 z 堆栈的顶部焦平面。将焦平面穿过外核层的水平，其特征是存在模糊标记的 GFAP 和 GFP 阳性细胞，这些细胞是圆形的，相对于内核层中的对应细胞来说更大。将此平面设置为 z 堆栈的底部。

接下来，将 z 步长设置为 0.7 到 1 微米之间。要设置 z 强度校正，请打开 z 强度校正窗口，然后从 ND 中选择以设置 z 堆栈范围。然后，单击 z 强度校正窗口中的底部焦平面并设置激光强度和增益。

然后，单击 z 强度校正窗口中 z 值旁边的箭头，以确认随后显示在所选焦平面的 z 强度校正窗口中的设备设置下的设置。对中间和顶部平面重复该过程，增加激光功率和增益。在 A1 MP GUI 窗口中设置采集区域，并避免在成像开始时选择大于 15 的采集区域和高于 126 的增益，以避免照片漂白和增加的噪点水平。

随后，在 z 强度校正窗口中选择相对强度校正。在 ND 采集窗口的时间序列子窗口中，将持续时间设置为 8 小时，并将间隔设置为无延迟。然后，单击 ND 采集窗口的 z 堆栈子窗口中的 run z 校正以获取 3D 时间序列。

在此过程中，裁剪包含分裂 GFAP 和 GFP 阳性细胞核的区域。选择一个裁剪区域，该区域包含至少一个未经历 INM 的细胞核，以便设置一个参考点，以随后测量分裂细胞核相对于基础 INL 迁移的距离。它有助于准备 3D 重建。

使用 show slices view 功能，生成正交投影。随后，将模式从 slice 更改为 maximum intensity projection。然后，关闭正交最大投影的 XY 视图。

根据迁移和分裂核心最明显的方向，还可以关闭 XZ 或 YZ 视图。用鼠标右键单击剩余的图像，然后使用从此视图创建新文档功能提取 XZ 或 YZ 图像系列。如有必要，请旋转图像。

使用手动测量功能，在细胞核底部的图像上画一条水平线，该线保留在基础 INL 中，不进行 INM。使用分析软件中的线测量工具测量时间序列的参考线与迁移核基点之间的距离。此处显示的是视网膜外植体的 z 堆栈图像系列在多光子显微镜采集的延时记录的不同时间点的最大 YZ 投影。

使用手动测量功能下的线条工具，在星号指示的参考池的水平上放置一条水平线。垂直测量线从水平线开始定位，并延伸到迁移的 GF AP 和 GFP 阳性核的基础位置。在多光子延时记录中测得的细胞 F0 在顶端迁移的距离，以及产生的子细胞 D1 和 D2 在基础上迁移的距离。

红线表示计算顶端迁移速度的测量值，而黑线和灰线表示分别用于计算 D1 和 D2 的基础迁移速度的测量值。将核膜破裂前顶端迁移的距离与时间本身作图，以及子细胞 D1 的快速基底迁移阶段。一旦掌握，如果作得当，可以在 60 到 90 分钟内完成从三条鱼中分离视网膜。此时间不包括准备步骤。

在尝试此程序时，重要的是要记住尽快工作以确保视网膜外植体的活力。将视网膜尽可能平放以能够在更深的组织层中成像也很重要。观看此视频后，您应该对如何分离和安装斑马鱼视网膜、进行活细胞成像以监测动力学间核迁移和确定迁移速度有很好的了解。